技术领域
本发明涉及ANGPTL4抑制剂如反义寡核苷酸，和包含这种抑制剂的药物组合物及其用于治疗心血管疾病、肥胖症、II型糖尿病、纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)或者血脂异常的用途。
背景技术
血脂紊乱是心血管代谢疾病中熟知的风险因素。自80年代中期起，已提供了对于LDL-胆固醇升高的成功治疗，并且在随后的数十年，关注点朝着其它脂类，如HDL-胆固醇和甘油三酯的方向扩展。流行病学研究已揭示血浆甘油三酯(TG)的升高以及相伴的残余胆固醇是冠心病的独立风险因素(Cullen,2000)。此外，高甘油三酯血症(HTG)是代谢综合征(MS)的标志并且通常伴随着肥胖症和胰岛素抵抗(Reaven,1995)。2型糖尿病和与代谢综合征以及HTG有关的心血管疾病(CVD)的高风险表明维持血浆TG体内平衡是非常期望的。
重度高甘油三酯血症患者还可以出现胰腺炎(Athyros,2002)，特别是当TG水平大于1000-1500mg/dl时(Tsuang,2009)。目前已知多至40种不同的基因调节血浆TG(Johansen,2011)，但仅有几种单基因病症已知显著提高TG(Nordestgaard and Varbo,2014)。这些包括以下更详细地描述的FCS。
脂解是在心脏、骨骼肌和脂肪组织的毛细血管腔表面上进行的TG-富集的脂蛋白清除的主要步骤。肌肉和脂肪细胞中合成的LPL移位至毛细血管内皮细胞。脂蛋白脂肪酶(LPL)(负责脂蛋白上TG水解的主要酶)中的罕见遗传缺陷(Benlian,1996)可以导致其特征为血浆TG水平大大高于>10mmol的家族性乳糜血综合征(FCS)。脱脂蛋白C-II(apoC-II)(LPL的关键蛋白激活子)中的纯合缺陷也可以导致类似的高甘油三酯血症表型(Breckenridge,1978)。最近，还描述了将LPL连接至内皮细胞表面的蛋白GPIHBP1中的缺陷(Beigneux,2007)和脱脂蛋白A-V(ApoA-V)中的突变(Ishihara,2005)在人中造成高甘油三酯血症。还发现脂肪酶特异性侣伴蛋白LMF1中的遗传缺陷促进FCS。总体上，约2-3:1 000000位患者患有FCS。
不仅LPL激活因子影响LPL系统；已显示LPL负调节剂，如apoC3和ANGPTL4、ANGPTL3或ANGPTL8中的功能丧失突变促进了良好的血浆脂质谱和代谢疾病降低的风险。ANGPTL4是不同的脂肪酶，并且具体地LPL的调节剂。所述蛋白是去折叠的侣伴蛋白，作为不可逆事件，它将LPL的二聚体催化活性形式破坏成非活性的单体。与例如从脂质底物替换LPL的apoC3相比，ANGPTL是唯一已知的以这种方式调节LPL的因子。另外，ANGPTL4影响肝脏脂肪酶和内皮脂肪酶，因此不仅影响血浆脂质的TG部分，而且还影响LDL-c和HDL-c。ANGPTL4是也通过肝脏表达的禁食引起的因子，但是在一定程度上也通过脂肪组织和骨骼肌表达，即ANGPTL4是普遍表达的。通过不同的刺激调节ANGPTL4的表达；例如，它在肝脏中分别通过过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)α、PPARδ和糖皮质激素受体(GR)引起。对于这些ANGPTL具有缺陷的动物模型显示出提高的LPL活性和降低的血浆脂质，并且具有人变体的转基因过表达的小鼠显示出相反情况。通过人缺陷和功能丧失突变支持了来自动物研究的发现，其将ANGPTL4与血浆TG水平和HDL-c相关联。ANGPTL4基因显示了与心血管代谢疾病的联系。
因此，迄今为止的信息提供了对LPL、GPIHBP1、ANGPTL和apoA-V在血浆TG体内平衡中的协同活性的新的理解。在这些因素中，有趣地，ANGPTL4还调节血浆胆固醇水平，即LDL-c、HDL-c和残粒-c而不完全依赖于LDL-受体，其在大多数情况下在纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)和杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)是无功能的。这为“通用”同时靶向ANGPTL4的血浆脂质药物提供了机会。
ANGPTL4调节在游离脂肪酸向肝脏的吸收中起重要作用的脂蛋白脂肪酶的活性。脂蛋白脂肪酶的调控异常可以导致细胞中脂质过量，这例如导致了肥胖症、II型糖尿病或心血管疾病。
ANGPTL4敲除小鼠显示甘油三酯(TG)水平的降低基于极低密度脂蛋白(VLDL)降解的升高和VLDL产量的降低。适度影响了胆固醇含量。具有高脂质水平的食品导致产生了ANGPTL4敲除小鼠，用单克隆抗体治疗所述小鼠由于肠组织脂肪肉芽肿病变、淋巴系统流出液和/或肠系膜淋巴结所造成的存活力降低(Desai et al.,2007PNAS)。当禁食时，对于ANGPTL4变体E40K杂合的人显示出显著较低的血浆TG水平。另外，在E40K杂合的人中高密度脂蛋白(HDL)胆固醇含量显著更高。由于高TG和低HDL胆固醇含量的组合导致高心血管疾病患病风险，因此ANGPTL4的减少或抑制可以降低所述风险。在人中存在ANGPTL4无效等位基因，但是至今尚未识别与ANGPTL4敲除小鼠相当的病变。
本发明的抑制ANGPTL4表达的寡核苷酸独立于LDL受体功能性降低例如血浆脂质水平，这例如与寡核苷酸在治疗其中LDL受体有缺陷的纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)或者杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)中的使用相关。
ANGPTL4不仅参与脂肪酸代谢调控，而且它还参与流感感染。例如，在流感肺炎期间，通过STAT3-介导的机制上调ANGPTL4，并且ANGPTL4是呼吸道感染和肺炎的潜在生物标志物(Li et al.,Cell Reports 10,Feb.2015)。
至今，尚不存在在分别降低和抑制ANGPTL4的表达中高效且与ANGPTL4 mRNA和/或前体mRNA杂交的反义寡核苷酸。使用siRNA抑制ANGPTL4表达的研究显示如果在适合的包装材料中包装siRNA，则仅体内抑制是可能的。即使包装siRNA，mRNA表达的抑制效率通常可以是未改善的。
本发明的寡核苷酸在抑制ANGPTL4表达中是非常成功的。寡核苷酸的作用方式不同于抗体或小分子的作用方式，并且寡核苷酸对于例如以下方面是特别有利的：
(i)向组织的渗透；
(ii)分别对靶标的多种功能和活性的阻断，
(iii)寡核苷酸彼此或者与抗体或小分子的组合，和
(iv)对于抗体不可接近的或不可特异性接近的或者通过小分子不可抑制的胞内作用的抑制。
发明内容
本发明涉及由包含例如12至22个核苷酸，15至20个核苷酸或者15、16、17、18、19或20个核苷酸或由其组成的寡核苷酸所组成的ANGPTL4抑制剂，其中核苷酸中的至少一个被修饰(改变，modified)。ANGPTL4寡核苷酸与例如SEQ ID NO.1的ANGPTL4(人；NM_139314)、SEQ ID NO.2的ANGPTL4(人；GRCh38_19_8364151_8374373)、SEQ ID NO.58的ANGPTL4(小鼠；NM_020581.2)和/或SEQ ID NO.59的ANGPTL4(小鼠；GRCm38:17:33773750:33781575)的核酸序列杂交，其中所述寡核苷酸抑制ANGPTL4的表达。修饰的核苷酸例如选自由以下组成的组：桥核酸(bridged nucleic acid)如LNA、cET、ENA、2'氟修饰的核苷酸、2'O-甲基修饰的核苷酸、2'O-甲氧基乙基修饰的核苷酸及其组合。
本发明的ANGPTL4寡核苷酸与例如选自以下的活性区杂交：SEQ ID NO.1的位置1732-1759(例如，A24044He，SEQ ID NO.47；A24076He，SEQ ID NO.47)和/或位置234-261(例如，A24102He，SEQ ID NO.177；A24103He，SEQ ID NO.178)和/或位置1264-1293(例如，A24110He，SEQ ID NO.185；A24111He，SEQ ID NO.186)和/或SEQ ID NO.2的位置2800-2872(例如，A24083Hi，SEQ ID NO.158；A24085Hi，SEQ ID NO.160；A24086Hi，SEQ ID NO.161；A24087Hi，SEQ ID NO.162)和/或位置3415-3442(例如，A24089Hi，SEQ ID NO.164)和/或位置4968-4994(例如，A24097Hi，SEQ ID NO.172)或其组合。例如，它以纳摩尔或微摩尔浓度抑制ANGPTL4的表达。
本发明还涉及包含本发明的ANGPTL4抑制剂和药用载体、赋形剂、稀释剂或其组合的药物组合物。所述抑制剂和所述药物组合物分别用于在防止和/或治疗其中涉及ANGPTL4失衡的病症的方法中使用。这种病症例如是心血管代谢疾病、肥胖症、糖尿病如2型糖尿病、高胆固醇血症、高甘油三酯血症(HTG)、血脂异常、胰腺炎、代谢综合征、家族性乳糜血综合征(FCS)、流感感染和/或癌症。例如，高胆固醇血症是纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)和杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)，例如，癌症是乳腺癌、肺癌、恶性黑素瘤、淋巴瘤、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰癌、睾丸癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、网状细胞肉瘤、脂肪肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、脑膜瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞肿瘤、急性和慢性粒细胞性白血病、毛细胞肿瘤、腺瘤、增生、髓样癌、肠节细胞神经瘤、胚胎性癌肉瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、子宫颈非典型增生、成视网膜细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损害、横纹肌肉瘤、卡波济氏肉瘤、骨原性肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞肿瘤、红细胞增多、腺癌、间变性星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、白血病或表皮样癌。
