NK细胞中对细胞因子诱导的SH2蛋白的抑制

摘要

本发明涉及基于NK细胞中CIS的抑制的治疗和预防方法。具体地讲，本发明涉及通过向受试者施用CIS抑制剂或CIS抑制性NK细胞来治疗或预防NK应答性病症。本发明还涉及用于鉴定CIS抑制剂，以及用于确定癌症对CIS抑制的治疗应答的可能性的方法。

说明书

本申请是优先权日为2015年12月16日、申请号为2016800812529、发 明创造名称为“NK细胞中对细胞因子诱导的SH2蛋白的抑制”的专利申请 的分案申请。

技术领域

本说明书整体涉及治疗剂领域。更具体地讲，本说明书涉及用于预防或 治疗适合于NK细胞介导的疗法的健康病症的方法。

背景技术

免疫系统在抑制肿瘤生长和感染中的作用是熟知的，现在认为避免免疫 检测是癌症发展的重要因素。例如，细胞毒性淋巴细胞诸如自然杀伤(NK)和 CD8效应T细胞通过癌症免疫编辑来帮助抗肿瘤免疫。然而，肿瘤和感染原 (例如，病毒)利用多种使这些细胞毒性淋巴细胞失能的机制。多效性细胞因 子IL-15是NK细胞发育、自稳调节和活化的重要调节剂，但其对NK细胞 活化的作用是短暂的，在许多癌症和感染的情况下，这限制了NK细胞介导 的应答的有效性。迄今为止，人们对理解抑制NK细胞应答的抑制性信号有 着极大的兴趣，但细胞内IL-15信号传导如何关闭仍不清楚。

因此，不断需要发现启动NK细胞应答的新策略，以有效治疗许多潜在 的NK细胞应答性健康病症(包括癌症)，同时避免大多数化疗剂的破坏性副 作用。

发明内容

本发明人已发现对细胞因子诱导的SH2蛋白(CIS)的抑制可以用于治疗 许多NK细胞应答性病症，包括某些癌症和感染。

因此，在一个方面，本发明提供一种用于治疗患有NK细胞应答性病症 或处于患有NK细胞应答性病症的风险中的受试者的方法，其包括向所述受 试者施用CIS抑制剂。

在另一个方面，本发明提供一种用于过继性细胞治疗或预防的方法，其 包括向患有NK细胞应答性病症或处于患有NK细胞应答性病症的风险中的 受试者施用CIS抑制性NK细胞。在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞 是自体的。在其他实施方案中，CIS抑制性NK细胞是同种异体的。在一些 实施方案中，CIS抑制性NK细胞是与CIS抑制剂接触的NK细胞。

在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞是经遗传修饰，诸如通过使用 可编程核酸酶进行基因编辑或通过基因沉默(RNA干扰)为具有降低的CIS表 达的NK细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的CIS抑制性NK细胞是 Cish

关于上述任何一个方面，在一些实施方案中，待施用或用于生成CIS抑 制性NK细胞的CIS抑制剂是肽、肽模拟物、小分子、多核苷酸或多肽。在 一些实施方案中，CIS抑制剂竞争性抑制CIS与JAK1和/或JAK3的结合。 在一些实施方案中，CIS抑制剂竞争性抑制CIS与磷酸化JAK1(例如，在 Tyr1034处磷酸化的JAK1)和/或磷酸化JAK3(例如，在Tyr980处磷酸化的 JAK3)的结合。在另外的实施方案中，CIS抑制剂竞争性抑制CIS与延伸蛋 白B、延伸蛋白C或滞蛋白-5中的一者或多者的结合。

在一些实施方案中，在CIS抑制剂是肽的情况下，所述肽是磷酸肽或磷 酸模拟肽。

在一些实施方案中，在CIS抑制剂是多肽的情况下，所述多肽是抗CIS 抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，在CIS抑制剂是多核苷酸的情况下，所述多核苷酸 是dsRNA。在一些实施方案中，dsRNA CIS抑制剂是shRNA、siRNA或 miRNA。在一些实施方案中，多核苷酸作为用于表达多核苷酸CIS抑制剂的 载体提供。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，多核 苷酸CIS抑制剂编码CIS的显性阴性抑制剂。在一些实施方案中，所编码的 显性阴性抑制剂包含含有R107K置换的CIS的氨基酸序列。在其他实施方 案中，所编码的显性阴性抑制剂包含具有L223A置换的CIS的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在CIS抑制剂是多核苷酸的情况下，所述多核苷酸 是化学修饰的mRNA。在一些实施方案中，所述化学修饰的mRNA编码CIS 的显性阴性抑制剂(例如，CIS-R107K)。

在一些实施方案中，在CIS抑制剂是小分子的情况下，所述小分子CIS 抑制剂使CIS不稳定。在一些实施方案中，在小分子CIS抑制剂通过使CIS 不稳定而发挥作用的情况下，所述小分子CIS抑制剂是脱泛素酶抑制剂。

在一些实施方案中，任何上述治疗或预防方法还包括向受试者施用IL- 15或IL-15激动剂。

在其他实施方案中，任何上述治疗或预防方法还包括施用B-Raf蛋白激 酶抑制剂或MEK蛋白激酶抑制剂。

在一些实施方案中，任何上述治疗或预防方法还包括施用免疫治疗剂。 此类免疫治疗剂的实例包括但不限于针对程序性细胞死亡1受体(PD-1)的抗 体、针对程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体、针对细胞毒性T淋巴细胞相关 蛋白4(CTLA-4)的抗体、针对转化生长因子β(TGF-b)的抗体、针对Tactile (CD96)的抗体或它们的组合。在一些实施方案中，任何上述治疗可以另外包 括施用TGF-β受体拮抗剂。

在上述治疗或预防方法的一些实施方案中，受试者患有癌症或被确定为处于 患有癌症或感染的风险中。

在一些实施方案中，在受试者患有癌症的情况下，所述癌症的特征在于 肿瘤的存在。在一些实施方案中，在受试者患有癌症或处于患有癌症的风险 中的情况下，所述癌症是转移性黑素瘤、转移性前列腺癌、转移性乳腺癌、 三阴性乳腺癌、膀胱癌、脑癌、食道癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞肺癌、非 小细胞肺癌、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、肉瘤、肝细胞癌、多发 性骨髓瘤、胰腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、转移性肾细胞癌、白血病、卵巢癌和恶性胶质瘤。在一些优选的实施方案中，癌症是转移性黑 素瘤、转移性前列腺癌或转移性乳腺癌。在一些实施方案中，在受试者患有 癌症的情况下，所述受试者已接受癌症治疗相关的同种异体组织移植。

在其他实施方案中，在受试者患有感染或处于患有感染的风险中的情况 下，所述感染是病毒感染。在一些实施方案中，在受试者患有病毒感染的情 况下，所述病毒感染是通过单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、人巨细胞病 毒、流感病毒、痘病毒或乳头瘤病毒感染。

在另一个方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：

i)在存在测试剂的情况下使CIS或其片段与至少一种CIS结合配偶体 接触；以及

ii)确定所述测试剂是否与所述CIS蛋白结合配偶体竞争CIS或其片段 的结合；以及

iii)任选地，如果在步骤ii)中所述测试剂显示出与所述CIS蛋白结合配 偶体竞争CIS或其片段的结合，则将所述测试剂鉴定为CIS抑制剂。在一些 实施方案中，CIS结合配偶体选自JAK1、JAK3、IL-2Rβ、延伸蛋白B、延 伸蛋白C或滞蛋白5或其片段。

在一个相关方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：

i)使CIS或其片段与测试剂接触；以及

ii)确定所述测试剂是否结合至CIS或其片段。在一些实施方案中，该 方法还包括确定所述测试剂是否与CIS PEST结构域肽或CIS N-末端肽竞争 CIS或其片段的结合。在一些实施方案中，CIS PEST结构域肽的序列选自 SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37。在一些实 施方案中，N-末端肽的序列选自SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34。

在另一个相关方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包 括：

i)在存在以下物质的情况下，体外温育磷酸化JAK1蛋白或其CIS结合 片段：

(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B；和延伸蛋白C；

(b)泛素化混合物；以及

(c)测试剂；以及

ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下CIS诱导的泛素化的水平，确 定所述测试剂是否抑制CIS诱导的所述磷酸化JAK1蛋白或片段泛素化。在 一些实施方案中，泛素化混合物包含：滞蛋白5、Rbx2、E1、E2和游离的泛 素。

在另一个相关方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包 括：

i)在存在以下物质的情况下，体外温育包含JH1激酶结构域的JAK1蛋 白或其片段：

(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少 SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B；和延伸蛋白C；

(b)JAK1激酶底物；以及

(c)测试剂；以及

ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下所述JAK1激酶底物的磷酸化， 确定所述测试剂是否增加所述JAK1激酶底物的磷酸化。在一些实施方案中， JAK1激酶底物是STAT5蛋白或STAT5肽。

在另一个相关方面，本发明提供一种用于计算机模拟鉴定CIS抑制剂的 方法，其包括：

i)生成CIS或其片段的三维结构模型；以及

ii)计算机模拟设计或筛选结合至建模结构的测试剂。在一些实施方案 中，三维结构模型是CIS或其片段结合至JAK1蛋白或其CIS结合片段；或 JAK3蛋白或其CIS结合片段的复合物。

在另一个相关方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包 括：

i)提供表达CIS的细胞；以及

ii)与未接触所述测试剂的细胞相比，确定所述测试剂是否降低所述细 胞中的CIS活性。在一些实施方案中，待评估的CIS活性是JAK1激酶活性 的抑制、STAT5酪氨酸磷酸化的抑制、STAT5启动子活性的下调或JAK1降 解的增加。在一些实施方案中，该方法所用的细胞是NK细胞。在一些实施 方案中，在所用的细胞是NK细胞的情况下，步骤ii)包括确定测试剂在NK 细胞中对IL 15可诱导应答的作用。在一些实施方案中，IL-15可诱导应答是 NK细胞增殖、干扰素-γ(IFN-γ)产生、细胞内粒酶表达、JAK1酪氨酸磷酸化、 JAK1降解、基因表达的调节或细胞毒性。

在一些实施方案中，用于基于细胞的筛选方法的测试剂此前在所述任何 其他CIS抑制剂鉴定方法中被确定为候选CIS抑制剂。

在任何上述鉴定CIS抑制剂的方法的一些实施方案中，测试剂是肽、肽 模拟物、小分子、多核苷酸或多肽。

在任何上述鉴定CIS抑制剂的方法的一些实施方案中，CIS或其片段的 氨基酸序列包括与SEQ ID NO:6-10中的任一者具有至少80％同一性的氨基 酸序列。

在另一个方面，本发明提供CIS抑制剂在制造治疗或预防受试者中的 NK细胞应答性病症的药物中的用途。

在另一个方面，本发明提供CIS抑制性NK细胞在制造治疗或预防受试 者中的NK细胞应答性病症的药物中的用途。

在另一个方面，本发明提供CIS抑制剂作为治疗或预防受试者中的NK 细胞应答性病症的药物的用途。

在另一个方面，本发明提供CIS抑制性NK细胞作为治疗或预防受试者 中的NK细胞应答性病症的药物的用途。

在另一个方面，本发明提供用于治疗或预防NK细胞应答性病症的CIS 抑制剂。

在又一个方面，本发明提供用于确定患有肿瘤的患者中对CIS抑制的治 疗应答的可能性的方法，所述方法包括确定肿瘤微环境中IL-15的水平，其 中肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水平升高表示对治疗应答 的可能性提高。

在一个相关方面，本发明提供一种评估诱导患有肿瘤的受试者中的肿瘤 侵润性NK细胞中的Cish表达升高的方法，所述方法包括确定肿瘤微环境 中IL-15的水平，其中肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水平 升高表示诱导肿瘤侵润性NK细胞中的Cish表达升高。

还提供一种用于增加NK细胞对IL-15的应答的方法，所述方法包括抑 制NK细胞中的CIS。在一个实施方案中，这种方法包括向受试者施用CIS 抑制剂。在另一个实施方案中，用于增加NK细胞对IL-15的应答的方法包 括降低NK细胞中CIS的表达。在一些实施方案中，CIS表达的降低在离体 NK细胞中进行。在其他实施方案中，CIS表达的降低在体内NK细胞中(例 如，在人受试者中)。除非另外特别说明，本文的任何实施方案都应被认 为对任何其他实施方案施加必要的修改。例如，如技术人员将理解，上文概 述的用于本发明的方法的抑制剂和健康病症的实例同样适用于本发明的用 途和药物组合物。

本发明在范围上不受本文描述的具体实施方案的限制，这些实施方案仅 仅是为了举例说明的目的。如本文所述，功能上等同的产品、组合物和方法 显然在本发明的范围内。

贯穿本说明书，除非另外特别说明或上下文另有要求，否则提及单个步 骤、物质的组合物、步骤组或物质的组合物组应被认为涵盖一个和许多个(即 一个或多个)这些步骤、物质的组成、步骤组或物质的组合物组。

下文通过以下非限制性实施例并参考附图来描述本发明。

附图说明

图1为CIS缺陷型NK细胞显示出响应于IL-15的优异的增殖、存活率 和杀死作用。(a)洗涤培养的野生型NK细胞并使其缺乏IL-15，然后与50ng ml

图2为CIS通过靶向JAK/STAT信号传导来负调节IL-15信号传导。(a) 纯化Cish

图3为CIS结合至JAK活化环以抑制JAK1激酶活性并靶向该JAK1激 酶以进行蛋白酶体降解。(a)使用等温量热法(ITC)测定hCIS-SH2-BC结合至 对应于JAK1/3激酶结构域活化环和IL-2Rβ胞质结构域内的酪氨酸的磷酸肽 的亲和力。结果列表视图示出了两个独立的实验的平均值±S.D.。N.D.＝未检 出，p＝磷酸化的。(b和c)Flag标记的JAK1和JAK3在293T细胞中与Flag 标记的CIS、SOCS1、SOCS3或CIS突变体一起表达，其中SOCS框中的 SH2结构域(mSH2；R107K)或滞蛋白-5结合位点已突变(mSB； P241A/L242A/P243A)。在一些例子中，用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞。 裂解细胞并使用抗FLAG-珠免疫沉淀蛋白质，然后与抗体一起进行蛋白质印 迹以检测磷酸化(p)JAK1和JAK3。蛋白质表达水平以全细胞裂解物的抗 FLAG印迹显示(下图)。(d)使FLAG标记的JAK1和CIS在293T细胞中共 表达，并使用抗CIS(左上图)或抗JAK1抗体(右上图)免疫沉淀(IP)。与抗 FLAG抗体一起进行的蛋白质印迹揭示，在每个例子中都存在特定的CIS- JAK复合物(上图)。蛋白质水平在下图中以细胞裂解物的抗FLAG印迹显示。 (e)使用无细胞系统，在存在(+)和不存在(-)CIS-E3连接酶复合物(CIS-SH2- BC与滞蛋白5和Rbx2)的情况下，将FLAG-JAK1与泛素、E1和E2酶一起 在37℃下温育指定时间。通过与磷酸化JAK1的抗体一起进行蛋白质印迹来 使JAK1泛素化可视化。(f)使用全部四种JAK和CIS、SOCS1、SOCS2或 SOCS3的激酶结构域(JH1)进行激酶抑制测定。CIS优先抑制JAK1 JH1活性 (上图)，而SOCS1、SOCS3和CIS抑制JAK1 JH1活性达到不同的程度(下 图)。数据归一化为非CIS对照。插入表格：IC