局部或全身施用所述ANGPTL4抑制剂或包含所述ANGPTL4抑制剂的本发明的药物组合物。
本文引用或参考的所有文档("本文中引用的文档")和本文引用的文档中引用或参考的所有文档与在本文中和在作为参考并入本文的任何文档中提及的任何产品的任何生产商的说明书、描述、产品说明书和产品页一起借此作为参考并入本文并且可以用于本发明的实践。更具体地，所有参考的文档以每个单个文档具体且单独表明作为参考并入的相同程度作为参考并入。
附图说明
图1显示了42种人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸的初始筛选。作为对照包括了对任何人或小鼠mRNA不具有序列互补性的对照寡核苷酸(Neg1；SEQ ID NO.57)。以10μM的单一浓度，用各寡核苷酸处理人上皮样宫颈癌细胞(HeLa)3天。处理开始后3天，将细胞裂解并使用QuantiGene Singleplex RNA测定确定ANGPTL4和HPRT1 mRNA水平。将HPRT1用作ANGPTL4表达归一化的管家基因。残余ANGPTL4-mRNA表达相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”)。三个重复孔，平均值+/-SD(图1)。
图2显示了人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸在SK-OV3细胞中的另一种筛选以研究残余ANGPTL4 mRNA表达。
图3显示了以10μM浓度在HeLa细胞中测试的其它人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸。4种所测试的反义寡核苷酸显示出大于50％的ANGPTL4 mRNA敲低(相当于残余mRNA水平<0.5)。
图4显示了其它ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸在SK-OV3细胞中的另一种筛选以研究残余ANGPTL4 mRNA表达。
图5显示了通过监测激活的B-细胞的核因子"κ-轻链增强子"(NF-κB)的激活用于研究人TLR9的刺激的HEK-Blue
图6显示了在HeLa和SK-OV3细胞中具有最有效的敲低(敲落，knockdown)效力的人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸A24022Hi(SEQ ID NO.25)、A24023Hi(SEQ ID NO.26)、A24071Hi(SEQ ID NO.54)和A24076He(SEQ ID NO.47)，其选择用于确定半最大抑制浓度(IC
图7显示了其它ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸(ASO)在原代肝细胞中的第1单一剂量效力筛选。将25,000个细胞/孔接种到96-孔胶原蛋白I-涂覆的平底板中并以5μM的最终浓度用各ASO处理。为了引起ANGPTL4 mRNA表达，同时用1μM PPARγ处理细胞。作为载体(vehicle)对照，用等量的DMSO处理细胞(“DMSO”)。每24h，用含有PPARγ以及5μM的各ASO或DMSO的新鲜培养基替换70μl上清液。3天后，将细胞裂解并使用QuantiGene RNASingleplex测定测量人HPRT1以及人ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因HPRT1的表达归一化。显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”(n＝42)，SD＝0.24)的残余ANGPTL4-mRNA表达。实线和虚线分别表示70％和0％的敲低效力(上图)或者空-处理细胞(设置为100的“无寡聚”(n＝42)，SD＝35.8，下图)的100％的HPRT1表达。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。通过星号标记阳性对照ASO。
图8显示了其它ANGPTL4-特异性ASO在原代肝细胞中的第2单一剂量效力筛选。将25,000个细胞/孔接种到96-孔胶原蛋白I-涂覆的平底板中并以5μM的最终浓度用各ASO处理。为了引起ANGPTL4 mRNA表达，同时用1μM PPARγ处理细胞。作为载体对照，用等量的DMSO(“DMSO”)处理细胞或者使细胞保持未处理(“-DMSO”)。每24h，用含有PPARγ以及5μM的各ASO或DMSO的新鲜培养基或仅培养基替换70μl上清液。3天后，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量人HPRT1以及人ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因HPRT1的表达归一化。显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”(n＝36)，SD＝0.24)的残余ANGPTL4-mRNA表达。实线和虚线分别表示70％和0％的敲低效力(上图)或者空-处理细胞(设置为100的“无寡聚”(n＝36)，SD＝19.3，下图)的100％的HPRT1表达。数据表示为重复六个(A24076He和阴性对照寡核苷酸)、重复九个(-DMSO)或者重复三个(所有其它ASO)孔的平均值+/-SD。通过星号标记阳性对照ASO。
图9显示了HEK-Blue hTLR9 SEAP报告细胞中的NF-κB-激活。将HEK-Blue-hTLR9细胞接种到平底96-孔板中并用所指明的寡核苷酸处理24h。在培育后收获细胞上清液，并与QUANTI-Blue溶液培育4h(图9A、9C和9D)或者3.5h(图9B)。通过测量620nm的光密度(OD)确定SEAP活性。将ANGPTL4-特异性ASO和neg1处理的细胞的数据表示为相对于用5000nMODN2006刺激的细胞的OD单位(设置为100％)的OD单位的三次重复+/-SD。将ODN2006处理的细胞的数据表示为六次重复的平均值+/-SD(A)、三次重复的平均值+/-SD(D)或者每个板上三次重复的平均值的平均值+/-SD(B-C)。
图10显示了所选的ANGPTL4 ASO的IC
图11显示了在食蟹猴肝细胞转染后，所选的ANGPTL4 ASO对靶标基因表达的效力。将25,000个原代食蟹猴肝细胞/孔接种到96-孔板中并用不同浓度(2nM、0.2nM)的各ASO转染。在37℃培育24h后，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量HPRT1和ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因HPRT1的表达归一化。显示了相对于空-处理细胞(设置为1(n＝12)，SD＝0.25)的残余ANGPTL4-mRNA表达。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
图12显示了以10μM的单一浓度，分别用如图12所示的小鼠ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸处理的小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)。处理开始后3天，通过QuantiGene RNASingleplex测定确定mRNA水平。将Hprt1用作ANGPTL4表达归一化的管家基因。8种ANGPTL4反义寡核苷酸，即A24047M(SEQ ID NO.106)、A24020M(SEQ ID NO.79)、A24017M(SEQ IDNO.76)、A24021M(SEQ ID NO.80)、A24049M(SEQ ID NO.108)、A24018M(SEQ ID NO.77)、A24041M(SEQ ID NO.100)和A24010M(SEQ ID NO.69)将归一化的ANGPTL4表达降低了大于50％。
图13显示了以10μM的单一浓度，分别用如图13所示的ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸处理的小鼠肾癌Renca细胞。3天后，通过QuantiGene RNA Singleplex测定确定mRNA水平。将Hprt1用作ANGPTL4表达归一化的管家基因。A24020M(SEQ ID NO.79)和A24019M(SEQID NO.78)导致ANGPTL4敲低大于50％(相当于残余mRNA水平<0.5)。
图14显示了在小鼠乳腺癌细胞4T1中已测试的9种以及测试的24种其它小鼠ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸。如图14所示，用5μM各ANGPTL4反义寡核苷酸处理细胞而不使用转染试剂。3天后，用含有5μM各ANGPTL4反义寡核苷酸的新鲜培养基替换细胞上清液并培育另外3天。然后，通过QuantiGene RNA Singleplex测定确定mRNA水平。将Gapdh用作ANGPTL4表达归一化的管家基因。12种所测试的反义寡核苷酸，即A24017M(SEQ ID NO.76)、A24070M(SEQ ID NO.127)、A24020M(SEQ ID NO.79)、A24019M(SEQ ID NO.78)、A24069M(SEQ ID NO.126)、A24021M(SEQ ID NO.80)、A24011M(SEQ ID NO.70)、A24073M(SEQ IDNO.130)、A24018M(SEQ ID NO.77)、A24055M(SEQ ID NO.114)、A24010M(SEQ ID NO.69)和A24065M(SEQ ID NO.79)显示出大于80％的ANGPTL4 mRNA敲低(相当于残余mRNA水平<0.2)。
图15显示通过用如图15所示的5μM的各ANGPTL4反义寡核苷酸处理它们，在4T1细胞中测试的21种小鼠ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸。3天后，用含有5μM各ANGPTL4反义寡核苷酸的新鲜培养基替换细胞上清液并培育另外3天。然后，通过QuantiGene RNASingleplex测定确定mRNA水平。将Hprt1用作ANGPTL4表达归一化的管家基因。A24047M(SEQID NO.106)、A24095Mi(SEQ ID NO.151)、A24093Mi(SEQ ID NO.149)、A24020M(SEQ IDNO.79)、A24090Mi(SEQ ID NO.146)和A24082Mi(SEQ ID NO.139)显示出大于50％的ANGPTL4 mRNA敲低(相当于残余mRNA水平<0.5)。
图16显示了在3T3、Renca和4T1细胞中具有最有效的敲低效率的A24018M(SEQ IDNO.77)、A24019M(SEQ ID NO.78)、A24020M(SEQ ID NO.79)、A24021M(SEQ ID NO.80)、A24047M(SEQ ID NO.106)、A24054M(SEQ ID NO.113)、A24065M(SEQ ID NO.79)、A24070M(SEQ ID NO.127)、A24072M(SEQ ID NO.129)、A24082M(SEQ ID NO.139)和A24095Mi(SEQID NO.151)，将它们选择用于确定半最大抑制浓度(IC
图17显示了其它小鼠Angptl4-特异性ASO在4T1细胞中的第1单一剂量效力筛选。将2,500个4T1细胞/孔接种到96-孔平底板中并以5μM的最终浓度用各ASO处理。处理后3天，用新鲜培养基w/ASO替换细胞上清液并将细胞在37℃培育另外3天。然后，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量小鼠Hprt1和小鼠Angptl4 mRNA表达。将Angptl4-mRNA的表达值对管家基因Hprt1的表达归一化。显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”(n＝37)，SD＝0.21)的残余Angptl4-mRNA表达。实线和虚线分别表示75％和0％的敲低效力(上图)或者100％的Hprt1水平(下图)(设置为1的“无寡聚”(n＝37)，SD＝0.17)。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
图18显示了小鼠Angptl4-特异性ASO在Renca细胞中的第2单一剂量筛选。将2,500个Renca细胞/孔接种到96-孔平底板中并以5μM的最终浓度用各ASO处理。处理后3天，用新鲜培养基w/ASO替换细胞上清液并将细胞在37℃培育另外3天。然后，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量小鼠Hprt1和小鼠Angptl4 mRNA表达。将Angptl4-mRNA的表达值对管家基因Hprt1的表达归一化。显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”(n＝37)，SD＝0.37)的残余Angptl4-mRNA表达。实线和虚线分别表示75％和0％的敲低效力(上图)或者100％的Hprt1水平(下图)(设置为1的“无寡聚”(n＝37)，SD＝0.36)。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
图19显示了所选的Angptl4 ASO的IC
具体实施方式
本发明提供了ANGPTL4表达的成功抑制剂，它是与ANGPTL4的mRNA和/或前体mRNA序列杂交的人或小鼠寡核苷酸并且分别抑制ANGPTL4的表达和活性。mRNA仅包含ANGPTL4编码核酸序列的外显子，而前体mRNA包含ANGPTL4编码核酸序列的外显子和内含子。因此，本发明的寡核苷酸代表了用于在预防和/或治疗病症的方法中使用的所关注且高效的工具，其中分别提高了ANGPTL4的表达和活性。
以下，将更详细地描述本发明的要素。通过具体实施方式列出了这些要素，然而，应理解它们可以以任何方式并以任何数目组合以产生其它实施方式。不应将多种所述的实例和实施方式视为将本发明仅限制在明确描述的实施方式。应理解这种描述支持并涵盖了将明确描述的实施方式与任何数目的所公开的要素组合的实施方式。此外，应认为除非上下文另外说明，否则通过本发明申请的描述公开了在本发明申请中所有所述要素的任何排列与组合。
在整个说明书和权利要求中，除非上下文另外要求，否则单词“包含”和变化形式将被理解为表示对所述成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组的包含，但不排除任何其它成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组。除非在本文中另外说明或明显与上下文矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一种”和“该”及类似参考将被视为涵盖了单数和复数两种形式。本文中数值范围的列举仅旨在用作分别表示属于该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另外说明，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像将其在本文中单独引用一样。除非本文另外指出或明显与上下文矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序执行。除非另外主张，否则本文所提供的任何和全部实施例或示例性语言(例如，“如”，“例如”)的使用仅旨在更好地描述本发明并且不对本发明的范围造成限制。本说明书中的语言不应视为表示对本发明的实践所必需的任何未主张的元素。
例如，本发明的寡核苷酸抑制剂是反义寡核苷酸(ASO)，其由10至25个核苷酸、12至22个核苷酸、15至20个核苷酸或16至18核苷酸组成或包含它们。例如，所述寡核苷酸由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸组成或包含它们。
本发明的寡核苷酸形成例如由至少5个核苷酸(即脱氧核苷酸和/或核糖核苷酸)的中央区块(central block)所组成或包含它们的间隙体(gapmer)，其侧接例如天然和/或人工修饰的核苷酸如脱氧核苷酸和/或核糖核苷酸。
本发明的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷酸。例如，所述修饰的核苷酸是桥核苷酸如锁核酸(LNA，例如，2',4'-LNA)、cET、ENA、2'氟修饰的核苷酸、2'O-甲基修饰的核苷酸、2'O-甲氧基乙基修饰的核苷酸及其组合。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含具有相同或不同修饰的一个或多个核苷酸。另外，本发明的寡核苷酸任选地包含修饰的磷酸酯主链，其中所述磷酸酯是例如硫代磷酸酯。
本发明的寡核苷酸在所述寡核苷酸的3'-和/或5'-端和/或在所述寡核苷酸内的任意位置包含一个或多个修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸以例如1、2、3、4、5或6个修饰的核苷酸行排列，或者修饰的核苷酸与一个或多个未修饰的核苷酸组合。下表1至4提供了ANGPTL4寡核苷酸的实例，其包含通过(+)表示的修饰的核苷酸(例如，LNA)和通过(*)表示的硫代磷酸酯(PTO)。由表1或2(人)或表3或4(小鼠)的序列组成或包含它们的ANGPTL4寡核苷酸可以包含任何其它修饰的核苷酸和/或任何其它修饰和未修饰的核苷酸的组合。表1的ANGPTL4寡核苷酸与人ANGPTL4的mRNA和/或前体mRNA杂交：
表1：与例如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2的人ANGPLT4 mRNA和/或前体mRNA杂交的反义寡核苷酸列表；Neg1是代表不与SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2的ANGPTL4杂交的阴性对照的寡核苷酸。“He”表示“人外显子区”并且是主要与人ANGPTL4的mRNA杂交的寡核苷酸，“Hi”是与ANGPTL4前体mRNA的内含子杂交的寡核苷酸。