图4为Cish的丧失控制实验性肺肿瘤转移。给Cish

图5为Cish缺陷型小鼠中NK、T细胞、Treg、ILC2和调节T细胞的分 析。(a)在IL-15中培养Cish

图6为Socs1和/或Socs3的丧失不改变NK细胞中的IL-15应答。(a)通 过管饲法用4-羟基三苯氧胺(4-OHT；诱导Socs3缺失)处理Socs3

图7为体外培养的和离体的Cish

图8为Cish

图9为CIS靶向JAK和IL-2R复合物。(a)将来自野生型和Cish

图10为保护Cish

图11为CIS N-末端区或PEST的缺失增强了CIS抑制JAK1激酶活性 的能力，并且CIS-SH2与磷酸肽的相互作用对于JAK1激酶活性的CIS抑制 是必须的。在存在增加量的人全长CIS(CIS)、缺乏PEST基序(ΔPEST)的CIS、 缺乏N-末端区和PEST基序(ΔNT/ΔPEST)二者的CIS、或缺乏N-末端34个 残基(ΔN34)的CIS，不存在(a)或存在(b)过量磷酸苯酯(PP)作为竞争剂的情况 下，使用JAK1的激酶结构域(JH1)进行激酶抑制测定。(c)或者，将50μMJAK1-Y1034或JAK3-Y980、Y981磷酸肽用作竞争剂。数据归一化为非CIS 对照。所有CIS构造含有SOCS框，并且以由CIS、延伸蛋白B和延伸蛋白 C构成的三聚复合物表达和纯化。插图：表格示出了(a)的IC50值。

图12为CIS N-末端区或PEST基序的缺失不对与磷酸肽的结合具有主 要影响。使用等温量热法(ITC)测定(a)人全长CIS、缺乏PEST基序(ΔPEST) 的CIS、缺乏N-末端区和PEST基序(ΔNT/ΔPEST)二者的CIS，或缺乏N-末 端34个残基(ΔN34)的CIS结合至对应于JAK1激酶结构域活化环内的酪氨 酸的磷酸肽(JAK1-Y1034)的亲和力。(b)人全长CIS和CISΔNT/ΔPEST结合 至对应于JAK3激酶结构域活化环内的酪氨酸的磷酸肽(JAK3-Y980、Y981) 的亲和力。将300μM磷酸肽滴定至30μM GST-CIS-SH2-BC三元复合物溶液 中。示出了ITC滴定曲线。滴定曲线均很好地拟合单点模型。

图13为CIS-SH2结构域结合至延伸的肽界面。使用等温量热法(ITC)测 定缺乏N-末端区和PEST基序(ΔNT/ΔPEST)二者的CIS结合至对应于JAK1 激酶结构域活化环内的酪氨酸的磷酸肽(JAK1-Y1034)的亲和力。肽为野生型 的或在+5、+3或-3位置含有丙氨酸置换。将300μM磷酸肽滴定至30μM GST- CIS-SH2-BC三元复合物溶液中。示出了ITC滴定曲线。滴定曲线均很好地 拟合单点模型。

图14为CIS抑制是剂量依赖性的并且需要功能SH2结构域。(a)从Cish

图15为CIS诱导的动力学与人NK细胞中JAK/STAT信号传导的抑制 一致。将患者来源的人NK细胞(a)或NK淋巴细胞系(b)SNK-10、(c)NKL和 NK6、(d)NK-92洗涤至不含细胞因子并静置4h(a)或16h(b-d)，然后用IL- 15处理指定时间。在一些例子中，用蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)温育细 胞。裂解细胞并与指定的磷酸化(p)和总蛋白的抗体一起进行免疫印迹分析。

图16为Cish mRNA诱导的动力学与人NK细胞中JAK/STAT信号传导 的抑制一致。将人NK淋巴细胞系KHYG-1(a-c)和NK-92(D-F)洗涤至不含 细胞因子并静置过夜，然后用IL-15处理指定时间。裂解细胞并通过实时定 量PCR(Q-PCR)分析Cish、Socs1、Socs3 mRNA表达。通过将每个所关注的 基因的量归一化为管家基因18s核糖体RNA来确定相对表达。每种情况有 三个生物学重复且测定一式两份进行。

图17为汇总通过质谱鉴定泛素化(U)和磷酸化(P)位点的示意图。P＝磷酸 化，U＝泛素化，*表示在小鼠和人CIS之间保守的残基。将FLAG标记的小 鼠CIS在293T细胞中表达，并使用抗FLAG抗体通过亲和力富集纯化，然 后用胰蛋白酶消化并进行LC-MS/MS分析。粗体圆圈表示本研究中鉴定的 残基。Jensik等人，2015报道了其他泛素化位点。

图18为TGFβ在野生型中阻断IL-15驱动的增殖，但在CIS缺陷型NK 细胞中则不阻断。用CFSE标记来自野生型(WT)、TGFβRII缺陷型(TgfRII

图19为TGFβ或BRAF(B-Raf蛋白激酶)抑制以及Cish缺失优于单独或 联合处理。给Cish

图20为组合Cish缺陷和检查点抑制剂或细胞因子刺激显示出改善的抗 转移作用。(A)给5-6只B6.WT(Cish

图21为组合Cish缺陷和BRAF或MEK激酶抑制剂显示出改善的抗转 移作用。给5-10只B6.WT(Cish

图22为保护Cish缺陷型小鼠免于MCA诱导的肿瘤发展。(A)给15只 B6.WT(Cish

图23为Cish缺陷型小鼠示出了急性骨髓性白血病模型中的增强存活率。 给Cish

图24为NK细胞中CIS功能的丧失导致在体内针对更成熟的体内NK 细胞的增强周转和分化。从Cish

图25为MCA1956肉瘤的增强控制需要NK细胞和CD8 T细胞二者。 给6-7只B6.WT(WT；Cish

图26为Cish

图27为Cish

图28为肿瘤和肿瘤微环境中的IL-15水平调节驻留的NK细胞中的Cish 表达水平。IL-15

SEQ ID NO:1 JAK1活化环磷酸肽

SEQ ID NO:2 JAK1磷酸模拟肽

SEQ ID NO:3 IL-2Rβ磷酸肽

SEQ ID NO:4 IL-2Rβ磷酸肽

SEQ ID NO:5 IL-2Rβ磷酸肽

SEQ ID NO:6 人CIS蛋白同种型1

SEQ ID NO:7 人CIS蛋白同种型1片段

SEQ ID NO:8 人CIS蛋白同种型1SOCS框

SEQ ID NO:9 小鼠(Mus musculus)CIS蛋白同种型1

SEQ ID NO:10 褐鼠(Rattus norvegicus)CIS蛋白

SEQ ID NO:11 智人(Homo sapiens)JAK1蛋白

SEQ ID NO:12 智人JAK3蛋白

SEQ ID NO:13 智人IL-2受体亚基β前体

SEQ ID NO:14 智人延伸蛋白B

SEQ ID NO:15 智人延伸蛋白C

SEQ ID NO:16 智人滞蛋白-5

SEQ ID NO:17 智人JAK1蛋白JH1激酶结构域肽

SEQ ID NO:18 STAT5b肽

SEQ ID NO:19 JAK1肽

SEQ ID NO:20 JAK3肽

SEQ ID NO:21 IL-2Rβ磷酸肽

SEQ ID NO:22 IL-2Rβ磷酸肽

SEQ ID NO:23 mIL-2Rβ磷酸肽

SEQ ID NO:24 IL2Rβ磷酸肽

SEQ ID NO:25 IL2Rγ磷酸肽

SEQ ID NO:26 IL2Rγ磷酸肽

SEQ ID NO:27 IL2Rγ磷酸肽

SEQ ID NO:28 IL2Rγ磷酸肽

SEQ ID NO:29 CIS PEST结构域肽

SEQ ID NO:30 CIS PEST结构域磷酸肽

SEQ ID NO:31 CIS N-末端磷酸肽

SEQ ID NO:32 CIS PEST结构域磷酸肽

SEQ ID NO:33 CIS SH2/SB结构域磷酸肽

SEQ ID NO:34 CIS N-末端糖基化肽

SEQ ID NO:35 CIS SH2糖基化肽

SEQ ID NO:36 CIS SH2糖基化肽

SEQ ID NO:37 CIS PEST糖基化肽

SEQ ID NO:38 CIS SH2/SB结构域糖基化肽

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

除非另外特别定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都应被认为具 有该领域中(例如，细胞培养、细胞生物学、分子遗传学、癌症生物学及其治 疗、传染病特别是急性感染、免疫学、药理学、蛋白质化学和生物化学中)的 普通技术人员通常所理解的相同的含义。

除非另外说明，否则本发明中使用的细胞培养和免疫学技术是本领域的 技术人员熟知的标准程序。此类技术在以下各原始文献中有所描述和解释： 诸如J.Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons (1984)，J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编),Essential Molecular Biology: A Practical Approach,第1卷和第2卷,IRL Press(1991),D.M.Glover和 B.D.Hames(编),DNA Cloning:A PracticalApproach,第1-4卷,IRL Press(1995 和1996)，以及F.M.Ausubel等人(编),CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括目前所有最新版本)， Ed Harlow和David Lane(编)Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)，以及J.E.Coligan等人(编)CurrentProtocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括目前所有最新版本)。

如本文所用，除非说明与此相反，否则术语约是指指定值的+/-10％，更 优选地+/-5％。

贯穿本说明书，词语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变化将被理解为意 味着包括所陈述的要素、整体或步骤或要素、整体或步骤组，但不排除任何 其他要素、整体或步骤或要素、整体或步骤组。

如本申请所用，术语“或”旨在意指包含性的“或”而非排他性的“或”。也 就是说，除非另外指明或上下文明确指出，“X使用A或B”旨在意指任何自 然的包含性排列。也就是说，如果X使用A；X使用B；或X使用A和B 二者，则在任何上述情况下满足“X使用A或B”。另外，A和B中的至少一 者和/或同样的用法通常意指A或B或者A和B二者。此外，除非另外指明 或上下文明确指出涉及单数形式，否则本申请和所附权利要求中使用的冠词 “一个”和“一种”通常可以被解释为意指“一个(种)或多个(种)”。

如本文所用，术语“CIS抑制剂”是指抑制NK细胞中的CIS信号传导活 性的任何试剂。此类试剂可以通过任何许多不同的作用模式用于特异性降低 NK细胞中的CIS信号传导活性，所述作用模式包括但不限于降低CIS蛋白 的总水平(诸如通过降低CIS mRNA水平)，抑制其与靶蛋白(例如，JAK1)的 结合或其与信号传导复合物结合配偶体(诸如延伸蛋白B和延伸蛋白C)的相 互作用。如本文所用，特别排除在“CIS抑制剂”之外的是广泛或全局影响除 CIS之外的蛋白质(例如，烷基化剂或交联剂)或抑制基本细胞过程例如翻译 (例如，翻译抑制剂)或非选择性地改变蛋白质降解的试剂。CIS抑制剂的实 例包括例如多核苷酸(例如，siRNA和mRNA)、小分子、肽、多肽或其组合。 在一些实施方案中，一种或多种此类CIS抑制剂与递送和/或靶向剂联合使 用，例如包括纳米粒子介导的递送。

如本文所用，术语“竞争性抑制剂”或“竞争性抑制”是指靶蛋白的抑制模 式，其中抑制剂结合至靶蛋白本身(例如，配体结合位点)上或靶蛋白的配体 (例如，结合配偶体蛋白)上的功能关键位点，从而使蛋白质靶标与配体发生 空间位阻相互作用。竞争性抑制剂可以但不必对其竞争的生物学活性位点具 有更高的亲和力。

如本文所用，术语“CIS抑制性NK细胞”是指其中CIS活性受到许多单 独或联合策略中的任一个的抑制的NK细胞。例如，CIS抑制性NK细胞包 括但不限于其中Cish基因已经诸如通过基因编辑而遗传缺失或修饰的 Cish“敲除”NK细胞；其中CIS蛋白的表达已经通过使用基因沉默策略(例如， 使用siRNA或RNAi)或显性阴性CIS序列变体或显性阴性CIS片段的表达 而降低的CIS蛋白“敲低”NK细胞；或者，CIS抑制性NK细胞是已暴露至 CIS抑制剂(例如，小分子化合物、肽或肽模拟剂)的NK细胞，所述CIS抑 制剂抑制CIS的活性，例如通过抑制其与靶蛋白(例如，JAK1)的结合或其与 信号传导复合物结合配偶体(诸如延伸蛋白B和延伸蛋白C或滞蛋白-5)的相 互作用。或者，CIS抑制剂可以是来源于CIS的肽或片段，其以反式作用抑 制CIS活性。在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞例如通过遗传修饰来 进行不可逆CIS抑制。在其他实施方案中，CIS抑制性NK细胞是可逆CIS 抑制的，以使得细胞中的CIS抑制随时间的推移而减少。

如本文所用，术语“片段”是指保留至少一个功能或结构域的蛋白质的生 物学活性部分(例如，CIS片段)。例如，CIS片段可以包括SH2结构域和SOCS 框，并且JAK1片段可以包括JH1激酶结构域。在一些情况下，片段的活性 是指其特异性结合至结合配偶体(例如，蛋白质或其片段)的能力。如本文所 用，“片段”不涵盖全长蛋白质。

如本文所用，术语“NK细胞应答性病症”是指适合于通过一种或多种NK 细胞活性(例如，NK细胞细胞毒性诱导的肿瘤细胞死亡或感染细胞的死亡， 以及干扰素-γ(IFN-γ)的产生)来有效治疗的病症。NK细胞应答性病症的实例 包括但不限于癌症(例如，黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌和肝癌)和感染，诸如 病毒感染(例如，HSV、肝炎病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、黄病毒和HIV- 1感染)、细菌感染(例如，分枝杆菌(Mycobacteria)、李斯特菌(Listeria)和葡萄 球菌(Staphylococcus)感染)和原生动物感染(例如，疟原虫(Plasmodium)感染) 和真菌感染(例如，曲霉(Aspergillus)感染)。

如本文所用，术语“肽”是指在两个至约五十个氨基酸(例如，长度为4、 6、8、10、12、15、20、25、30、35、40或45个氨基酸)范围内的氨基酸聚 合物。术语肽涵盖未修饰的肽、磷酸化肽(例如，磷酸肽)二者，以及其他化 学衍生的肽，但不涵盖肽模拟物，

如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”是指通常长度大于约50个氨基酸 并且通常具有表特征性二级和三级结构的氨基酸聚合物。