表2的ANGPTL4寡核苷酸也与人ANGPTL4的mRNA和/或前体mRNA杂交：
表2：与例如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2的人ANGPLT4 mRNA和/或前体mRNA杂交的反义寡核苷酸列表；Neg1、R01002、R01009、R01014和R01019是代表不与SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2的ANGPTL4杂交的阴性对照的寡核苷酸。“He”表示“人外显子区”并且是主要与人ANGPTL4的mRNA杂交的寡核苷酸，“Hi”是与ANGPTL4前体mRNA的内含子杂交的寡核苷酸。“HMe”表示与ANGPTL4的“人和小鼠外显子区”杂交的寡核苷酸。
表3的寡核苷酸特别地与小鼠ANGPTL4的mRNA和/或前体mRNA杂交：
表3：与例如SEQ ID NO.58和/或SEQ ID NO.59的小鼠ANGPLT4 mRNA和/或前体mRNA杂交的反义寡核苷酸列表；Neg1是代表不与SEQ ID NO.58或者SEQ ID NO.59的ANGPTL4杂交的阴性对照的寡核苷酸。通过“M”表示主要与小鼠ANGPLT4 mRNA杂交的寡核苷酸，并且由于所述寡核苷酸与内含子杂交，因此通过“Mi”表示主要与小鼠ANGPLT4前体mRNA杂交的寡核苷酸。
表4的寡核苷酸也具体地与小鼠ANGPTL4的mRNA和/或前体mRNA杂交：
表4：与例如SEQ ID NO.58和/或SEQ ID NO.59的小鼠ANGPLT4 mRNA和/或前体mRNA杂交的反义寡核苷酸列表；Neg1、R01002、R01009、R01014和R01019是代表不与SEQ IDNO.58或者SEQ ID NO.59的ANGPTL4杂交的阴性对照的寡核苷酸。通过“M”表示主要与小鼠ANGPLT4 mRNA杂交的寡核苷酸，并且由于所述寡核苷酸与内含子杂交，因此通过“Mi”表示主要与小鼠ANGPLT4前体mRNA杂交的寡核苷酸。
例如，寡核苷酸在杂交活性区内杂交，所述杂交活性区是富集了高活性ASO的区域。例如，所述杂交活性区是例如SEQ ID NO.1的ANGPTL4 mRNA和/或例如SEQ ID NO.2的ANGPTL4前体mRNA上的一个或多个区域，其中与寡核苷酸的杂交很可能导致ANGPTL4表达的有效敲低。在本发明中，出乎意料地识别了几个杂交活性区，例如，其选自例如选自以下的杂交活性区：SEQ ID NO.1的位置1732-1759(例如，A24044He，SEQ ID NO.47；A24076He，SEQID NO.47)和/或SEQ ID NO.2的位置6603-6631(例如，A24022Hi，SEQ ID NO.25；A24023Hi，SEQ ID NO.26；A24071Hi，SEQ ID NO.54)。其它杂交活性区来自人SEQ ID NO.1的位置234-261(例如，A24102He，SEQ ID NO.178；A24103He，SEQ ID NO.179)和/或位置1264-1293(例如，A24110He，SEQ ID NO.186；A24111He，SEQ ID NO.187)和/或人SEQ ID NO.2的位置2800-2872(例如，A24083Hi，SEQ ID NO.159；A24085Hi，SEQ ID NO.161；A24086Hi，SEQ IDNO.162；A24087Hi，SEQ ID NO.163)和/或位置3415-3442(例如，A24089Hi，SEQ ID NO.165)和/或位置4968-4994(例如，A24097Hi，SEQ ID NO.173)。小鼠SEQ ID NO.58或SEQ IDNO.59上的杂交活性区例如来自SEQ ID NO.58的位置137-163(例如，A24054M，SEQ IDNO.113)和/或位置215-299(例如，A24018M，SEQ ID NO.77；A24019M，SEQ ID NO.78；A24020M，SEQ ID NO.79；A24021M，SEQ ID NO.80；A24065M，SEQ ID NO.79)和/或位置1343-1371(例如，A24042M，SEQ ID NO.101；A24109M，SEQ ID NO.212)和/或位置1738-1771(例如，A24047M，SEQ ID NO.106；A24070M，SEQ ID NO.127；A24072M，SEQ ID NO.129)和/或SEQID NO.59的位置1286-1314(例如，A24082Mi，SEQ ID NO.139；A24125Mi，SEQ ID NO.226)和/或位置5485-5511(例如，A24095Mi，SEQ ID NO.151；A24148Mi，SEQ ID NO.151)。
本发明的寡核苷酸抑制例如至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的ANGPTL4，如例如人或小鼠的ANGPTL4表达。本发明的寡核苷酸以纳摩尔或微摩尔浓度抑制ANGPTL4的表达，例如，在0.1nM至100μM、0.5nM至15nM、0.6nM至10nM、1nM至10μM、5nM至5μM、10nM至1μM、15nM至950nM、20nM至900nM、25nM至850nM、30nM至800nM、35nM至750nM、40nM至700nM、45nM至650nM、50nM至500nM或40nM至150nM的浓度范围内，或者浓度为0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950nM或者1、10或100μM。
例如，本发明的ANGPTL4寡核苷酸在1nM至10μM、5nM至6.6μM、10nM至5μM、15nM至3μM、20nM至2.2μM、25nM至1μM、30nM至800nM、50nM至500nM、60nM至300nM、70nM至250nM、80nM至200nM、90nM至120nM的浓度范围内，或者以1、1.6、3、5、8、9、10、15、20、25、27、30、40、50、75、82、100、200、250、300、500或740nM或1、2.2、3、5、6.6或10μM的浓度使用。
例如，本发明的ANGPTL4寡核苷酸施用一次或反复施用，例如，每12h、每24h、每48h施用持续数周、数月或数年，或者将其每周、每两周、每3周或每月或每3或6个月施用。
在一些实施方式中，本发明涉及包含本发明的ANGPTL4寡核苷酸和药用载体、赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。任选地，所述药物组合物还包含化学治疗剂；另一种疾病特异性活性剂如胰岛素、血管紧张素-转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂；非本发明的另一种寡核苷酸、抗体、HERA融合蛋白、配体阱(ligand trap)、Fab片段、纳米抗体、BiTe和/或小分子，其在例如肿瘤治疗，糖尿病及其副作用治疗，心血管疾病，肥胖症，II型糖尿病，高胆固醇血症如纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)，或血脂异常的治疗中有效。本发明所述的ANGPTL4寡核苷酸或药物组合物用于在防止和/或治疗病症，例如，其中涉及ANGPTL4失衡的病症的方法中的用途。任选地，将本发明所述的寡核苷酸或药物组合物在预防和/或治疗病症的方法中的使用与放射疗法组合。放射疗法还可以与化学疗法(例如，铂、吉西他滨)组合。例如，所述病症的特征在于ANGPTL4失衡，即与正常健康细胞、组织、器官或受试者中的水平相比，ANGPTL4水平升高。例如，分别通过提高ANGPTL4的表达和活性来提高ANGPTL4水平。通过本领域技术人员已知的任何标准方法，如免疫组织化学、免疫印迹、定量实时PCR或QuantiGene测定来测量ANGPTL4水平。局部或全身，例如，口服、舌下、鼻部、皮下、静脉内、腹膜内、肌内、肿瘤内、鞘内、透皮和/或直肠施用本发明的ANGPTL4寡核苷酸或药物组合物。作为另外一种选择或组合，施用离体处理的免疫细胞。单独或与本发明的另一种ANGPTL4反义寡核苷酸组合并且任选地与另一种化合物如非本发明的另一种寡核苷酸、抗体、HERA融合蛋白、配体阱、Fab片段、纳米抗体、BiTe、小分子，和/或化学治疗剂(例如，铂、吉西他滨)，和/或另一种疾病特异性试剂如胰岛素、血管紧张素-转换酶抑制剂和/或血管紧张素受体阻断剂组合施用ANGPTL4寡核苷酸。
非本发明的寡核苷酸、抗体、HERA融合蛋白、配体阱、Fab片段、纳米抗体、BiTe和/或小分子在预防和/或治疗肿瘤，流感感染，糖尿病如II型糖尿病及其副作用，心血管疾病，肥胖症，高胆固醇血症如纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)，或者血脂异常中是有效的。例如，在预防和/或治疗实体瘤或血液学肿瘤的方法中使用本发明的ANGPTL4寡核苷酸或药物组合物。通过使用本发明的寡核苷酸或药物组合物可预防的和/或可治疗的癌症的实例是乳腺癌、肺癌、恶性黑素瘤、淋巴瘤、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰癌、睾丸癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、网状细胞肉瘤、脂肪肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、脑膜瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞肿瘤、急性和慢性粒细胞性白血病、毛细胞肿瘤、腺瘤、增生、髓样癌、肠节细胞神经瘤、胚胎性癌肉瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、子宫颈非典型增生、成视网膜细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损害、横纹肌肉瘤、卡波济氏肉瘤、骨原性肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞肿瘤、红细胞增多、腺癌、间变性星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、白血病或表皮样癌。
除癌症以外，通过使用本发明所述的ANGPTL4寡核苷酸或药物组合物可预防的和/或可治疗的疾病的其它实例为例如糖尿病如II型糖尿病及其副作用，心血管疾病，肥胖症，高胆固醇血症如纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)，或者血脂异常。
在一些实例中，例如在药物组合物中而在相同时间点，或者单独地，或者以交替间隔施用本发明的两种或更多种ANGPTL4寡核苷酸。在一些实例中，例如在药物组合物中而在相同时间点，或者单独地，或者以交替间隔施用本发明的两种或更多种ANGPTL4寡核苷酸。在其它实例中，将本发明的一种或多种寡核苷酸与另一种化合物例如在药物组合物中而在相同时间点，或者单独地，或者以交替间隔施用，所述另一种化合物如非本发明的另一种寡核苷酸、抗体、HERA融合蛋白、配体阱、Fab片段、纳米抗体、BiTe、小分子和/或化学治疗剂。
例如，本发明的受试者是哺乳动物、鸟或鱼。
实施例
以下实施例说明了本发明的不同实施方式，但是本发明不局限于这些实施例。对内源表达ANGPTL4的细胞实施以下实验，即所述细胞不代表包含转染的报告子构建体的人工系统。这些人工系统通常显示出比更接近于治疗相关体内系统的内源系统更高的抑制程度和更低的IC
实施例1：人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸在HeLa细胞中的第1筛选
将5,000个HeLa细胞/孔接种到96-孔板中并如图1所指明的，以10μM的最终浓度用各反义寡核苷酸处理。为了引起ANGPTL4 mRNA表达，同时用1μM PPARδ(Sigma Aldrich，产品目录号SML1491)处理细胞。例如，在实施例中使用的PPARδ基于PPARδ储液(10mM)，所述储液通过将5mg PPARδ(分子量：453.50)溶解在1.1ml DMSO中制备。对于1μM PPARδ的最终浓度，将在96-孔板中接种的细胞与100μl补充有0.01μl PPARδ储液的培养基培育。作为阴性对照，用相等体积的DMSO处理细胞。处理开始后3天，将细胞裂解并使用QuantiGene RNASingleplex测定测量人HPRT1以及人ANGPTL4 mRNA表达(图1)。例如，在实施例中使用的QuantiGene测定依赖于分枝DNA技术(bDNA)，其依赖于靶标mRNA和特异性探针组(QuantiGene试剂系统的部分)之间的协同杂交。根据生产商的规程(Thermo FisherScientific)进行测定并将其用于确定RNA水平。它将用于细胞胞溶的QuantiGene样品处理试剂盒和用于所关心的RNA的杂交、扩增和检测的QuantiGene试剂系统相结合。QuantiGene试剂系统基于RNA-特异性探针组，其设计以检测所关心的特定RNA。
将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因HPRT1的表达归一化。显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”)的残余ANGPTL4-mRNA表达。实线和虚线分别表示70％和50％或0％的敲低效力。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
如图1所示，两个反义寡核苷酸(A24022Hi(SEQ ID NO.25)和A24023Hi(SEQ IDNO.26))将归一化的ANGPTL4表达降低了大于70％(相当于残余mRNA水平<0.3)。此外，3个反义寡核苷酸(A24003He(SEQ ID NO.5)、A24042He(SEQ ID NO.45)、A24005Hi(SEQ IDNO.7))显示出70％至50％之间的敲低效力，而对照寡核苷酸(Neg1)未降低ANGPTL4 mRNA表达。
实施例2：SK-OV3细胞中人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸的第2筛选
将5,000个SK-OV3细胞/孔接种到96-孔板中并以10μM的最终浓度用各ANGPTL4反义寡核苷酸处理。为了引起ANGPTL4 mRNA表达，同时用1μM PPARδ(Sigma Aldrich，产品目录号SML1491；对于10mM储液的制备，参见实施例1)处理细胞。对于1μM PPARδ的最终浓度，将在96-孔板中接种的细胞与100μl补充有0.01μl PPARδ储液的培养基培育。作为阴性对照，用相等体积的DMSO处理细胞。
处理开始后3天，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量人HPRT1以及人ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因HPRT1的表达归一化。图2显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”)的残余ANGPTL4-mRNA表达。实线和虚线分别表示60％和0％的敲低效力。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
SK-OV3细胞中的ANGPTL4反义寡核苷酸筛选重复导致产生了3个敲低效率大于60％的ANGPTL4反义寡核苷酸(A24022Hi(SEQ ID NO.25)、A24044He(SEQ ID NO.47)、A24023Hi(SEQ ID NO.26))。
实施例3：其它人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸在HeLa细胞中的第1单一剂量效力筛选
将5,000个HeLa细胞/孔接种到96-孔板中并以10μM的最终浓度，用来自HeLa(图1)和SK-OV3(图2)中的第1筛选的最有效的ANGPTL4反义寡核苷酸(A24022Hi(SEQ ID NO.25)、A24023Hi(SEQ ID NO.26)、A24044He(SEQ ID NO.47))以及其它ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸(A24071Hi(SEQ ID NO.54)、A24076He(SEQ ID NO.47)、A24075He(SEQ ID NO.5)、A24073Hi(SEQ ID NO.55)、A24065Hi(SEQ ID NO.51)、A24067Hi(SEQ ID NO.52)、A24077He(SEQ ID NO.47)、A24074Hi(SEQ ID NO.56))处理。为了引起ANGPTL4 mRNA表达，同时用1μMPPARδ(Sigma Aldrich，产品目录号SML1491；对于10mM储液的制备，参见实施例1)处理细胞。对于1μM PPARδ的最终浓度，将在96-孔板中接种的细胞与100μl补充有0.01μl PPARδ储液的培养基培育。作为阴性对照，用相等体积的DMSO处理细胞。
处理开始后3天，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量人HPRT1以及人ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因HPRT1的表达归一化。图3显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”)的残余ANGPTL4-mRNA表达。实线和虚线分别表示50％和0％的敲低效力。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
如图3所示，所测试的ANGPTL4反义寡核苷酸中的4个(A24022Hi(SEQ ID NO.25)、A24023Hi(SEQ ID NO.26)、A24044He(SEQ ID NO.47)、A24071Hi(SEQ ID NO.54))显示出大于50％的ANGPTL4 mRNA敲低(相当于残余mRNA水平<0.5)，而用Neg1阴性对照寡核苷酸的处理不会导致ANGPTL4 mRNA水平降低。
实施例4：其它人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸在SK-OV3细胞中的第2单一剂量效力筛选
将5,000个SK-OV3细胞/孔接种到96-孔板中并以10μM的最终浓度用各ANGPTL4反义寡核苷酸(A24071Hi(SEQ ID NO.54)、A24022Hi(SEQ ID NO.25)、A24076He(SEQ IDNO.47)、A24044He(SEQ ID NO.47)、A24023Hi(SEQ ID NO.26)、A24077He(SEQ ID NO.47)、A24075He(SEQ ID NO.5)、A24073Hi(SEQ ID NO.55))处理。为了引起ANGPTL4 mRNA表达，同时用1μM PPARδ(Sigma Aldrich，产品目录号SML1491；对于10mM储液的制备，参见实施例1)处理细胞。对于1μM PPARδ的最终浓度，将在96-孔板中接种的细胞与100μl补充有0.01μlPPARδ储液的培养基培育。作为阴性对照，用相等体积的DMSO处理细胞。