如技术人员所理解，CIS抑制剂和CIS抑制性NK细胞将以治疗有效量 施用。如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指将在一定程度上减轻 待治疗的疾病或病症的一个或多个症状的所施用的CIS抑制剂的足够量。结 果可以是疾病的征兆、症状或病因的减少和/或缓解或者生物系统的任何其他 所需改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供疾病症状的临床显著性减 少而没有过度的不良副作用所需的CIS抑制剂的量。在任何个别情况下，适 当的“有效量”可以使用技术，诸如剂量递增研究来确定。术语“治疗有效量” 包括例如预防有效量。CIS抑制剂的“有效量”是有效实现所需药理学作用或 治疗改善而没有过度的不良副作用的量。应当理解，由于受试者的年龄、体 重、一般状况、待治疗的病症、待治疗的病症的严重性以及处方医师的判断 中的任一者的化合物的代谢变化，“有效量”或“治疗有效量”可以因受试者而 异。仅作为例子，治疗有效量可以通过常规实验，包括但不限于剂量递增临 床试验来确定。在多于一种治疗剂联合使用的情况下，每种治疗剂的“治疗有 效量”可以指当单独使用时可为治疗有效的治疗剂的量，或可以指由于其与 一种或多种另外的治疗剂联合而为治疗有效的减少量。

如本文所用，术语“小分子”是指分子量小于2000道尔顿的分子。

如本文所用，术语“化学修饰的mRNA”或“化学修饰的siRNA”是指体外 生成的合成RNA，其中至少一种类型的核苷酸例如胞嘧啶的一部分(例如， 10％、30％、50％或100％)被化学修饰为增加其在细胞内或者体内的稳定性。 例如，在一些情况下，修饰的胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。此类多核苷酸特别适 用于在体内递送/转染至细胞，特别是当与转染/递送剂组合时。在一些情况 下，化学修饰的mRNA是其中大部分(例如，全部)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶， 并且其中大部分(例如，全部)尿嘧啶是假尿嘧啶的化学修饰的mRNA。此类 修饰的RNA的合成和使用在例如WO 2011/130624中有所描述。

如本文所用，术语“治疗”或“医治”是指由医学专业人员直接治疗受试者 (例如，通过向受试者施用治疗剂)或由至少一方(例如，医生、护士、药剂师 或药物销售代表)通过提供任何形式的指示而实现的间接治疗二者，所述指 示(i)教导受试者根据受权利要求保护的方法自我治疗(例如，自我施用药物) 或(ii)教导第三方根据受权利要求保护的方法治疗受试者。术语“治疗”或“医 治”的含义还涵盖预防或减少待治疗的疾病，例如通过在疾病的足够早期施 用治疗剂，以预防或减缓其进展。

如本文所用，术语“处于风险中”是指发展健康病症的可能性高于一般群 体。因此，治疗被视为“处于”特定病症的“风险中”的个体被设计为防止受试 者发展病症或至少使发展病症的风险降低至不高于作为一个整体的一般群 体中存在的水平。

如本文所用，术语“共施用”等等意指涵盖向单个患者施用选定的治疗剂， 并且旨在包括其中药剂通过相同的或不同的施用途径或者在相同的或不同 的时间施用的治疗方案。

本文所述的方法包括通过施用治疗或预防有效量的CIS抑制剂来治疗 患有NK细胞应答性病症或处于患有NK应答性病症的风险中的受试者。如 本文所述，CIS(UniprotKBQ9NSE2)在NK细胞中充当IL-15诱导的应答的 强效检查点抑制剂。不受理论的束缚，据信抑制NK细胞中CIS的功能，极 大地增强了这些细胞对IL-15的敏感性，并维持其活化以实现治疗作用。

在其他实施方案中，用于过继性细胞疗法的方法包括向患有NK细胞应 答性病症的受试者施用CIS抑制性NK细胞。

在一些实施方案中，患有NK细胞应答性病症或处于患有NK细胞应答 性病症的风险中的受试者患有增殖性病状诸如癌症。在一些实施方案中，患 有癌症的受试者所患有的癌症的特征在于受试者中存在一种或多种肿瘤。适 用于通过本发明的方法治疗的癌症的实例包括但不限于以下癌症：转移性黑 素瘤、转移性前列腺癌、转移性乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、脑癌、食 道癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞肺癌、非小细胞肺癌、梅克尔细胞癌、肉瘤、 肝细胞癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、转 移性肾细胞癌、白血病、卵巢癌和恶性胶质瘤。在一些优选的实施方案中， 癌症是转移性黑素瘤、转移性前列腺癌或转移性乳腺癌。在一些实施方案中， 受试者已接受癌症治疗相关的同种异体组织移植，例如在用于治疗白血病的 造血干细胞移植之后。

本文还描述了一种用于通过抑制NK细胞中的CIS来增加NK细胞对 IL-15的应答的方法。在一些实施方案中，NK细胞对IL-15的应答通过抑制 离体NK细胞中的CIS(例如，在培养的NK细胞中)来增加。在其他实施方 案中，NK细胞对IL-15的应答通过抑制体内NK细胞中的CIS，例如通过向 受试者施用CIS抑制剂来增加。在一些实施方案中，这种方法包括降低离体NK细胞中的CIS的表达。任选地，其中离体CIS表达降低的NK细胞可以 是来源于受试者并且随后在离体CIS表达降低后移植到供体患者的自体NK 细胞。在其他实施方案中，NK细胞可以是同种异体的NK细胞，即从不同 于受体受试者的供体来源获得。在一些实施方案中，受试者是癌症患者。在 其他实施方案中，受试者是NK细胞供体。任选地，此类方法可以包括使离 体或体内NK细胞与外源性IL-15接触。

如本文所公开，IL-15诱导作为负反馈环的一部分的Cish表达，该负反 馈环减少对肿瘤的NK细胞免疫应答。如本文所公开，在微环境中的IL-15 的水平升高的情况下，特定肿瘤/肿瘤类型肿瘤侵润性NK细胞中的Cish表 达也增加。虽然不希望受理论的束缚，但据信肿瘤侵润性NK细胞中Cish表 达增加表示Cish抑制将在增强对肿瘤的NK介导的免疫应答中有效的可能 性增加。因此，在一些实施方案中，在患有肿瘤的患者中，对通过患者中的Cish抑制治疗的应答的可能性通过确定肿瘤微环境中IL-15的水平(例如，通 过肿瘤活检)来评估，其中肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水 平升高表示对治疗应答的可能性提高。

类似地，在一些实施方案中，患有肿瘤的受试者中的肿瘤侵润性NK细 胞中的Cish表达升高的诱导通过确定肿瘤微环境中IL-15的水平来测定，其 中肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水平升高表示诱导肿瘤侵 润性NK细胞中的Cish表达升高。

IL-15的“阈值”水平可以根据例如IL-15的对照组织水平的比较来确定。 合适的阈值水平可以由技术人员使用常规实验容易地确定。

在其他实施方案中，待治疗的受试者患有感染。在一些实施方案中，待 治疗的感染是病毒感染，包括但不限于单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、 人巨细胞病毒、流感病毒、痘病毒或乳头瘤病毒感染。在其他实施方案中， 患有NK细胞应答性病症的受试者患有细菌感染，例如分枝杆菌、李斯特菌 或葡萄球菌感染。在其他实施方案中，待治疗的受试者患有原生动物感染(例 如，疟原虫感染)。在另外的实施方案中，待治疗的受试者患有真菌感染(例 如，曲霉感染)。

如本文所用，术语“受试者”可以是任何动物。在一个实例中，动物是脊 椎动物。例如，动物可以是哺乳动物、鸟类、脊索动物、两栖动物或爬行动 物。示例性受试者包括但不限于人、灵长类、家畜(例如绵羊、奶牛、鸡、马、 驴、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚 鼠、仓鼠)、圈养野生动物(例如狐狸、鹿)。在一个实例中，哺乳动物是人。

每个上述病症的症状、诊断试验和预后试验是本领域已知的。参见例如Harrison's Principles of Internal

许多动物模型用于建立用于治疗任何前述NK应答性病症的CIS抑制剂 的一系列治疗有效剂量。例如，已建立许多小鼠癌症模型，例如黑素瘤模型 (Walker等人，2011)、前列腺癌模型(Grabowska等人，2014)和乳腺癌模型 (Borowsky，2011)。

如本文所用，CIS抑制是指减少净Cish基因表达、净CIS蛋白水平或 CIS活性中的一者或多者(例如，其对JAK1激酶活性的抑制或其靶向JAK1 以进行蛋白酶解)。CIS的抑制可以包括CIS活性水平在存在给定剂量的CIS 抑制剂的情况下或由给定剂量的CIS抑制剂产生的，相对于其不存在的情况 下的CIS活性水平降低至少约10％至100％，例如，10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或CIS活性降低约10％至约100％ 的其他百分比。在一些实施方案中，向待治疗的受试者施用CIS抑制剂。在 其他实施方案中，将CIS抑制剂离体施用于NK细胞，以获得CIS抑制性 NK细胞，随后将CIS抑制性NK细胞作为治疗剂向受试者施用。在一些实 施方案中，CIS抑制剂是可逆CIS抑制剂。在其他实施方案中，CIS抑制剂 是不可逆CIS抑制剂。

用于本发明的CIS抑制剂的类型的实例包括但不限于肽、肽模拟物、小 分子、多核苷酸或多肽。

肽

在一些实施方案中，用于治疗方法的CIS抑制剂是肽。合适的肽可以抑 制CIS增加JAK1的泛素化的能力和/或抑制CIS降低JAK1激酶的酶活性， 例如其靶蛋白的磷酸化的能力。在一些实施方案中，肽是磷酸肽，其结合至 CIS从而竞争性抑制CIS与内源性磷酸化靶蛋白相互作用的能力。在一些实 施方案中，磷酸肽来源于JAK1活化环的氨基酸序列，并且对应于JAK1的 氨基酸1027-1042(活化环序列如下所示)，其中Tyr1034是磷酸化的：

(SEQ ID NO：1)A

或者，肽可以是JAK1活化环磷酸模拟肽，诸如(SEQ ID NO:2)K

在其他实施方案中，肽是磷酸肽或磷酸模拟肽，其序列来源于IL- 2Rβ(GenBank登录号NP_000869.1)的胞质结构域。例如：

(SEQ ID NO：3)C

(SEQ ID NO：4)Y

(SEQ ID NO：5)D

在一些实施方案中，肽CIS抑制剂是包含SEQ ID NO:1-5中的一个的氨 基酸序列的磷酸肽或磷酸模拟肽。在其他实施方案中，肽CIS抑制剂的氨基 酸序列由SEQ ID NO:1-5中的一个构成。

根据传统肽合成方法，本发明的方法中所用的肽可以通过肽合成的多种 合成方法，经由一个或多个氨基酸残基的缩合反应来制备。优选地，肽根据 标准固相方法合成，诸如可以根据制造商的指示在Applied Biosystems Model 430A肽合成仪(AppliedBiosystems,Foster City,Calif.)上进行。其他合成肽的 方法(通过固相方法或在液相中)是本领域的技术人员熟知的。当利用固相合 成时，C-末端氨基酸连接至不溶性树脂载体，该树脂载体可以通过与C-末端 氨基酸中的羧基基团反应生成可分离的键。例如，在一些情况下，所用的不 溶性树脂载体是对羟甲基苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)树脂。其他有用的树脂 包括但不限于：用于合成一些含N-甲基的肽的苯乙酰胺甲基(PAM)树脂(该 树脂与固相合成的Boc方法一起使用)；和用于生成具有C-末端酰胺基团的 肽的MBHA(对甲基二苯甲基胺)树脂。在肽合成的过程中，支链氨基和羧基 基团可以根据需要使用熟知的保护基团保护/去保护。在一些实施方案中，使 用碱不稳定的9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团或叔丁氧羰基(Boc基团)来保护N-α- 氨基基团。与Fmoc合成一致的侧链官能团可以使用以下指定的保护基团保 护：精氨酸(2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基)；天冬酰胺(O-叔丁基酯)；半胱氨 酸谷氨酰胺和组氨酸(三苯甲基)；赖氨酸(叔丁氧羰基)；丝氨酸和酪氨酸(叔 丁基)。利用肽和肽衍生物的替代保护基团的修饰将是本领域的技术人员显 而易见的。

肽模拟物

在一些实施方案中，CIS抑制剂是肽模拟物。所有肽都对体内酶促降解 敏感。所以，保持或甚至增强基本肽的生物学活性，但具有更大的循环半衰 期的肽模拟物用于本发明的治疗方法是特别有利的。肽模拟物，例如基于具 有SEQ ID NO:1-5中的任一个的氨基酸序列的肽的肽模拟物，所需的磷酸模 拟物修饰可以通过非发酵方法容易地大量合成。

虽然肽主链的特征在于一个或多个内部肽键，但肽将具有连接每个氨基 酸残基的肽键。因此，其中一个或多个酰胺键已被可替代接头替代但保留其 中至少一个酰胺键的化合物被视为肽模拟物。

肽模拟物主链通常将为直链的或模拟肽主链的稠合环状基团的直链。

肽模拟物通常的特征在于保持其肽等同物的极性、三维大小和功能(生 物活性)，但其中肽键已被替代，通常被更稳定的键替代。所谓“稳定”意指更 耐受水解酶的酶促降解。通常，替代酰胺键的键(酰胺键替代物)保留了酰胺 键的很多性质，例如构象、空间位阻、静电特性、形成氢键的可能性等。"Drug Design and Development",Krogsgaard,Larsen,Liljefors和Madsen(编)1996, Horwood Acad.Pub的第14章提供了肽模拟物的设计和合成的现有技术的一 般性讨论。合适的酰胺键替代物包括：N-烷基化、逆反酰胺、硫代酰胺、硫 酯、膦酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、氟乙烯基、乙烯基、亚甲基氨基、亚 甲基硫基、烷烃和磺酰胺基。

肽和肽模拟物通常将具有长度为4至20个，优选地7至16个原子的主 链。具有这些范围的上端值的主链的分子通常将包括β和/或γ氨基酸或其 等同物。

在一些实施方案中，肽模拟物将根据CIS自体抑制肽序列衍生。在一些 实施方案中，CIS自体抑制肽序列是PEST肽序列，例如选自SEQ ID NO:29、 30、32和37的肽序列。在其他实施方案中，CIS自体抑制肽序列是CIS N- 末端肽序列，例如选自SEQ ID NO:31和34。

小分子

在一些实施方案中，CIS抑制剂是小分子。在一些实施方案中，小分子 特异性结合至CIS并降低其活性，例如CIS与结合配偶体或靶蛋白的相互作 用。用于本发明的合适的小分子CIS抑制剂可以使用本文定义的筛选方法鉴 定。例如，化合物可以结合至CIS的Src同源2(SH2)结构域(人CIS的氨基 酸66-216；UniprotKB Q9NSE2；和SEQ ID NO:6)、SOCS框6)或CIS的N- 末端区(氨基酸1-65)。

在一些实施方案中，所施用的化合物可以是前体化合物，通常称为“前 药”，它是无活性的或活性相当低的，但在施用后，其转化(即，代谢)为活性 CIS抑制剂。在那些实施方案中，所施用的化合物可以称为前药。作为另外 一种选择或除此之外，所施用的化合物可以代谢生成活性代谢物，与缺乏该 化合物的同基因细胞相比，所述活性代谢物具有降低细胞群中CIS表达活性 的活性。此类活性代谢物的使用也在本公开的范围内。