处理开始后3天，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量人HPRT1以及人ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因HPRT1的表达归一化。图4显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”)的残余ANGPTL4-mRNA表达。实线和虚线分别表示50％和0％的敲低效力。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
SK-OV3细胞中优化的ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸筛选重复导致产生了敲低效率大于50％的5个ANGPTL4反义寡核苷酸(A24071Hi(SEQ ID NO.54)、A24022Hi(SEQ IDNO.25)、A24076He(SEQ ID NO.47)、A24044He(SEQ ID NO.47)、A24023Hi(SEQ ID NO.26))(图4)。
实施例5：所选的人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸的体外TLR9测定
免疫刺激性配体，例如细菌DNA或者具有或不具有未甲基化的CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸的结合导致了TLR激活。由于免疫激活可以导致严重，有可能地危急生命的过量细胞因子释放状况，因此急需预测细胞因子在人中释放的临床前测试系统。
将HEK-Blue-hTLR9(Invivogen产品目录号hkb-htlr9)细胞接种到平底96-孔板中并用ANGPTL4寡核苷酸A24022Hi(SEQ ID NO.25)、A24023Hi(SEQ ID NO.26)、A24071Hi(SEQID NO.54)和A24076He(SEQ ID NO.47)处理24h。然后，收获细胞上清液并与QUANTI-Blue溶液(Invivogen产品目录号rep-qbs)培育4h。通过测量光密度确定SEAP活性。在图5中显示了相对于来自用5000nM ODN2006刺激的细胞的OD单位(设置为100)的OD单元的平均值和标准偏差。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
如图5所示，所测试的ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸无一引起TLR9激活。相反，阳性对照CpG寡核苷酸ODN2006(5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'PTO-修饰的-Invivogen产品目录号tlrl-2006；SEQ ID NO.153)明显刺激NF
实施例6：所选的人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸的IC
将30,000个原代人肝细胞/孔接种到96-孔板中并用不同浓度：5000nM、1000nM、200nM、40nM、8nM和1.6nM的不同的ANGPTL4反义寡核苷酸：A24022Hi(SEQ ID NO.25)、A24023Hi(SEQ ID NO.26)、A24071Hi(SEQ ID NO.54)和A24076He(SEQ ID NO.47)处理。为了引起ANGPTL4 mRNA表达，同时用1μM PPARγ(Sigma Aldrich，产品目录号R2408)处理细胞。通过将10mg PPARγ(分子量：357.43)溶解在2.8ml DMSO中来制备PPARγ储液(10mM)。对于1μM PPARγ的最终浓度，将在96-孔板中接种的细胞与100μl补充有0.01μl PPARγ储液的培养基培育。作为阴性对照，用相等体积的DMSO处理细胞。每24h，用含有1μM PPARγ以及处于所指明的浓度的各ANGPTL4反义寡核苷酸的新鲜培养基替换70μl上清液。处理开始后3天，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量HPRT1和ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因HPRT1的表达归一化。残余ANGPTL4-mRNA表达相对于空-处理细胞(设置为1)。对于图示，将空-处理细胞设置为0.32nM。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
图6和表5显示所选的ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸以纳摩尔范围内的IC
表5：在原代人肝细胞中确定的所选的人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸的IC
实施例7：其它人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸(ASO)在原代肝细胞中的第1单一剂量筛选。
总计设计了其它49个ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸。基于在人细胞系中的两次初始筛选(数据未显示)，选择了17个有希望的ASO用于原代人肝细胞中的第1筛选(图7)。作为阴性对照包括了与任何人或小鼠mRNA不具有序列互补性的3个具有不同长度(分别具有16、17和18个核苷酸)的对照寡核苷酸(R01002、R01014、Neg1)，而将具有验证的敲低效率的3个ANGPTL4-特异性寡核苷酸用作阳性对照(A24022Hi(SEQ ID NO.25)、A24071Hi(SEQ IDNO.54)、A24076He(SEQ ID NO.47))。在5μM的单一浓度，用各寡核苷酸处理人原代肝细胞(Lonza)3天而不使用转染试剂。为了引起ANGPTL4 mRNA表达，同时用1μM PPARγ(SigmaAldrich，产品目录号R2408；对于10mM储液的制备，参见实施例6)处理细胞。对于1μM PPARγ的最终浓度，将在96-孔板中接种的细胞与100μl补充有0.01μl PPARγ储液的培养基培育。作为阴性对照，用相等体积的DMSO处理细胞。
处理开始后3天，将细胞裂解并通过QuantiGene RNA Singleplex测定确定mRNA水平。将次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)用作ANGPTL4表达归一化的管家基因。如图7所示，与DMSO-处理的细胞相比，PPARγ刺激导致了约50％提高的ANGPTL4水平(无寡聚)。
使用8种ANGPTL4-特异性ASO(A24096Hi(SEQ ID NO.172)、A24103He(SEQ IDNO.179)、A24091Hi(SEQ ID NO.167)、A24123He(SEQ ID NO.197)、A24083Hi(SEQ IDNO.159)、A24087Hi(SEQ ID NO.163)、A24102He(SEQ ID NO.178)、A24116He(SEQ IDNO.192))以及阳性对照ASO(A24022Hi(SEQ ID NO.25)、A24071Hi(SEQ ID NO.54)、A24076He(SEQ ID NO.47))的处理使ANGPTL4表达降低了大于70％(相当于残余ANGPTL4-mRNA表达<0.3)。对照寡核苷酸(Neg1、R01002、R01014)不降低ANGPTL4 mRNA表达。
实施例8：其它人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸(ASO)在原代肝细胞中的第2单一剂量筛选。
在实施例7的实验条件下在原代肝细胞中测试了其余新设计的ANGPTL4-特异性ASO(图8)。这些ASO在后续离体测试中良好耐受(数据未显示)。将具有验证的敲低效率的一种ANGPTL4-特异性寡核苷酸用作阳性对照(A24076He(SEQ ID NO.47))，而作为阴性对照包括了与任何人或小鼠mRNA不具有序列互补性的3个具有不同长度(分别具有16、17和18个核苷酸)的对照寡核苷酸(R01009、R01019、Neg1)。
用10个ANGPTL4-特异性ASO(A24083Hi(SEQ ID NO.159)、A24089Hi(SEQ IDNO.165)，A24117He(SEQ ID NO.193)，A24124He(SEQ ID NO.46)，A24103He(SEQ IDNO.179)，A24097Hi(SEQ ID NO.173)、A24110He(SEQ ID NO.186)、A24121He(SEQ IDNO.195)、A24086Hi(SEQ ID NO.162)，A24085Hi(SEQ ID NO.161))处理将ANGPTL4表达降低了大于70％(相当于残余ANGPTL4-mRNA表达<0.3)，而与阳性对照ASO A24076H培育使ANGPTL4 mRNA表达降低了约63％(图8)。对照寡核苷酸(Neg1、R01009、R01019)仅使ANGPTL4mRNA表达轻微降低(6-20％)。
实施例9：人Toll-样受体9(hTLR9)对人血管生成素-样蛋白4(ANGPTL4)-特异性LNA-修饰的反义寡核苷酸响应的激活