根据化合物中存在的取代基，化合物可以任选地以盐的形式存在。适用 于所述方法的化合物的盐是其中抗衡离子是药学上可接受的那些盐。合适的 盐包括与有机或无机酸或碱形成的那些盐。具体地讲，与酸形成的合适的盐 包括与无机酸、强有机羧酸，或与有机磺酸形成的那些盐，所述强有机羧酸 诸如具有未取代的或取代的(例如被卤素取代的)1至4个碳原子的烷烃羧酸， 诸如饱和的或不饱和的二羧酸，诸如羟基羧酸，诸如氨基酸，所述有机磺酸 诸如取代的或未取代的(例如被卤素取代的)(C

有机和/或药物化学领域的技术人员将会理解，很多有机化合物可以与溶 剂形成络合物，其中它们与溶剂反应或从溶剂中沉积或结晶。这些络合物称 为“溶剂化物”。例如，与水形成的络合物称为“水合物”。当药物物质掺入溶 剂诸如水时，溶剂化物(诸如水合物)以化学计量或非化学计量的量存在于晶 格中。以常规方式筛选以溶剂化物(诸如水合物)存在的药物物质，因为这些 药物物质可能会在任何阶段遇到。因此，可以理解，用于本发明的化合物可 以以溶剂化物(诸如水合物)的形式存在。适用于本发明的化合物的溶剂化物形式是其中缔合的溶剂是药学上可接受的那些。例如，水合物是药学上可接 受的溶剂化物的实例。

用于本发明的化合物可以以无定形形式或结晶形式存在。很多化合物以 许多多晶型形式存在，并且所有这种形式的化合物的使用涵盖在本公开内。 可以使用标准程序鉴定用于本公开的小分子，诸如在候选化合物文库中筛选 结合至CIS的化合物，然后确定所结合的任何化合物是否降低CIS活性。在 一些实施方案中，筛选本发明的化合物包括评估化合物是否抑制细胞中的 CIS活性。还可以使用本文所述的计算机模拟筛选程序鉴定用于本发明的小 分子，该程序可以包括筛选已知的文库化合物，以鉴定降低CIS活性的候选物。在一些实施方案中，小分子CIS抑制剂是不可逆CIS抑制剂。在其他实 施方案中，小分子CIS抑制剂是可逆CIS抑制剂。

多核苷酸

在一些实施方案中，CIS抑制剂是多核苷酸，所述多核苷酸可以通过所 述的许多不同的机制中的至少一种抑制CIS活性。

RNA干扰

在一些实施方案中，多核苷酸CIS抑制剂通过靶向其mRNA从而降低 CIS蛋白的表达来发挥作用。例如，多核苷酸可以是RNAi。

术语“RNA干扰”、“RNAi”或“基因沉默”通常是指其中双链RNA分子降 低与该双链RNA分子共有大部分或全部同源性的核酸序列的表达的过程。 然而，已显示RNA干扰也可以使用非RNA双链分子实现(参见例如US 20070004667)。

在一些实施方案中，CIS抑制剂包括包含和/或编码双链区的核酸分子， 该双链区用于针对编码CIS的Cish mRNA(人Cish mRNA：GenBank登录号 NM_013324.5)的RNA干扰。核酸分子通常是RNA，但可以包括化学修饰的 核苷酸和非核苷酸。

双链区应为至少19个连续核苷酸，例如约19至23个核苷酸，或可以 更长，例如30或50个核苷酸或100个核苷酸或更长。可以使用对应于整个 基因转录物的全长序列。优选地，它们的长度为约19至约23个核苷酸。

核酸分子的双链区与靶标转录物的同一性程度应为至少90％，更优选地 95-100％。核酸分子当然可以包含可以起稳定分子作用的不相关序列。

如本文所用，术语“短干扰RNA”或“siRNA”是指这样的核酸分子：其包 含能够抑制或下调基因表达，例如通过以序列特异性方式介导RNAi的核糖 核苷酸，其中双链部分的长度小于50个核苷酸，优选地长度为约19至约23 个核苷酸。例如，siRNA可以是包含自互补正义和反义区的核酸分子，其中 该反义区包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并 且正义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siRNA可以由两个 单独的寡核苷酸组装而成，其中一条链是正义链，另一条链是反义链，其中 反义链和正义链是自互补的。

如本文所用，术语siRNA意在等同于用于描述能够介导序列特异性 RNAi的核酸分子的其他术语，例如微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、 短干扰寡核苷酸、短干扰核酸(siNA)、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的 siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等等。此外，如本文所用，术语RNAi 意在等同于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，诸如转录后基因沉 默、翻译抑制或表观遗传学。例如，siRNA分子可以用于在转录后水平或转 录前水平上表观遗传学沉默基因。在一个非限制性实例中，通过siRNA分子 表观遗传学调节基因表达可以由siRNA介导的染色质结构修饰而产生，从 而改变基因表达。

所谓“shRNA”或“短发夹RNA”意指这样的RNA分子：其中小于约50个 核苷酸，优选地约19至约23个核苷酸与位于相同RNA分子上的互补序列 碱基配对，并且其中所述序列和互补序列被至少约4至约15个核苷酸的非 配对区分开，所述核苷酸在碱基互补的两个区产生的茎结构之上形成单链环。

所包括的shRNA是双指或二指和多指发夹dsRNA，其中RNA分子包 含两个或更多个这种被单链间隔区分开的茎-环结构。

一旦包含双链区的核酸分子设计出来，即可通过本领域已知的任何方法 产生，例如通过体外转录、重组或通过合成手段。

可以引入核苷酸的修饰或类似物，以改善核酸分子的性质。改善的性质 包括增加的核酸酶耐受性和/或增加的穿透细胞膜的能力。因此，术语“核酸 分子”和“双链RNA分子”包括合成修饰的碱基，诸如但不限于肌苷、黄嘌呤、 次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤和其他烷基腺嘌呤、 5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌 呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫 醇鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其他取代鸟嘌呤、其他氮杂 和脱氮杂腺嘌呤、其他氮杂和脱氮杂鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞 嘧啶。

特别适用于体内递送的化学修饰的siRNA在本领域中，例如 WO2014201306、WO2007051303中有所描述。可以用于靶向Cish mRNA的 示例性siRNA可以例如从ThermoFisher(目录号：146713和146714)； Origene(目录号SR300830)和MyBioSource(目录号MBS8232244)商购获得。

编码肽或多肽的多核苷酸

在一些实施方案中，基于多核苷酸的CIS抑制剂编码一种或多种多肽， 以使得多核苷酸递送至NK细胞引起所编码的肽或多肽CIS蛋白抑制剂表 达。在一些实施方案中，所编码的肽或多肽一旦在NK细胞中表达，即抑制 内源性CIS蛋白与一个或多个其相互作用配偶体(例如，延伸蛋白B、延伸蛋 白C或滞蛋白-5)或靶蛋白(例如，Tyr1034磷酸化JAK1或在Tyr355、Tyr361 或Tyr392中的任一个磷酸化的IL-2Rβ)相互作用。

在一些实施方案中，多核苷酸编码CIS活性的显性阴性抑制剂。在一个 实施方案中，所编码的显性阴性抑制剂是包含具有其中SH2结构域是失活 的

在一些实施方案中，多核苷酸CIS抑制剂编码可编程核酸酶，所述可编 程核酸酶通过失活或降低Cish基因的表达来抑制CIS活性。如本文所用， 术语“可编程核酸酶”涉及“靶向”(“编程”)为识别和编辑预定基因组位置的核 酸酶。在一些实施方案中，所编码的多肽是“靶向”或“编程”为将遗传修饰引 入Cish基因或其调节区的可编程核酸酶。在一些实施方案中，遗传修饰是Cish基因中或其调节区中的缺失或置换。此类可编程核酸酶特别适用于产生 离体的CIS抑制性Cish

在一些实施方案中，可编程核酸酶可以编程为通过DNA结合的锌指蛋 白(ZFP)结构域的组合来识别基因组位置。ZFP识别DNA序列中的特定3- bp，ZFP的组合可以用于识别特定的基因组位置。在一些实施方案中，可编 程核酸酶可以编程为通过转录活化因子样效应子(TALE)DNA结合结构域识 别基因组位置。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以编程为通过一个 或多个RNA序列识别基因组位置。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以通过一个或多个DNA序列编程。在一个替代实施方案中，可编程核酸 酶可以通过一个或多个杂交DNA/RNA序列编程。在一个替代实施方案中， 可编程核酸酶可以通过RNA序列、DNA序列和杂交DNA/RNA序列中的一 者或多者编程。

可以根据本公开使用的可编程核酸酶包括但不限于：来源于细菌规律成 簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统的RNA引导的工 程化核酸酶(RGEN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样核酸酶(TALEN)和 argonaute。

在一些实施方案中，核酸酶是RNA引导的工程化核酸酶(RGEN)。在一 些实施方案中，RGEN来自古细菌基因组或为其重组形式。在一些实施方案 中，RGEN来自细菌基因组或为其重组形式。在一些实施方案中，RGEN来 自I型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一些实施方案中，RGEN来自II 型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一些实施方案中，RGEN来自III型 (CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一些实施方案中，核酸酶是I类RGEN。 在一些实施方案中，核酸酶是II类RGEN。在一些实施方案中，RGEN是多 组分酶。在一些实施方案中，RGEN是单组分酶。在一些实施方案中，RGEN 是CAS3。在一些实施方案中，RGEN是CAS10。在一些实施方案中，RGEN 是CAS9。在一些实施方案中，RGEN是Cpf1(Zetsche等人，2015)。在一些 实施方案中，RGEN被单RNA或DNA靶向。在一些实施方案中，RGEN被 多于一种RNA和/或DNA靶向。在一些实施方案中，可编程核酸酶可以是 DNA编程的argonaute(WO 14/189628)。

在一些实施方案中，多核苷酸CIS抑制剂以表达载体的形式提供，以使 用本领域已知的许多转染方法中的任一种，例如重组病毒转导、基于脂质体 的转染、电穿孔或基于纳米粒子的转染，体内或体外递送至NK细胞。

如本文所用，“表达载体”是能够在宿主细胞(例如，NK细胞)中实现一种 或多种多核苷酸的表达的DNA或RNA载体。载体通常是质粒或重组病毒。 可以使用合适的表达载体，表达载体的实例包括但不限于质粒或病毒载体。 在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒或 腺相关病毒载体。

此类载体将包括用于表达多核苷酸(诸如用于基因沉默的dsRNA)的一种 或多种启动子。合适的启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子； 和人巨细胞病毒(CMV)启动子。也可以使用细胞启动子(诸如真核细胞启动 子)，包括但不限于组蛋白、RNA聚合酶III(就shRNA或miRNA表达而言)、 β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是NK细胞选择性启动子， 诸如人NKp46启动子(参见例如，Walzer等人，2007)。根据本文包含的教导，合适的启动子的选择将是本领域的技术人员显而易见的。

在其他实施方案中，多核苷酸CIS抑制剂是编码显性阴性CIS的、合成 的、化学修饰的mRNA。化学修饰的mRNA及其合成在例如WO 2011/130624 中详细描述。通常，化学修饰的mRNA包含(i)用于增强翻译的5'合成帽；(ii) 赋予RNA酶耐受性和减弱的细胞干扰素应答，否则将大大降低翻译效率的 修饰的核苷酸；以及(iii)3'多聚-A尾。通常，化学修饰的mRNA从包含可操 作地连接至编码显性阴性CIS的开放阅读框的SP6或T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外合成。化学修饰的mRNA合成反应在存在修饰的和未修 饰的核苷酸的混合物的情况下进行。在一些实施方案中，化学修饰的mRNA 的体外合成中包括的修饰的核苷酸是假尿苷和5-甲基胞嘧啶。细胞mRNA 加工中的关键步骤是添加5'帽结构，它是RNA的5'末端和鸟苷核苷酸之间 的5'-5'三磷酸键。帽在鸟苷的N-7位置酶促甲基化，以形成成熟的mCAP。 当制备显性阴性CIS化学修饰的mRNA时，通常添加5'帽，然后转染NK细 胞，以稳定修饰的mRNA并显著增强翻译。在一些实施方案中，将帽类似物 与GTP的4:1混合物用于转录反应，以获得5'-加帽的化学修饰的mRNA。 在优选的实施方案中，将抗反向帽类似物(ARCA)3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G 用于生成可以在NK细胞中有效翻译的化学修饰的mRNA。用于体外合成的 系统可商购获得，其示例为mRNAExpress

多肽

在一些实施方案中，CIS抑制剂是多肽，它可以通过许多不同机制中的 至少一种抑制CIS活性，例如特异性结合至CIS或CIS结合配偶体，从而减 少CIS和结合配偶体的相互作用，或者与CIS竞争与结合配偶体的相互作 用。

抗体

在一些实施方案中，CIS抑制剂是结合至CIS并且抑制其与结合配偶体 或靶蛋白的相互作用的抗体或其CIS结合片段。优选地，抗体是被修饰为穿 透或被吸收(被动或主动)到哺乳动物细胞，特别是NK细胞中的抗体。

如本文所用，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、 融合二体、三体、异源缀合抗体和嵌合抗体。还设想了相对于对应的全长抗 体保留至少大部分(约10％)抗原结合的抗体片段。此类抗体片段在本文中称 为“抗原-结合片段”。抗体包括许多形式的修饰，包括例如但不限于结构域抗 体(包括VH或VL结构域)、重链可变区(VHH，如针对骆驼科所述)的二聚 体、轻链可变区(VLL)的二聚体、仅含有轻链(VL)和重链(VH)可变区的Fv片 段(它可以直接或通过接头连接)或含有重链可变区和CH1结构域的Fd片段。

术语“抗体”还涵盖由重链和轻链(连接在一起形成单链抗体)的可变区构 成的scFv，以及scFv的寡聚体(诸如二体和三体)。还涵盖含有可变区和恒定 区的一部分的抗体的片段，诸如Fab、(Fab')2和FabFc2片段。还涵盖互补决 定区(CDR)移植的抗体片段和抗体片段的寡聚体。Fv的重链和轻链组分可以 来源于相同的抗体或不同的抗体，从而产生嵌合Fv区。抗体可以是动物(例 如小鼠、兔或大鼠)或人来源的，或可以是嵌合的或人源化的。

如本文所用，术语“抗体”包括这些多种形式。使用本文提供的准则和本 领域的技术人员熟知的那些方法(这些方法在上文引用的参考文献和诸如以 下出版物中有所描述：Harlow&Lane,Antibodies:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988))，可以容易地制备用于本发明的方法的抗体。

抗体可以是包含可变轻链(VL)和可变重链(VH)的Fv区，其中轻链和重 链可以直接或通过接头连接。如本文所用，接头是指这样的分子：其共价连 接至轻链和重链并在两条链之间提供足够的间隔和柔性，使得它们能够实现 其中它们能够特异性结合它们指向的表位的构象。蛋白质接头是特别优选的， 因为它们可以表示为融合多肽的Ig部分的内在组分。

在另一个实施方案中，将重组产生的单链scFv抗体，优选地人源化scFv 用于本发明的方法中。

在一个实施方案中，该抗体具有细胞内传递能力。具有细胞内传递能力 的抗体包括诸如以下的抗体：骆驼科和美洲驼抗体、鲨鱼抗体(IgNAR)、scFv 抗体、胞内体或纳米体(例如scFv胞内体和VHH胞内体)。酵母SPLINT抗 体文库可用于测试能够破坏蛋白质-蛋白质相互作用的胞内体。此类试剂可 包含细胞穿透肽序列或核定位肽序列，诸如Constantini等人(2008)公开的那 些。也可用于体内递送的是Vectocell或Diato肽载体，诸如De Coupade等 人(2005)公开的那些。

此外，抗体可以融合至细胞穿透剂，例如细胞穿透肽。细胞穿透肽包括 Tat肽、穿透蛋白(Penetratin)、短两亲肽(诸如来自Pep和MPG家族的那些)、 寡精氨酸和寡赖氨酸。在一个实例中，细胞穿透肽也缀合至脂质(C6-C18脂 肪酸)结构域，以改善细胞内递送(Koppelhus等人，2008)。细胞穿透肽的实 例可见于Howl等人(2007)和Deshayes等人(2008)。因此，本发明还提供经 由共价键(例如肽键)在任选地N-末端或C-末端融合至细胞穿透肽序列的抗 体的治疗用途。

靶向CIS的抗体可从许多来源获得，诸如Santa Cruz Biotechnology(例 如，目录号sc-74581)。

适用于在离体NK细胞中(例如，在培养NK细胞中)抑制CIS以获得CIS 抑制性NK细胞的任何CIS抑制剂，均可用于NK应答性病症的过继性细胞 疗法。在一些实施方案中，待施用的CIS抑制性NK细胞是自体的，即来源 于待治疗的受试者。在其他实施方案中，待施用的CIS抑制性NK细胞是同 种异体的NK细胞。

在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞是经遗传修饰为具有降低的CIS 表达的NK细胞。例如，在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞通过CIS shRNA或CIS反义表达载体的瞬时或稳定转染或病毒转导获得，所述CIS shRNA或CIS反义表达载体在表达时，降低了经遗传修饰的细胞中CIS的 表达水平。在其他实施方案中，CIS抑制性NK细胞是经遗传修饰的NK细 胞，其中一个或两个Cish等位基因通过靶向基因组修饰，例如通过一个或多 个外显子的缺失、终止密码子的引入或启动子的失活来失活。用于在细胞系 和原代细胞中进行基因组基因座修饰的方法在领域中已经很好地确立。例如， 可编程核酸酶(例如，Cas9-CRISPR系统)是非常有效的且常规用于基因的靶 向断裂。

在其他实施方案中，NK细胞离体接触CIS抑制剂，例如肽、肽模拟物、 多核苷酸或多肽。

NK细胞可以通过任何许多不同的方法获得，包括从原代来源分离和扩 增NK细胞、从造血干细胞(HSC)分化和扩增、从人诱导的多能干细胞(hiPSC) 分化和扩增或从另一种多能干细胞类型分化。

在一些实施方案中，就自体过继性细胞疗法而言，从人受试者，例如待 治疗的患者分离NK细胞。

NK细胞可以通过以下步骤分离或富集：使用CD56和CD3的抗体对来 自组织来源(例如外周血)的细胞染色，并选择CD56

细胞分离可以通过例如流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)或优选地 使用与特定抗体缀合的微珠的磁性细胞分选来实现。细胞可以例如使用磁性 活化细胞分选(MACS)技术，根据结合包含一种或多种特定抗体(例如抗 CD56抗体)的磁珠(例如，约0.5-100μM直径)的能力来分离颗粒的方法来分 离。磁性细胞分离可以使用例如AUTOMACS

从HSC分化人NK细胞在例如U.S.8,926,964中有所描述，从hiPSC分 化人NK细胞在U.S.20130287751中有所描述。

培养和扩增NK细胞(特别是人NK细胞)以获得用于过继性细胞疗法的 临床级NK细胞的方法在本领域中有所描述，如例如Childs等人(2013)所综 述。

在一些实施方案中，治疗患有NK应答性病症的受试者或预防这种病症 的方法，包括将含有至少一种CIS抑制剂或其药学上可接受的盐、药学上可 接受的N-氧化物、药学活性代谢物、药学上可接受的前药或药学上可接受的 溶剂化物的药物组合物以治疗有效量向所述受试者施用。

施用CIS抑制剂以防止、治愈或至少部分阻止已经患有和/或被诊断为 具有NK应答性病症(例如，癌症或感染)的患者的症状。该用途的有效量将 取决于感染的严重性和过程、先前疗法、患者的健康状况、体重、对治疗的 应答以及感染原对治疗的耐受性。对于通过常规实验(包括但不限于剂量递 增临床试验)来确定此类治疗有效量的本领域的技术人员来说，这被认为是 良好的。

在预防性应用中，将含有CIS抑制剂的组合物向易患或者处于发展NK 应答性病症(例如癌症或感染)的风险中的患者施用，例如就免疫功能受损(对 于感染的预防)或根据基因型高度易患特定类型的癌症的个体而言。这种量 被定义为“预防有效量或剂量”，即足以防止或减少感染的发生的剂量。在该 用途中，精确量还取决于特定的病症、患者的健康状况、体重、时间安排等。 对于通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)来确定此类预防有效量的本领 域的技术人员来说，这被认为是良好的。

在受试者的状况确实改善的情况下，根据可靠的医疗建议，CIS抑制剂 的施用可以连续给予；或者所施用的药物的剂量可以暂时减少或暂时停止一 定长度的时间(即，“药物假期”)。药物假期的长度可以在2天和1年之间变 化，包括仅作为例子，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、 15天、20天、28天、35天、50天或60天。药物假期期间的剂量减少可为 10％-100％，包括仅作为例子，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

适合作为治疗有效剂量的给定CIS抑制剂的量将根据以下因素而变化： 诸如待施用的CIS抑制剂的类型和效力、受试者的健康病症的严重性/分期、 需要治疗的受试者或宿主的特征(例如，体重)以及既往或同时治疗，但仍然 可以根据围绕病例的特定情况以本领域已知的方式常规确定，包括例如所施 用的具体药剂、施用途径、所治疗的病症以及所治疗的受试者或宿主。然而， 一般来讲，用于成人治疗的剂量通常将在每天0.02-5000mg或每天约1- 1500mg的范围内。所需的剂量可以以单剂量或以同时(或在一段短时间内)或 在适当的间隔施用的分剂量，例如以每天两次、三次、四次或更多次亚剂量 方便地提供。

前述范围仅仅是建议性的，因为关于单个治疗方案的变量数很大，并且 这些推荐值的巨大偏差并不少见。此类剂量可以根据许多变量来改变，不限 于所用的CIS抑制剂的活性、待治疗的NK细胞应答性病症的类型和严重 性、施用模式以及专业人员的判断。

此类治疗方案的毒性和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物中通过 标准制药程序来确定，包括但不限于LD

NK抑制性细胞可以通过本领域已知的任何合适的途径施用。在一些实 施方案中，细胞以动脉内或静脉内输注全身施用。本领域的技术人员将会理 解，选定的CIS抑制性NK细胞的施用途径将部分取决于待治疗的特定NK 应答性病症。例如，在受试者患有存在一种或多种肿瘤的情况下，在一些实 施方案中，施用途径将包括瘤内施用和/或瘤周施用。其他示例性施用途径包 括腹膜内、鞘内和淋巴内施用。

CIS抑制性NK细胞可以以对个体产生可检出治疗性或预防性益处的任 何量或数量，例如有效量向个体施用，其中所述个体具有癌症或病毒感染。 在一些实施方案中，待施用的CIS抑制性细胞的剂量仅仅是细胞的绝对数， 例如可以给所述个体施用约1×10

在其他实施方案中，CIS抑制性NK细胞以相对于待治疗的受试者的体 重的细胞数，例如以每千克待治疗的受试者约1×10

在其他实施方案中，在待治疗的受试者患有一种或多种肿瘤的情况下， CIS抑制性NK细胞根据CIS抑制性NK细胞与待治疗的受试者中大致肿瘤 细胞数的大致所需比率施用。例如，CIS抑制性NK细胞可以以约1:1、1:1、 3:1、4:1、5:1、9:1、10:1、15:125:1、30:1、40:1、50:1、55:1、60:1、65:1、 75:1、80:1、90:1、95:1或100:1的比率(NK细胞与肿瘤细胞)施用。肿瘤细 胞数可以通过例如确定组织样品(例如，血样、活检样品等等)中的肿瘤细胞数来估算。在一些实施方案中，例如对于实体肿瘤，肿瘤细胞数估算可以通 过活检样品中的细胞计数和肿瘤成像的组合来进行，以估算肿瘤体积和驻留 细胞数。

CIS抑制剂和CIS抑制性NK细胞组合物也可以与在NK应答性健康病 症(例如，癌症和病毒感染)的治疗中有治疗价值的其他药剂联合使用。一般 来讲，其他药剂不一定必须在相同的药物组合物施用，并且由于不同的物理 和化学特征，可以优选地以不同的途径施用。如果可能的话，在相同的药物 组合物中，施用模式和施用的可行性的确定，在熟练的临床医生的知识范围 内。初始施用可以根据本领域已知的确立方案进行，然后，根据所观察到的 效果，熟练的临床医生可以修改剂量、施用模式和施用时间。

根据感染的性质和阶段、患者的病症以及所用治疗剂的实际选择，CIS 抑制剂和另外的治疗剂可以同时(例如，同时、基本上同时或在相同的治疗方 案内)或按顺序施用。在治疗方案期间，在评估所治疗的疾病和患者的病症之 后，每种治疗剂的施用顺序和重复施用次数的确定在熟练的内科医生的知识 范围内。

本领域的技术人员已知，当药物用于治疗组合时，治疗有效剂量可以变 化。实验确定用于联合治疗方案的药物和其他药剂治疗有效剂量的方法在文 献中有所描述。例如，节拍给药的使用，即提供更频繁、更低剂量以使毒性 副作用最小化，已在文献中广泛描述。联合治疗还包括在不同时间开始和停 止以协助患者的临床管理的周期治疗。

对于联合疗法，共施用的治疗剂的剂量当然将根据所利用的共同药剂的 类型、根据具体CIS抑制剂和待治疗的NK细胞应答性病症而变化。

可以理解的是，治疗、防止或改善一种或多种寻求缓解的病症的剂量方 案，可以根据许多因素修改。这些因素包括受试者患有的病症，以及受试者 的年龄、体重、性别、饮食和一般医疗状况。因此，实际利用的剂量方案可 以宽泛地变化，所以可以偏离本文所示的剂量方案。

构成本文公开的联合疗法的CIS抑制剂和另外的治疗剂可以是组合剂 型或旨在基本上同时施用的单独剂型。构成联合疗法的药剂也可以按顺序施 用，其中任一种治疗化合物通过要求两步施用的方案施用。两步施用方案可 以要求按顺序施用活性剂或分开施用单独的活性剂。根据每种药剂的性质， 诸如药剂的效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学特征，多个施 用步骤之间的时间段可以在几分钟至几小时的范围内。还可以评价许多生理 参数的昼夜节律变化以确定最佳剂量间隔。

此外，用于治疗感染的CIS抑制剂的施用或共施用可以与多个程序联合 使用，所述程序可以为患者提供另外的或协同益处。仅作为例子，患者可以 经历遗传测试，以鉴定其自身的基因组或病原体的基因组的遗传变异，以优 化治疗参数，例如待施用的CIS抑制剂的类型、给药方案以及与另外的治疗 剂的共施用。

初始施用可以经由任何实际途径进行，诸如例如静脉内注射、弹丸注射、 超过5分钟至约5小时的输注、丸剂、胶囊剂、吸入剂、注射剂、透皮贴剂、 面颊递送等等或其组合。在检测到或怀疑疾病或病症的发生后，化合物应在 可行的情况下尽快施用，并持续治疗或预防NK细胞应答性病症所需的时间 长度。

任选地，当与使用CIS抑制剂的治疗联合时，也可以给受试者施用治疗 有效剂量的IL-15或IL-15激动剂。IL-15激动剂包括IL-15的功能同系物， 诸如例如Wu(2013)描述的那些。在其他实施方案中，本发明的任何治疗还 可以包括施用一种或多种免疫治疗剂。适用于与CIS抑制联合或与IL-15或 IL-15激动剂联合的CIS抑制联合的免疫治疗剂可以包括但不限于针对程序 性细胞死亡1受体(PD-1)的抗体、针对程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体、针 对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抗体、针对转化生长因子β (TGF-b)的抗体、针对Tactile(CD96)的抗体或它们的组合。

在另外的实施方案中，在其他实施方案中，本发明的任何治疗还可以包 括施用B-Raf蛋白激酶抑制剂或MEK蛋白激酶抑制剂。B-Raf蛋白激酶抑 制剂的实例包括但不限于PLX4032(维罗菲尼(Vemurafenib))、PLX-4720、达 拉菲尼(Dabrafenib,GSK2118436)、AZ628、RAF265(CHIR-265)、恩考菲尼 (Encorafenib,LGX818)、SB590885及其组合。MEK蛋白激酶抑制剂的实例 包括但不限于曲美替尼(Trametinib,GSK1120212)、考比替尼(Cobimetinib)、 比尼替尼(Binimetinib,MEK162)、司美替尼(Selumetinib,PD-325901)、它们的 组合。在一些实施方案中，任何上述治疗可以另外包括施用TGF-β受体拮抗 剂。合适的TGF-β受体拮抗剂的实例包括但不限于Galunisertib(LY2157299)、 GW 788388、LY364947、R268712、SB 525334和SD208。

用于本发明的组合物可配制为经由任何传统手段向受试者施用，包括但 不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下或肌内)、面颊、吸入、鼻内、直肠 或透皮施用途径。

包括单独或与一种或多种其他治疗剂组合的CIS抑制剂(例如，肽模拟 物)的药物组合物可以配制成任何合适的剂型，包括但不限于水性口服分散 剂、液体、雾剂、凝胶剂、糖浆剂、酏剂、浆剂、混悬剂等等用于由待治疗 的患者口服摄取的剂型、固体口服剂型、气雾剂、控释制剂、速溶制剂、泡 腾制剂、冻干制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、延迟释放制剂、 延长释放制剂、脉冲释放制剂、多微粒制剂以及混合速释和控释制剂。

口服使用的药物制剂可以通过以下步骤获得：将一种或多种固体赋形剂 与一种或多种化合物混合，任选地研磨所得的混合物，在添加合适的助剂(如 果需要)之后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核。合适的赋形剂包括 例如填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂， 诸如例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、 甲基纤维素、微晶纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；或其他 填充剂诸如：聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮)或磷酸钙。如果需要，可以加 入崩解剂，诸如交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐 诸如藻酸钠。

在另一个方面，剂型可以包括微胶囊化制剂。在一些实施方案中，一种 或多种相容性材料存在于微胶囊化材料中。示例性材料包括但不限于pH调 节剂、促腐蚀剂、消泡剂、抗氧化剂、调味剂和载剂材料诸如粘合剂、悬浮 剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂和稀 释剂。

CIS抑制剂的微胶囊化制剂可以通过本领域的普通技术人员已知的方法 配制。这些已知的方法包括例如喷雾干燥法、转盘-溶剂法、热熔法、喷雾冷 却法、流化床、静电沉积、离心挤出、旋转悬浮分离、在液体-气体或固体- 气体界面处聚合、压力挤出或喷雾溶剂提取浴。除这些方法之外，还可以使 用多种化学技术，例如复合凝聚、溶剂蒸发、聚合物-聚合物不相容性、液体 介质中的界面聚合、原位聚合、液中干燥和液体介质中的去溶剂化。此外， 还可以使用其他方法，诸如碾压、挤出/滚圆、凝聚或纳米粒子包衣。