测试了人ANGPTL4-特异性LNA-修饰的反义寡核苷酸A24076H(SEQ ID NO.47)、A24083Hi(SEQ ID NO.159)、A24085Hi(SEQ ID NO.161)、A24086Hi(SEQ ID NO.162)、A24087Hi(SEQ ID NO.163)、A24089Hi(SEQ ID NO.165)、A24096Hi(SEQ ID NO.172)、A24102He(SEQ ID NO.178)、A24103He(SEQ ID NO.179)、A24110He(SEQ ID NO.186)、A24111He(SEQ ID NO.187)、A24113He(SEQ ID NO.189)、A24116He(SEQ ID NO.192)和A24123He(SEQ ID NO.197)激活TLR9的潜力。在实施例5的实验条件下，在TLR9报告细胞系HEK-Blue-hTLR9细胞(Invivogen产品目录号hkb-htlr9)中实施了一次实验(A24076H、A24096H、A24102He、A24113He、A24116He和A24123He)或者两次实验(所有其它ASO)。如图9A、9B、9C和9D所示，通过用不同浓度的各种人ANGPTL4 ASO处理细胞，未观察到NF-κB的剂量-依赖性激活。相反，通过用阳性对照ODN2006(5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'PTO-修饰的-Invivogen产品目录号tlrl-2006；SEQ ID NO.153)处理，以剂量-依赖性方式激活了NF-κB。
实施例10：所选的人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸(ASO)的IC
基于原代肝细胞中的敲低效率(图7和8)，将一旦转染，则具有最有效的敲低效力且不诱导半胱天冬氨酸酶3/7的ASO选择用于确定IC
将原代人肝细胞(Primacyt)用ANGPTL4-特异性ASO或阴性对照寡核苷酸Neg1、R01009和R01019以不同浓度处理3天。同时，用PPARγ(1μM)(Sigma Aldrich，产品目录号R2408；对于10mM储液的制备，参见实施例6)处理细胞以引起ANGPTL4表达。对于1μM PPARγ的最终浓度，将在96-孔板中接种的细胞与100μl补充有0.01μl PPARγ储液的培养基培育。作为阴性对照，用相等体积的DMSO处理细胞。3天后，使用QuantiGene Singleplex RNA测定分析mRNA表达。
表6和图10显示8种ANGPTL4-特异性ASO(A24083Hi(SEQ ID NO.159)、A24085Hi(SEQ ID NO.161)、A24087Hi(SEQ ID NO.163)、A24089Hi(SEQ ID NO.165)、A24097Hi(SEQID NO.173)、A24103He(SEQ ID NO.179)、A24110He(SEQ ID NO.186)和A24111He(SEQ IDNO.187))和阳性对照A24076He(SEQ ID NO.47)以纳摩尔范围的IC
下表6显示了在原代人肝细胞中确定的所选人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸的IC
实施例11：人ANGPTL4-特异性寡核苷酸在食蟹猴肝细胞中的体外效力
在原代食蟹猴肝细胞中测试了体内耐受的人ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸A24076H(SEQ ID NO.47)以及与食蟹猴ANGPTL4序列仅具有1个不匹配的3种其它人ANGPTL4-特异性ASO(表7)(图11)。在人细胞系和原代肝细胞中，所测试的所有ASO显示具有验证的敲低效率。作为阴性对照包括了与任何人或小鼠RNA不具有序列互补性的2个具有不同长度(分别具有16和17个核苷酸)的对照寡核苷酸(R01009、R01019)。
表7显示了在人细胞中具有证明的敲低效率且不导致体外半胱天冬氨酸酶3/7诱导的人ANGPTL4-特异性ASO。显示了交叉反应性(CrossReact)以及与食蟹猴(Mfa，macacafascicularis)ANGPTL4序列的不匹配数以及在原代食蟹猴肝细胞中的体外活性(图11)：
将原代食蟹猴肝细胞(Primacyt)用ANGPTL4-特异性ASO或阴性对照寡核苷酸R01009和R01019以不同浓度转染3天。同时，用PPARδ(1μM)(Sigma Aldrich，产品目录号R2408；对于10mM储液的制备，参见实施例6)处理细胞以引起ANGPTL4表达。对于1μM PPARγ的最终浓度，将在96-孔板中接种的细胞与100μl补充有0.01μl PPARγ储液的培养基培育。作为阴性对照，用相等体积的DMSO处理细胞。3天后，使用QuantiGene Singleplex RNA测定分析mRNA表达。
如图11所示，用PPARδ处理引起了约8-倍的ANGPTL4表达(图11，DMSO对照)。用对食蟹猴ANGPTL4序列具有完全交叉反应性的ANGPTL4-特异性ASO A24076He(SEQ ID NO.47)处理导致了大于70％的ANGPTL4敲低(相当于0.3的残余mRNA表达)。与食蟹猴序列具有一个不匹配的人ANGPTL4-特异性寡核苷酸(A24089Hi(SEQ ID NO.165)、A24110He(SEQ IDNO.186)、A24111He(SEQ ID NO.187))还将食蟹猴ANGPTL4 mRNA降低了多达51％(相当于0.49的残余ANGPTL4-mRNA表达)。阴性对照寡核苷酸R01009不会使Angptl4在原代食蟹猴肝细胞中的表达降低，而使用2nM的浓度，对照寡核苷酸R01019仅使ANGPTL4 mRNA表达轻微降低约25％(相当于0.75的残余ANGPTL4-mRNA表达)。
基于实施例11的结论：
总体上，体外实验导致识别了适合于在食蟹猴中测试ASO-基ANGPTL4-靶向治疗剂的高度有效的人ANGPTL4特异性ASO。例如，将这种药物用于血脂异常患者的全身治疗以降低ANGPTL4-介导的脂蛋白脂肪酶L抑制，从而防止细胞脂质过载、肥胖症、II型糖尿病和心血管疾病。
实施例12：小鼠ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸在3T3细胞中的第1单一剂量效力筛选
如图12所示，将4,500个3T3细胞/孔接种到96-孔板中并以10μM的最终浓度用ANGPTL4反义寡核苷酸处理。将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量小鼠Hprt1和小鼠ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因Hprt1的表达归一化。图12显示了相对于空-处理细胞(设置为100的“无寡聚”)的残余ANGPLT4-mRNA表达。实线和虚线分别表示50％和0％的敲低效力。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
如图12所示，8种ANGPTL4反义寡核苷酸，即A24047M(SEQ ID NO.106)、A24020M(SEQ ID NO.79)、A24017M(SEQ ID NO.76)、A24021M(SEQ ID NO.80)、A24049M(SEQ IDNO.108)、A24018M(SEQ ID NO.77)、A24041M(SEQ ID NO.100)和A24010M(SEQ ID NO.69)将归一化的ANGPTL4表达降低了大于50％，而对照寡核苷酸(Neg1)不降低ANGPTL4 mRNA表达(图12)。
实施例13：小鼠ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸在Renca细胞中的第2单一剂量效力筛选
如图13所示，将5,000个Renca细胞/孔接种到96-孔板中并以10μM的最终浓度用ANGPTL4反义寡核苷酸处理。处理开始后3天，将细胞裂解并使用QuantiGene RNASingleplex测定测量小鼠Hprt1和小鼠ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因Hprt1的表达归一化。显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”)的残余ANGPTL4-mRNA表达。实线和虚线分别表示50％和0％的敲低效力。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。如图13所示，用2个ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸，即A24020M(SEQ IDNO.79)和A24019M(SEQ ID NO.78)处理导致产生了大于50％的ANGPTL4敲低(相当于残余mRNA水平<0.5)(图13)。
实施例14：其它小鼠ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸在4T1细胞中的测试
如图14所示，将2,500个4T1细胞/孔接种到96-孔板中并以5μM的最终浓度用ANGPTL4反义寡核苷酸(ASO)处理。3d后，通过新鲜培养基w/ASO替换细胞上清液。处理开始后6天，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量小鼠Gapdh和小鼠ANGPTL4mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因Gapdh的表达归一化。显示了相对于Neg1-处理细胞(设置为1)的残余ANGPTL4-mRNA表达。实线和虚线分别表示80％和0％的敲低效力。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