包括制剂的药物固体口服剂型还可以配制为提供CIS抑制剂的控释。控 释是指一种或多种活性剂根据所需的特征在延长的时间段内从它们所掺入 的剂型中释放。控释特征包括例如持续释放、延长释放、脉冲释放和延迟释 放特征。与速释组合物相比，控释组合物允许根据预定特征在延长的时间段 内将药剂递送至受试者。这种释放速率可以在延长的时间段内提供治疗有效 的水平的药剂，从而与传统的速释剂型相比，提供长期的药理学响应，同时 使副作用最小化。这种长期响应提供了对应的短效速释制剂未实现的许多固有益处。

在一些实施方案中，固体剂型可以配制为肠溶包衣延迟释放口服剂型， 即利用肠溶包衣来影响胃肠道的小肠中的释放的药物组合物的口服剂型。肠 溶包衣剂型可以是含有活性成分和/或其他组合物组分(其本身是包衣的或无 包衣的)的颗粒剂、粉剂、小丸剂、珠粒或颗粒的压制或模制或挤出片剂/铸 模(包衣的或无包衣的)。肠溶包衣口服剂型也可以是含有固体载剂或组合物 (其本身是包衣的或无包衣的)的小丸剂、珠粒或颗粒的胶囊剂(包衣的或无包 衣的)。

如本文所用，术语“延迟释放”是指这样的递送：其使得释放可以在肠道 中的一些通常可预测的位置实现，所述位置远离在延迟释放无改变的情况下 可以实现的位置。在一些实施方案中，用于释放延迟方法是包衣。任何包衣 都应施涂至足够的厚度，以使得整个包衣在pH小于约5的胃肠液中不溶解， 但在约5和更大的pH下溶解。预期，任何展现出pH依赖性溶解度特征的 阴离子聚合物均可在实现递送至下胃肠道的方法和组合物中用作肠溶包衣。 在一些实施方案中，聚合物是阴离子羧基聚合物。

在一些实施方案中，包衣可以并且通常确实含有增塑剂以及可能地本领 域熟知的其他包衣赋形剂，诸如着色剂、滑石和/或硬脂酸镁。合适的增塑剂 包括柠檬酸三乙酯(Citroflex 2)、三醋精(三乙酸甘油酯)、乙酰柠檬酸三乙酯 (Citroflec A2)、Carbowax400(聚乙二醇400)、邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三 丁酯、乙酰化甘油单酯、甘油、脂肪酸酯、丙二醇和邻苯二甲酸二丁酯。具 体地讲，阴离子羧基丙烯酸聚合物通常将含有10-25重量％的增塑剂，特别 是邻苯二甲酸二丁酯、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯和三醋精。利用传统包衣技 术诸如喷涂包衣或锅包衣施涂包衣。包衣厚度必须足以确保口服剂型保持完 整，直到到达肠道中所需的局部递送位点。

除增塑剂之外，还可以将着色剂、防粘剂、表面活性剂、消泡剂、润滑 剂(例如，巴西棕榈蜡或PEG)添加到包衣，以增溶或分散包衣材料，并改善 包衣性能和包衣产品。

在其他实施方案中，使用脉冲剂型递送CIS抑制剂制剂。脉冲剂型能够 在控制滞后时间之后的预定时间点或在特定位点提供一个或多个速释脉冲。 可以使用本领域已知的许多脉冲制剂施用脉冲剂型。例如，此类制剂包括但 不限于US 5,011,692、5,017,381、5,229,135和5,840,329描述的那些。适用 于本发明的制剂的其他脉冲释放剂型包括但不限于例如US 4,871,549、 5,260,068、5,260,069、5,508,040、5,567,441和5,837,284。在一个实施方案 中，控释剂型是包括至少两组颗粒(即多微粒)，每组含有一种制剂的脉冲释放固体口服剂型。第一组颗粒在摄取时提供基本上速释剂量的CIS抑制剂。 第一组颗粒可以是无包衣的或包括包衣和/或密封剂。第二组颗粒包括与一种 或多种粘合剂混合的包衣颗粒，所述包衣颗粒以制剂中活性剂的总剂量的总 量计，约2％至约75％、约2.5％至约70％或约40％至约70％包括。所述包衣 包括药学上可接受的成分，所述药学上可接受的成分的量足以提供在摄取之 后、第二剂量释放之前约2小时至约7小时的延迟。合适的包衣包括一种或 多种可差异降解的包衣，诸如仅作为例子pH敏感性包衣(肠溶包衣)，诸如 单独或与纤维素衍生物(例如，乙基纤维素)共混的丙烯酸树脂，或具有可变 厚度以提供制剂的差异释放的非肠溶包衣。

很多其他类型的控释系统是本领域的普通技术人员已知的并且适用于 与所述制剂。此类递送系统的实例包括例如基于聚合物的系统，诸如聚乳酸 和聚乙醇酸、聚酐和聚己内酯；多孔基质、基于非聚合物的系统(其为脂质)， 包括甾醇，诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪，诸如单甘油酯、二 甘油酯和三甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包衣、 生物蚀解性剂型、使用传统粘合剂的压缩片剂等等。参见例如US4,327,725、 4,624,848、4,968,509、5,461,140、5,456,923、5,516,527、5,622,721、5,686,105、 5,700,410、5,977,175、6,465,014和6,932,983。

用于口服施用的液体制剂剂型可以是选自以下的水性混悬剂，包括但不 限于药学上可接受的水性口服分散剂、乳剂、溶液剂、酏剂、凝胶剂和糖浆 剂。

水性混悬剂和分散剂可以保持如The USP Pharmacists' Pharmacopeia(2005年版，第905章)所定义的均质状态至少4小时。均质性 应通过与关于确定整个组合物的均质性一致的取样方法来确定。在一个实施 方案中，水性混悬剂可以通过持续小于1分钟的物理搅拌重悬为均质混悬剂。 在另一个实施方案中，水性混悬剂可以通过持续小于45秒的物理搅拌重悬 为均质混悬剂。在又一个实施方案中，水性混悬剂可以通过持续小于30秒 的物理搅拌重悬为均质混悬剂。在又一个实施方案中，无需搅拌即可维持均 质水性分散剂。

除上文列出的添加剂之外，液体制剂也可包括本领域通常使用的惰性稀 释剂，诸如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂。示例性乳化剂为乙醇、异丙醇、 碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰 胺、月桂基硫酸钠、多库酯钠、胆固醇、胆固醇酯、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、 油诸如棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四 氢糠醇、聚乙二醇、脱水山梨糖醇的脂肪酸酯或这些物质的混合物等等。

可注射制剂

适用于肌内、皮下或静脉内注射的制剂可以包括生理学上可接受的无菌 水性或非水性溶液、分散剂、混悬剂或乳剂以及用于复原为无菌可注射溶液 剂或分散剂的无菌粉剂。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒介物 的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛(cremophor) 等等)、它们的合适混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯诸如油酸乙 酯。可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂，就分散体而言通过维持所需的粒度 以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。适用于皮下注射的制剂也可以 含有添加剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物生长的防止可 以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山 梨酸等等来确保。包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等等也可以是所期望的。可 注射药物形式的延长吸收可以通过使用延迟吸收药剂，诸如单硬脂酸铝和明 胶来实现。

对于静脉内注射，化合物可以在水溶液中，优选地在生理相容性缓冲液 诸如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。对于经粘膜施用， 在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域中是已 知的。对于其他肠胃外注射，适当的制剂可以包括水性或非水性溶液，优选 地生理相容性缓冲液或赋形剂。此类赋形剂通常在本领域中是已知的。

肠胃外注射可以涉及弹丸注射或连续输注。注射用制剂可以以单位剂型， 例如添加有防腐剂的安瓿瓶或多剂量容器提供。药物组合物可以是适用于肠 胃外注射的形式，作为溶于油性或水性媒介物的无菌混悬剂、溶液剂或乳剂， 并且可以含有配制剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的药 物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的混悬剂 可以制备成适当的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油 诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯诸如油酸乙酯或三甘油酯，或脂质体。水性注 射混悬剂可以包含增加混悬剂的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖 醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可以包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解 度以允许制备高浓度溶液的试剂。或者，活性成分可以是在使用前用合适的 媒介物(例如灭菌无热原水)复原的粉末形式。

药物组合物可以是适用于精确剂量的单次施用的单位剂型。在单位剂型 中，制剂被分成含有适当量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以 是含有不连续量制剂的包装的形式。非限制性实例为包装片剂或胶囊剂以及 小瓶或安瓿瓶中的粉剂。水性混悬剂组合物可以包装在单剂量不可重复开启 式容器中。或者，可以使用多剂量可重复开启式容器，在这种情况下通常在 组合物中包括防腐剂。仅作为例子，用于肠胃外注射的制剂可以以单位剂型 提供，其包括但不限于添加有防腐剂的安瓿瓶或多剂量容器。

还提供了鉴定CIS抑制剂的方法，即“筛选”方法。在一些实施方案中， 筛选方法包括至少以下步骤：(i)在存在测试剂的情况下使CIS或其片段与至 少一种CIS结合配偶体接触；并且(ii)确定所述测试剂是否与所述CIS蛋白 结合配偶体竞争CIS或其片段的结合。在一些实施方案中，该测定所用的CIS 结合配偶体选自JAK1、IL-2Rβ、延伸蛋白B、延伸蛋白C或滞蛋白5或其 片段。

在一些实施方案中，该方法使用基本上纯的蛋白质组分体外进行。在其 他实施方案中，这种方法可以对在细胞中天然或异源表达的蛋白质组分进行。 在一些实施方案中，一种或多种蛋白质组分也可以包括标签以便于检测测定 中标记的蛋白质，例如小表位标签、融合荧光蛋白、荧光团或有助于标记的 蛋白质的直接或间接检测(例如，通过使用抗体)的任何其他标签。在其他实 施方案中，待测定的蛋白质不需要标记。

鉴定抑制CIS与结合配偶体和靶蛋白的相互作用的CIS抑制剂的方法 包括但不限于ELISA型测定、荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨(TR) FRET测定和基于AlphaScreen

或者，筛选蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂可以在细胞中进行，例如在 使用酵母、细菌或哺乳动物测定系统的蛋白质互补测定和“双杂交”、“三杂交” 测定中。此类测定及其在发现蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂中的应用在本 领域中，例如在Male等人(2013)中有所描述。

在其他实施方案中，筛选方法包括以下步骤：(i)使CIS或其片段与测试 剂接触；并且(ii)确定所述测试剂是否结合至CIS或其片段。在一些实施方案 中，该方法还包括确定所述测试剂是否与CIS PEST结构域肽或CIS N-末端 肽竞争CIS或其片段的结合。虽然不希望受理论的束缚，但据信此类肽对应 于CIS中的自体抑制结构域。因此，可以期望可以与此类自体抑制肽竞争CIS 的结合的测试剂还抑制CIS活性，例如如本文所述使JAK激酶活性增加。 在一些实施方案中，上述测定所用的CIS PEST结构域肽的序列选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37。在其他实施方案 中，该测定所用的N-末端结构域肽的序列选自SEQ ID NO:31和34。许多用 于检测分析物与靶蛋白的结合的测定是本领域已知的，其包括但不限于光学 生物传感器测定(例如，基于表面等离子共振、光学梯度或干涉测量法)、质 谱、等温量热法、差示扫描量热法和差示扫描荧光测量法、NMR、X射线晶 体学。用于鉴定蛋白质结合化合物的基于高通量亲和力的测定如例如Zhu等 人(2009)所综述。还设想了小分子微阵列的使用，如例如Casalena等人(2012) 所述。光学或荧光检测，诸如例如使用质谱、MALDI-TOF、生物传感器技术、 渐逝光纤光学或荧光共振能量转移的荧光活化细胞分选(FACS)明显涵盖在 本发明的范围内。

还设想了基于监测测试剂对体外评估的CIS活性的作用的筛选方法。在 一些实施方案中，筛选是评估测试剂对CIS增加靶蛋白(例如，JAK1)的泛素 化的能力的作用的体外生物化学测定，其中该测定包括以下步骤：

(i)在存在以下物质的情况下，体外温育磷酸化JAK1蛋白(例如， Tyr1034磷酸化JAK1)或其CIS结合片段：

(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少 SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B和延伸蛋白C；

(b)泛素化混合物；以及

(c)测试剂；并且

(ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下CIS诱导的泛素化的水平，确 定所述测试剂是否抑制CIS诱导的所述磷酸化JAK1蛋白或其CIS结合片段 泛素化。降低JAK1或片段的CIS依赖性泛素化的测试剂被视为候选CIS抑 制剂。

在一个示例性实施方案中，在存在2.5mM Mg/ATP的情况下，将CIS E3 连接酶复合物(三聚体CIS-延伸蛋白B-延伸蛋白C以及滞蛋白5和Rbx2； 2.5μM)与泛素(50μM)、人E1(100nM)、纯化的重组E2(UbcH5c,2.5μM)和 Flag标记的全长JAK1一起在37℃下温育不同的时间。FLAG标记的磷酸化 JAK1通过以下步骤产生：在293T细胞中表达，并使用抗FLAG免疫沉淀和 游离的FLAG肽洗脱来回收。JAK1泛素化通过与抗磷酸化JAK1一起进行 蛋白质印迹，然后在4-20％Tris/甘氨酸凝胶上分离来可视化。E3连接酶活 性调节剂的高通量形式筛选已在本领域中，例如Rossi等人(2014)中有所描 述，并且此类筛选平台也可商购获得，例如得自ProGenra,Inc.(Malvern,PA, USA)的UbiPro

在其他实施方案中，用于鉴定CIS抑制剂的筛选方法是评估测试剂对 CIS抑制JAK1激酶活性的能力的作用的体外生物化学测定，其中该测定包 括以下步骤：

i)在存在以下物质的情况下体外温育包含JH1激酶结构域的JAK1蛋白 或其片段：

(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少 SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B和延伸蛋白C；

(b)JAK1激酶底物；以及

(c)测试剂；并且

ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下所述JAK1激酶底物的磷酸化， 确定所述测试剂是否增加所述JAK1激酶底物的磷酸化。减少JAK1激酶活 性的CIS依赖性抑制，即相对于在不存在所述测试剂的情况下的JAK1激酶 活性，增加JAK1激酶活性的测试剂被视为候选CIS抑制剂。

在一些实施方案中，待测试的JAK1激酶底物是STAT5或STAT5肽。 在一些实施方案中，待使用的STAT5肽底物的氨基酸序列为：SEQ ID NO:18 RRAKAADGYVKPQIKQVV。

蛋白激酶测定，包括高通量激酶测定是本领域已知的，如例如Babon等 人(2013)和Von Ahsen等人(2005)所述。在一个示例性实施方案中，将130μM STAT5b肽(SEQ ID NO:18RRAKAADGYVKPQIKQVV)与5nM人JAK1(对 应的氨基酸序列参见SEQ ID NO:11)一起在20mMTris pH8.0、100mM NaCl、 5mM 2-巯基乙醇、0.2mg ml

在其他实施方案中，CIS抑制剂的鉴定在包括以下步骤的方法中通过计 算机模拟进行：(i)生成CIS或其片段的三维结构模型；并且(ii)计算机模拟设 计或筛选结合至建模结构的测试剂。在一些实施方案中，三维结构模型是 JAK1多肽或其片段结合至CIS或其片段的复合物或IL-2Rβ胞质结构域多 肽或其CIS结合片段结合至CIS或其片段的复合物。

CIS抑制剂可以通过本领域的技术人员已知的任何方法通过计算机模拟 筛选CIS的结合鉴定。计算机模拟筛选结合至蛋白质的配体的方法包括但不 限于例如Good,(2001)、Zhang等人(2015)、Cerqueira等人(2015)、Kuenemann 等人(2015)和Westermaier等人(2015)中提供的那些。

对于结合CIS蛋白的分子，通常将需要合适的立体化学互补性水平。一 般来讲，具有立体化学互补性的分子的设计可以通过化学上和/或几何上优化 分子和靶受体之间的“拟合”的技术来实现。根据本发明，存在至少两种设计 与CIS蛋白或其片段的立体化学互补的分子的方法。

第一种方法是将三维结构数据库的计算机模拟分子(“虚拟测试剂”)直接 对接受体位点，使用大部分但非排他性几何标准评估特定分子与位点的适配 性。在该方法中，内部自由度数(以及分子构象空间中对应的局部最小值)大 幅减少仅两个刚体的几何(硬球)相互作用，其中一个体(活性位点)含有形成 第二体(互补分子，作为配体)的结合位点的“口袋“或”凹槽”。

该方法由Ewing等人(2001)展示，其配体设计算法在Regents of the Universityof California发布的商业化软件包DOCK 4.0版中实施，并且在发 布者提供的标题为“DOCK程序套件概述”的文档中进一步描述。最近， Autodock 4已有所描述。根据Kuntz算法，所关注区域的形状被定义为一系 列不同半径的相交球。然后在一个或多个现有的晶体学数据的数据库，诸如 Cambridge University(University Chemical Laboratory,Lensfield Road, Cambridge CB2 1EW,U.K.)维护的Cambridge Structural DatabaseSystem、 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(RutgersUniversity,N.J., U.S.A.)维护的Protein Data Bank、LeadQuest(Tripos Associates,Inc.,St.Louis, MO)、Available Chemicals Directory(Molecular Design Ltd.,SanLeandro,CA) 和NCI数据库(National Cancer Institute,U.S.A)中搜索近似于所定义形状的分 子。

然后可以根据几何参数修改这样鉴定的分子，以满足化学互补性，诸如 氢键、离子相互作用和范德华(Van der Waals)相互作用相关的标准。可以利 用不同的评分函数来对数据库排序和选择最佳分子(参见例如Bohm等人, 1999)。Tripos Associates,Inc.(St.Louis,MO)销售的软件包FlexX是另一个可 用于该直接对接方法的程序。

第二种优选方法需要评估相应的化学基团(“探针”)与位点内部和周围的 样品位置处的活性位点的相互作用，得到可在选定的能量水平生成三维等值 面的一系列能量值。配体设计的化学探针方法在许多商业化软件包，诸如 GRID(Molecular Discovery Ltd.,West Way House,Elms Parade,Oxford OX2 9LL,U.K.的产品)中实施。根据该方法，在开始时，通过使用不同的化学探 针，例如水、甲基基团、胺氮、羧基氧和羟基探测活性位点来鉴定位点互补 分子的化学先决条件。从而确定活性位点和每个探针之间相互作用的有利位点，并且从所得的这些位点的三维图案可以生成推定的互补分子。这可以通 过可以搜索三维数据库以鉴定包括所需药效团图案的分子的程序，或通过使 用有利位点和探针作为输入执行从头设计的程序来进行。

适用于搜索三维数据库以鉴定具有所需药效团的分子的程序包括： MACCS 3D和ISIS/3D(Molecular Design Ltd.,San Leandro,CA)、ChemDBS 3D(Chemical DesignLtd.,Oxford,U.K.)和Sybyl/3DB Unity(Tripos Associates, Inc.,St.Louis,MO)。

化学结构数据库可以从许多来源获得，包括Cambridge Crystallographic DataCentre(Cambridge,U.K.)、Molecular Design,Ltd.(San Leandro,CA)、 TriposAssociates,Inc.(St.Louis,MO)和Chemical Abstracts Service(Columbus, OH)。

从头设计程序包括Ludi(Biosym Technologies Inc.,San Diego,CA)、 Leapfrog(Tripos Associates,Inc.)、Aladdin(Daylight Chemical Information Systems,Irvine,CA)和LigBuilder(Peking University,China)。

可以使用当前的计算机建模软件(使用计算机辅助药物设计或CADD)将 模拟物(诸如肽模拟物和有机模拟物)设计为拟合例如肽结合位点(Walters， 1993，载于"Computer-Assisted Modeling of Drugs"，载于Klegerman& Groves(编)，PharmaceuticalBiotechnology，1993，Interpharm Press:Buffalo Grove,Ill.，第165-174页；和Munson，1995，Principles of Pharmacology， Chapman&Hall，第12章)。使用此类技术制备的模拟物也包括在本公开的 范围内。在一个实例中，模拟物模拟已知与CIS SH2结构域相互作用的JAK1 活化环的磷酸肽。

可以使用可从多个肽结构衍生出虚拟肽模型的软件生成模拟物。这可以 使用来源于SLATE算法的软件进行(Perkin等人，1995；Mills等人，2001； De Esch等人，2001)。

其他设计肽类似物、衍生物和模拟物的方法也是本领域熟知的，参见例 如Floris等人(2011)。

被发现结合至CIS的分子可以合成或从合适的来源，诸如商业供应商大 量获得。然后可以将所获得的测试剂用于任何上述测定，以验证其结合至CIS 和/或抑制CIS结合配偶体或靶蛋白与CIS或CIS片段结合的能力。

对于所有药物筛选测定，进一步精炼药物的结构通常将是必要的，并且 可以通过特定药物筛选测定提供的任何和/或所有步骤的连续重复来进行。

在其他实施方案中，鉴定CIS抑制剂的方法是表型测定法，其包括以下 步骤：(i)提供表达CIS的细胞；并且(ii)与未接触所述测试剂的细胞相比，确 定所述测试剂是否降低所述细胞中的CIS活性。在一些实施方案中，筛选方 法所用的细胞类型是NK细胞。在一些实施方案中，在使用NK细胞的情况 下，确定测试剂是否减少细胞中的CIS活性包括确定测试剂对NK细胞中的 IL-15可诱导应答的作用。合适的IL-15可诱导应答包括但不限于NK细胞 增殖、干扰素-γ(IFN-γ)产生、细胞内粒酶表达、JAK1酪氨酸磷酸化、JAK1 降解、基因表达的调节或细胞毒性中的一者或多者。任何这些端点均可通过 本领域已知的许多标准方法中的任一种来评估。例如，细胞增殖测定如Riss 等人(2013),Assay Guidance Manual[Internet].Bethesda(MD):Eli Lilly& Company and the National Center forAdvancing Translational Sciences所述；细 胞因子定量测定如Whiteside(2002)所述；JAK1激酶活性测定如例如Babon 等人(2013)所述；泛素介导的JAK1降解测定如例如Lee等人(2008)所述；基 因表达测定，例如RNAseq如例如Hoek等人(2015)所述；并且NK细胞介导的细胞毒性测定如例如Giamann等人(2006)和Jang等人(2012)所述。在一些 实施方案中，在相互作用或结合筛选方法中的一者中用于基于细胞的测定的 测试剂最初鉴定为候选CIS抑制剂。在一些实施方案中，在细胞中测定的CIS 活性是JAK1激酶活性的抑制(例如，STAT5底物的磷酸化减少)、STAT5酪 氨酸磷酸化的抑制、STAT5启动子活性的下调或NK细胞中JAK1的降解增 加。

用于筛选方法的合适测试剂包括肽、肽模拟物、小分子、多核苷酸或多 肽，但本领域的技术人员将会理解，在测试剂涉及通过靶向Cish基因或Cish mRNA来减少CIS活性的情况下，此类试剂将在细胞测定中评估。

在一些实施方案中，用于鉴定CIS抑制剂的任何方法中使用的合适的 CIS或CIS片段包含与SEQ ID NO:6-10的至少一者具有至少70％同一性， 例如与SEQ ID NO:6-10的至少一者具有至少75％、80％、85％、88％、90％、 92％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

(SEQ ID NO:6；人CIS蛋白同种型1；UniprotKB Q9NSE2)

MVLCVQGPRPLLAVERTGQRPLWAPSLELPKPVMQPLPAGAFLEEVA EGTPAQTESEPKVLDPEEDLLCIAKTFSYLRESGWYWGSITASEARQHLQ KMPEGTFLVRDSTHPSYLFTLSVKTTRGPTNVRIEYADSSFRLDSNCLSRP RILAFPDVVSLVQHYVASCTADTRSDSPDPAPTPALPMPKEDAPSDPALPAP PPATAVHLKLVQPFVRRSSARSLQHLCRLVINRLVADVDCLPLPRRMADYL RQYPFQL

(SEQ ID NO:7；人CIS蛋白同种型1片段：残基66-258，其中残基174- 202缺失，即缺乏内部PEST序列；用于与延伸蛋白B和C生成三聚复合物)

DLLCIAKTFSYLRESGWYWGSITASEARQHLQKMPEGTFLVRDSTHP SYLFTLSVKTTRGPTNVRIEYADSSFRLDSNCLSRPRILAFPDVVSLVQHY VASCTADTRSATAVHLKLVQPFVRRSSARSLQHLCRLVINRLVADVDCLPL PRRMADYLRQYPFQL

(SEQ ID NO:8；人CIS蛋白同种型1SOCS框(来自GenBank登录号： NP_034025.1)

SSARSLQHLCRLVINRLVADVDCLPLPRRMADYLRQYPFQL

(SEQ ID NO:9；小鼠CIS蛋白同种型1；GenBank登录号：NP_034025.1)

MVLCVQGSCPLLAVEQIGRRPLWAQSLELPGPAMQPLPTGAFPEEVT EETPVQAENEPKVLDPEGDLLCIAKTFSYLRESGWYWGSITASEARQHLQ KMPEGTFLVRDSTHPSYLFTLSVKTTRGPTNVRIEYADSSFRLDSNCLSRP RILAFPDVVSLVQHYVASCAADTRSDSPDPAPTPALPMSKQDAPSDSVLPI PVATAVHLKLVQPFVRRSSARSLQHLCRLVINRLVADVDCLPLPRRMADY LRQYPFQL

(SEQ ID NO:10；褐鼠CIS蛋白；GenBank登录号：AAI61930.1)

MVLCVQGSCPLLVVEQIGQRPLWAQSLELPGPAMQPLPTGAFPEEVT EETPVQSENEPKVLDPEGDLLCIAKTFSYLRESGWYWGSITASEARQHLQ KMPEGTFLVRDSTHPSYLFTLSVKTTRGPTNVRIEYADSSFRLDSNCLSRP RILAFPDVVSLVQHYVASCTADTRSDSPDPAPTPALPVPKPDAPGDPVLPIP VATAVHLKLVQPFVRRSSARSLQHLCRLVINRLVTDVDCLPLPRRMADYL RQYPFQL

在一些实施方案中，CIS或其片段的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6-10中 的一者的氨基酸序列。在其他实施方案中，CIS或其片段的氨基酸序列由SEQ ID NO:6-10中的一者的氨基酸序列中的一者构成。

在一些实施方案中，其中CIS结合配偶体或靶蛋白选自JAK1、JAK3、 IL-2Rβ、延伸蛋白B、延伸蛋白C和滞蛋白5或其片段。

JAK1或其CIS结合片段可以包含与SEQ ID NO:11-16中的至少一者具 有至少70％同一性，例如与SEQ ID NO:11-16中的至少一者具有至少75％、 80％、85％、88％、90％、92％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

(SEQ ID NO:11；智人JAK1蛋白；UniProtKB–P23458；活化环以粗体 表示；Tyr1034加下划线)

(SEQ ID NO:12；智人JAK3蛋白；UniProtKB-P52333；Tyr980以粗体 加下划线表示)

(SEQ ID NO:13；智人IL-2受体亚基β前体；UniProtKB–P14784；信 号肽氨基酸1-26加下划线；Tyr355、Tyr361和Tyr392各自的成熟序列编号 以粗体加下划线表示)

(SEQ ID NO:14；智人延伸蛋白B；UniProtKB–Q15370)

MDVFLMIRRHKTTIFTDAKESSTVFELKRIVEGILKRPPDEQRLYKDD QLLDDGKTLGECGFTSQTARPQAPATVGLAFRADDTFEALCIEPFSSPPEL PDVMKPQDSGSSANEQAVQ

(SEQ ID NO:15；智人延伸蛋白C；UniProtKB–Q15369)

MDGEEKTYGGCEGPDAMYVKLISSDGHEFIVKREHALTSGTIKAML SGPGQFAENETNEVNFREIPSHVLSKVCMYFTYKVRYTNSSTEIPEFPIAPE IALELLMAANFLDC

(SEQ ID NO:16；智人滞蛋白-5；UniProtKB–Q93034)

MATSNLLKNKGSLQFEDKWDFMRPIVLKLLRQESVTKQQWFDLFSD VHAVCLWDDKGPAKIHQALKEDILEFIKQAQARVLSHQDDTALLKAYIVE WRKFFTQCDILPKPFCQLEITLMGKQGSNKKSNVEDSIVRKLMLDTWNES IFSNIKNRLQDSAMKLVHAERLGEAFDSQLVIGVRESYVNLCSNPEDKLQI YRDNFEKAYLDSTERFYRTQAPSYLQQNGVQNYMKYADAKLKEEEKRA LRYLETRRECNSVEALMECCVNALVTSFKETILAECQGMIKRNETEKLHL MFSLMDKVPNGIEPMLKDLEEHIISAGLADMVAAAETITTDSEKYVEQLL TLFNRFSKLVKEAFQDDPRFLTARDKAYKAVVNDATIFKLELPLKQKGVG LKTQPESKCPELLANYCDMLLRKTPLSKKLTSEEIEAKLKEVLLVLKYVQ NKDVFMRYHKAHLTRRLILDISADSEIEENMVEWLREVGMPADYVNKLA RMFQDIKVSEDLNQAFKEMHKNNKLALPADSVNIKILNAGAWSRSSEKV FVSLPTELEDLIPEVEEFYKKNHSGRKLHWHHLMSNGIITFKNEVGQYDL EVTTFQLAVLFAWNQRPREKISFENLKLATELPDAELRRTLWSLVAFPKLK RQVLLYEPQVNSPKDFTEGTLFSVNQEFSLIKNAKVQKRGKINLIGRLQLT TERMREEENEGIVQLRILRTQEAIIQIMKMRKKISNAQLQTELVEILKNMF LPQKKMIKEQIEWLIEHKYIRRDESDINTFIYMA

(SEQ ID NO:17；智人JAK1蛋白JH1激酶结构域；残基854-1154)