如图14所示，12种所测试的反义寡核苷酸，即A24017M(SEQ ID NO.76)、A24070M(SEQ ID NO.127)、A24020M(SEQ ID NO.79)、A24019M(SEQ ID NO.78)、A24069M(SEQ IDNO.126)、A24021M(SEQ ID NO.80)、A24011M(SEQ ID NO.70)、A24073M(SEQ ID NO.130)、A24018M(SEQ ID NO.77)、A24055M(SEQ ID NO.114)、A24010M(SEQ ID NO.69)和A24065M(SEQ ID NO.79)显示出大于80％的ANGPTL4 mRNA敲低(相当于残余mRNA水平<0.2)。
实施例15：靶向内含子的小鼠ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸在4T1细胞中的单一剂量效力筛选
如图15所示，将2,500个4T1细胞/孔接种到96-孔板中并以5μM的最终浓度用ANGPTL4反义寡核苷酸(ASO)处理。处理开始后3天，用新鲜培养基w/ASO替换细胞上清液并将细胞培育另外3d。然后，将细胞裂解并使用QuantiGene RNA Singleplex测定测量小鼠Hprt1和小鼠ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因Hprt1的表达归一化。显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”对照)的残余ANGPTL4-mRNA表达。实线和虚线分别表示50％和0％的敲低效力。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
如图15所示，6种所测试的ANGPTL4反义寡核苷酸，即A24047M(SEQ ID NO.106)、A24095Mi(SEQ ID NO.151)、A24093Mi(SEQ ID NO.149)、A24020M(SEQ ID NO.79)、A24090Mi(SEQ ID NO.146)和A24082Mi(SEQ ID NO.139)显示出大于50％的ANGPTL4 mRNA敲低(相当于残余mRNA水平<0.5)。
实施例16：所选的小鼠ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸的IC
将2,500个4T1细胞/孔接种到96-孔板中并用各ANGPTL4反义寡核苷酸(ASO)：A24018M(SEQ ID NO.77)、A24019M(SEQ ID NO.78)、A24020M(SEQ ID NO.79)、A24021M(SEQID NO.80)、A24047M(SEQ ID NO.106)、A24054M(SEQ ID NO.113)、A24065M(SEQ IDNO.79)、A24070M(SEQ ID NO.127)、A24072M(SEQ ID NO.129)、A24082M(SEQ ID NO.139)和A24095Mi(SEQ ID NO.151)以5000nM、1000nM、200nM、40nM、8nM和1.6nM的不同浓度处理。处理开始后3天，用新鲜培养基w/ASO替换细胞上清液并将细胞培育另外3d。然后，将细胞裂解并使用QuantiGene RNASingleplex测定测量小鼠Hprt1和小鼠ANGPTL4 mRNA表达。将ANGPTL4-mRNA的表达值对管家基因Hprt1的表达归一化。显示了相对于空-处理细胞(设置为1的“无寡聚”对照)的残余ANGPTL4-mRNA表达。数据表示为三个重复孔的平均值+/-SD。
图16和表8显示所选的ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸以纳摩尔范围内的IC
表8：在4T1细胞中确定的所选小鼠的ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸的IC
实施例17：其它小鼠ANGPTL4-特异性ASO在4T1细胞中的第1单一剂量筛选
设计了小鼠Angptl4-特异性反义寡核苷酸。在初始筛选中，测试了53个靶向Angptl4 mRNA的ASO。作为阴性对照包括了与任何人或小鼠mRNA不具有序列互补性的3个具有不同长度(分别具有16、17和18个核苷酸)的对照寡核苷酸(R01002、R01014、Neg1)，而将具有验证的敲低效率的3种ANGPTL4-特异性寡核苷酸(A24047M(SEQ ID NO.106)、A24072M(SEQ ID NO.129)、A24095Mi(SEQ ID NO.151))用作阳性对照。在5μM的单一浓度，用各寡核苷酸处理小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)。3天后，用含有5μM各ASO的新鲜培养基替换细胞上清液并培育另外3天。然后，将细胞裂解并通过QuantiGene RNA Singleplex测定确定mRNA水平。将Hprt1用作Angptl4表达归一化的管家基因。
如图17所示，15种ASO(A24146Mi(SEQ ID NO.247)、A24047M(SEQ ID NO.106)、A24126Mi(SEQ ID NO.227)、A24120Mi(SEQ ID NO.221)、A24104M(SEQ ID NO.207)、A24108M(SEQ ID NO.211)、A24110M(SEQ ID NO.213)、A24139Mi(SEQ ID NO.240)、A24103M(SEQ ID NO.206)、A24112M(SEQ ID NO.107)、A24122HMe(SEQ ID NO.196)、A24113M(SEQID NO.108)、A24125Mi(SEQ ID NO.226)、A24099M(SEQ ID NO.202)、A24095Mi(SEQ IDNO.151))将Angptl4表达降低了大于75％(相当于残余Angptl4-mRNA表达<0.25)，而对照寡核苷酸(Neg1、R01002、R01014)将Angptl4 mRNA表达降低了小于50％(相当于残余Angptl4-mRNA表达>0.5)(图17)。
实施例18：小鼠ANGPTL4-特异性ASO在Renca细胞中的第2单一剂量筛选
为了在不同细胞系中进一步确认，将如实施例17中的相同处理应用于小鼠Renca细胞。借此，用19种Angptl4-特异性ASO(A24143Mi(SEQ ID NO.244)、A24047M(SEQ IDNO.106)、A24095Mi(SEQ ID NO.151)、A24125Mi(SEQ ID NO.226)、A24110M(SEQ IDNO.213)、A24148Mi(SEQ ID NO.151)、A24120Mi(SEQ ID NO.221)、A24104M(SEQ IDNO.207)、A24109M(SEQ ID NO.212)、A24139Mi(SEQ ID NO.240)、A24103M(SEQ IDNO.206)、A24122HMe(SEQ ID NO.196)、A24131Mi(SEQ ID NO.232)、A24138Mi(SEQ IDNO.239)、A24123Mi(SEQ ID NO.224)、A24146Mi(SEQ ID NO.247)、A24117Mi(SEQ IDNO.218)、A24130Mi(SEQ ID NO.231)、A24144Mi(SEQ ID NO.245))处理导致Angptl4敲低大于75％(相当于残余Angptl4-mRNA表达<0.25)(图18)。
实施例19：所选的小鼠ANGPTL4-特异性反义寡核苷酸的IC
基于4T1和Renca细胞中的敲低效率结果(图17、18)，9种在Renca和4T1细胞中具有最有效的敲低效率的ASO(A24103M(SEQ ID NO.206)、A24110M(SEQ ID NO.213)、A24122HMe(SEQ ID NO.196)、A24120Mi(SEQ ID NO.221)、A24125Mi(SEQ ID NO.226)、A24139Mi(SEQID NO.240)、A24143Mi(SEQ ID NO.244)、A24146Mi(SEQ ID NO.247)、A24148Mi(SEQ IDNO.151))选择用于确定半最大抑制浓度(IC
以不同浓度，用各ASO处理原代小鼠肝细胞3天。3天后，使用QuantiGeneSingleplex RNA测定分析mRNA表达。图19和表9显示所选的Angptl4-特异性ASO以纳摩尔范围内的IC
表9显示了在原代人肝细胞中确定的所选的Angptl4-特异性ASO的IC
基于实施例7-11和17-19的结论：
通过测试一组47种对人ANGPTL4具有特异性的其它ASO，选择了在mRNA水平上有效降低人ANGPTL4在原代肝细胞中的表达的几种ASO。用16种测试的ASO处理显示在原代人肝细胞中大于70％的ANGPTL4 mRNA的敲低。借此，最有效的候选的IC
为了在小鼠模型中实施体内实验，设计了对小鼠Angptl4具有特异性的ASO，并且对于有效敲低小鼠Angptl4体外表达的体内实验选择了成功的候选ASO。
总体上，实施了广泛的一组体外实验，其导致识别了适于开发ASO-基ANGPTL4-靶向治疗剂的非常有效的人ANGPTL4特异性ASO。
机译： ANGPTL4寡核苷酸影响脂肪酸代谢的调控
机译： ANGPTL4寡核苷酸影响脂肪酸代谢的调控
机译： Angptl4影响脂肪酸代谢调节的寡核苷酸