DIVSEKKPATEVDPTHFEKRFLKRIRDLGEGHFGKVELCRYDPEGDN TGEQVAV)KSLKPESGGNHIADLKKEIEILRNLYHENIVKYKGICTEDGGN GIKLIMEFLPSGSLKEYLPKNKNKINLKQQLKYAVQICKGMDYLGSRQYV HRDLAARNVLVESEHQVKIGDFGLTKAIETDKE

多肽或多肽种类可以通过其氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性程 度(％同一性)或通过与一种参考氨基酸序列的％同一性大于另一种来定义。 通常通过GAP分析来确定多肽与参考氨基酸序列的％同一性(Needleman和 Wunsch(1970)；GCG程序)，其中参数为空位产生罚分＝5，空位延伸罚分＝0.3。 查询序列的长度为至少15个氨基酸，GAP分析在至少15个氨基酸的区域 上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度为至少50个氨基酸，GAP分 析在至少50个氨基酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度 为至少100个氨基酸，GAP分析在至少100个氨基酸的区域上比对两个序 列。甚至更优选地，查询序列的长度为至少250个氨基酸，GAP分析在至少 250个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析在整个长度 上比对两个序列。

技术人员在确定蛋白质或肽的特定氨基酸序列变体是否适用于本发明 时，许多考虑因素是有用的。这些考虑因素包括但不限于：(1)蛋白质或肽和 已知蛋白质结合配偶体或结合配偶体基序之间的相互作用的已知结构-功能 关系；(2)如序列比对算法所揭示，所关注的蛋白质的天然存在的同系物(例 如，旁系同源物和直系同源物)之间存在氨基酸序列保守性。值得注意的是， 许多生物信息学算法是本领域已知的，可成功预测功能作用，即蛋白质的氨 基酸序列中的特定氨基置换对其功能的“耐受性”。这种算法包括例如Shihab 等人(2013)描述的“通过隐马尔可夫模型的功能分析”(FATHMM)算法；和Ng 等人(2003)描述的“从容许分选不容许”算法；以及Sim等人(2012)最近所述。

SIFT计算器可在网站上在线获取：sift.bii.a-star.edu.sg/。FATHMM计算 器可在网站上在线获取：fathmm.biocompute.org.uk。对于所关注的任何氨基 酸序列(例如，对应于本文提供的SEQ ID NO中的任一个的序列)，可以生成 这样的“氨基酸置换矩阵”：其提供任何给定氨基酸置换对对应蛋白质的功能 的预测中性或有害性，例如与相互作用配偶体结合的能力。

可以通过许多已知的方法生成蛋白质的非天然存在的序列变体。这些方 法包括但不限于U.S.6,521,453所述的“基因改组”；Kopsidas等人(2007)所述 的“RNA诱变”；和“易错PCR方法”。易错PCR方法可分为(a)通过使核苷酸 浓度失衡和/或添加化合物诸如氯化锰来减少聚合酶的保真度的方法，(b)利 用核苷酸类似物的方法(参见例如U.S.6,153,745)，和(c)利用“诱变”聚合酶的 方法。

测定中所用的蛋白质的氨基酸序列变体的保留确认、功能丧失或获取可 以根据所评估的蛋白质功能在多种类型的测定，例如结合测定、激酶测定或 泛素化测定中确定。

小鼠

Cish

NK细胞的纯化和培养

从多个器官(脾、骨髓、血液)收集鼠科动物自然杀伤细胞，并通过将器 官强制通过70μm筛来制备单细胞混悬剂。通过悬浮于等渗percoll (Amersham Pharmacia Biotech)中并以1800×g离心从肝分离淋巴细胞。使用 抗CD49b(DX5)微珠(Miltenyi Biotec)根据制造商的说明书纯化NK细胞。通 过在补充有10％(v/v)胎牛血清(FCS)、L-谷氨酰胺(1mM；Gibco)、链霉素 (100μg/mL；Sigma)、青霉素(100IU/mL；Sigma)、庆大霉素(50ng ml

RNA测序和生物信息学分析

在Australia Genomic Research Facility,Melbourne使用Illumina HiSeq2000对在50ng ml

体外NK细胞增殖测定

将靶细胞(CHO,B16F10)接种至96X E-板的孔的100μl培养基中。使用 基于阻抗的

流式细胞术和细胞分选

在含有2％(v/v)FCS的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中使用适当的单克隆抗体 对单细胞悬浮液染色。如果必要，通过使用FoxP3/转录因子染色缓冲液套件 (eBioscience)根据制造商的指示进行细胞内染色。将FACS Verse、Fortessa和 AriaII(BD Biosciences)用于细胞分选和分析，通过碘化丙啶或Fluoro-Gold染 色排除死细胞。在PBS中稀释所有单细胞悬浮液，然后使用Advia血液学分 析仪(Siemens)进行分析和计数。除非另有说明，否则对NK1.1(PK136；1:100)、 CD19(1D3；1:500)、CD3(17A2；Biolegend；1:400)、CD122(TM-b1；1:200)、 CD132(4G3；1:200)、NKp46(29A1.4；1:100)、TCR-β(H57-5921；1:500)、 KLRG1(2F1；1:100)、CD27(LG.7F9；1:200)、FoxP3(FJK-16s；eBioscience； 1:400)、CD25(PC61；Biolegend；1:100)、Sca-1(D7；1:100)、B220(RA3-6B2； eBioscience；1:100)、Gr-1(1A8；1:200)、粒酶A(GzA-3G8.5；eBioscience；1:200)、 粒酶B(NGZB；eBioscience；1:200)、CD107a(104B；1:100)和IFN-γ(XMG1.2； 1:100)有特异性抗体来自BD Pharmingen。

实时定量PCR(Q-PCR)

使用RNeasy plus试剂盒(QIAGEN)分离总RNA，并使用Superscript III(Invitrogen)根据制造商的指示进行cDNA合成。在10μL(5μL FastStart SYBR GreenMaster Mix(Roche)、0.5pmol正向和反向引物和4μL cDNA)中进行PCR 反应。引物序列和PCR条件已有所描述(Kolesnik和Nicholson，2013)。在ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)上进行实时Q-PCR。针 对标准曲线定量mRNA水平，所述标准曲线使用对应于每个扩增PCR片段 的寡核苷酸的连续稀释和使用SDS2.2软件(AppliedBiosystems)生成。通过 将每个所关注的基因的量归一化为管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) 来确定相对表达。每种情况有三个生物学重复且测定一式两份进行。使用95％置信水平的非配对t检验进行统计学分析。

蛋白质印迹和瞬时转染

每个样品收集大约1.5×10

CYT-387激酶亲和试剂的合成以及与NHS琼脂糖凝胶的共价偶联

使用类似于CYT-387合成所述的程序制备氨基官能化CYT-387衍生物 (参见图6)。如上文所述，将修饰的CYT-387化合物固定化至NHS活化琼脂 糖凝胶4Fast Flow珠粒(GEHealthcare)上(Schirle等人，2012)。简言之，用 5mL DMSO洗涤1mL NHS-琼脂糖凝胶珠浆液两次，以80×g离心3min以沉 淀洗涤之间的基质。用DMSO重悬一个填充基质体积(500μL)以制备50％浆 液。将CYT-387(2μM最终体积)加入1mL NHS-珠粒浆液，然后是20μL三乙 胺并倒置混合。将反应浆液在室温下避光直立圆筒反应器上温育过夜。第二 天，将25μL乙醇胺加入反应，并且再次置于室温下避光直立圆筒反应器上 温育过夜。用5mL DMSO洗涤CYT-387偶联的NHS-琼脂糖凝胶珠两次， 并将基质重悬于乙醇中，避光储存于4℃下。

从细胞裂解物富集激酶

用KALB裂解缓冲液洗涤CYT-387结合的树脂两次，然后进行激酶富 集。使用160μL50％Cyt387结合的树脂进行六次单独的激酶富集(Cish

胰蛋白酶消化

使用FASP蛋白质消化试剂盒(Protein Discovery,Knoxville,TN)如上所 述(Wisniewski等人，2009)制备树脂捕获的蛋白质以及来源于每个生物学重 复的等量全细胞裂解物(～400μg)的洗脱液以用于质谱分析，但进行以下修改。 用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(5mM最终浓度)还原蛋白质，用溶于50mM NH

质谱和数据分析

在nanoAcquity系统(Waters,Milford,MA,USA)上通过纳升级反相液相 色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析酸化肽混合物，nanoAcquity系统偶联至配备 有用于自动化MS/MS的纳电喷雾离子源(Thermo Fisher Scientific,Bremen, Germany)的Q-Exactive质谱仪。将肽混合物装载到具有180μm内径的20mm 捕集柱(nanoAcquity UPLC 2G-V/MTrap 5mmSymmetry C18)的缓冲液A(0.1％ 甲酸、3％乙腈、Milli-Q水)中，并使用具有75μm内径的150mm柱(nanoAcquity UPLC 1.7μm BEH130 C18)在60min线性梯度组上以400nL/min的恒定流速 通过反相色谱从3-55％缓冲液B(0.1％甲酸、80％乙腈、Milli-Q水)分离。Q-Exactive以数据依赖性模式运行，在一次全扫描和随后十个丰度最大的峰的 MS/MS扫描之间自动切换。使用Exactive系列2.1版build 1502和Xcalibur 3.0控制该仪器。全扫描(m/z350–1,850)在200m/z下以70,000的分辨率获取。 依次分离10个强度最大的离子，目标值为10000个离子，分离宽度为2m/z， 并使利用归一化碰撞能量为19.5和阶梯碰撞能量为15％的HCD碎片化。对 于全MS扫描，最大离子累积时间27被设定为50ms，对于MS/MS为200ms。 底部填充比率被设定为5％，启用动态排除并设定为90秒。用MaxQuant(版 本1.5.0.25)处理由高分辨率MS/MS谱图构成的原始文件，用于使用 Andromeda搜索引擎36进行特征检测和蛋白质鉴定。在UniProtKB/Swiss- Prot小鼠数据库(LudwigNR)和单独的反向诱饵数据库搜索提取峰列表，以使 用允许最多3次错误切割的严格胰蛋白酶特异性经验性地评估错误发现率 (FDR)。所需的最小肽长度被设定为7个氨基酸。修饰：Cys的脲甲基化被设 定为固定修饰，而蛋白质的N-乙酰化、Met的氧化、焦谷氨酸的添加(在N- 末端Glu和Gln)、磷酸化(Ser、Thr和Tyr)、脱酰胺化(Asn、Gln和Arg)被设 定为可变修饰。前体离子和碎片离子的质量容差分别为20ppm和0.5Da。 MaxQuant中的“运行之间匹配”选项用于转移在以高质量准确度的匹配前体 为基础的运行之间作出的鉴定(Cox等人，2014)。使用靶标-诱饵方法以1％ 的错误发现率(FDR)过滤PSM和蛋白质鉴定。蛋白质鉴定基于两个独特肽的 最小值。

定量蛋白质组学管线

使用Pipeline Pilot(Biovia)和R开发的定制管线进行进一步分析，所述 开发利用MaxQuant输出文件allPeptides.txt、peptides.txt和evidence.txt进 行。特征被定义为肽序列、电荷和修饰的组合。每组中至少一半数量的重复 中不存在的特征将被移除。从反向数据库的命中鉴定的蛋白质和仅具有一个 独特肽的蛋白质也被移除。为了校正注射体积可变性，通过将特征强度转换 为底数2的对数，然后将每个值乘以所有重复的最大中值强度与中值重复强 度之比来归一化。分配至相同蛋白质的特征，由于其化学物理性质和电荷状 态，在强度范围中存在差异。为了进一步校正这些差异，将每个强度值乘以 蛋白质的所有特征的中值强度的最大值与该特征的中值强度之比。缺失值使 用数值的随机正态分布填补，其中平均值设定为数值的实际分布的平均值减 去1.8倍标准偏差，标准偏差为测定强度分布的标准偏差的0.5倍(Cox等人， 2014)。使用Wilcoxon秩和检验计算组间差异表达的概率，排除任何非独特 序列和具有除氧化和脲甲基化之外的修饰的任何特征。使用Benjamini– Hochberg方法校正多次测试的概率值。引入函数y＝-log

用于肽筛选的GST-CIS蛋白的制备

将人Cish的一部分(编码残基66-258)克隆至载体pGTVL2。如上文所述， 将人延伸蛋白C(残基17–112)和全长延伸蛋白B克隆至载体 pACYCDUET(Bullock等人，2006)。将两种质粒转化到BL21(DE3)，以进行 CIS/延伸蛋白C/延伸蛋白B三元复合物(CIS-SH2-BC)的共表达。在18℃下 用0.4mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Luria肉汤培养基中的培养 物过夜，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于50mM HEPES pH7.5、500mM NaCl、5mM咪唑、5％甘油中，并通过超声裂解细胞。通过加入0.15％聚乙 烯亚胺pH8沉淀DNA，通过以21,000rpm离心排除不溶性物质。在谷胱甘 肽琼脂糖凝胶柱上纯化GST标记的CIS蛋白复合物，并用20mM还原型谷 胱甘肽在包含50mM HEPES、300mM NaCl、0.5mM TCEP的缓冲液中洗脱。将纯化的蛋白质浓缩至0.75mg ml

肽阵列合成和筛选

如所述使用Invatis点阵列合成仪在官能化硝基纤维素膜上合成肽阵列 (Li和Wu，2009)。对于阵列探测，在室温下Tris缓冲的盐水/0.05％Tween- 20(TBS-T)pH7.2的5％脱脂乳中封闭膜结合的肽5h。在用TBS-T洗涤之后， 将0.8ng ml

等温滴定量热法(ITC)

使用Microcal ITC200(GE Healthcare)进行等温量热滴定。磷酸肽从 Genscript获得。制备其中内部PEST区(Δ174-202)缺失的优化的GST-CIS蛋 白构建体。针对缓冲液(20mM Tris pH8.0、100mM NaCl、2mM 2-巯基乙醇) 透析所得的三元GST-CIS-SH2-SB复合物。除非另有说明，否则实验在298K 下进行。通常，将12×3.15μl 300μM磷酸肽注射液滴定至30μM GST-CIS- SH2-SB三元复合物溶液。从结合实验的原始数据减去GST-CIS-SH2-BC的稀释热。使用评价软件Microcal Origin 5.0版分析数据。结合曲线拟合单点 结合模式，并且从重复实验确定所有K

E3连接酶测定

基本上如上文所述进行JAK1的CIS介导的泛素化(Babon等人，2013)。 在存在2.5mM Mg/ATP的情况下，将CIS E3连接酶复合物(CIS-SH2-BC以 及滞蛋白5和Rbx2；2.5μM)与泛素(50μM)、人E1(100nM)、纯化的重组E2 (UbcH5c,2.5μM)和全长JAK1一起在37℃下温育不同的时间。FLAG标记的JAK1通过以下步骤产生：在293T细胞中表达，并使用抗FLAG免疫沉淀和 游离的FLAG肽洗脱来回收。JAK1泛素化通过与抗磷酸化JAK1一起进行 蛋白质印迹，然后在4-20％Tris/甘氨酸凝胶上分离来可视化。

激酶测定

激酶抑制测定基本上如所述进行(Babon等人，2012)。简言之，将130μM STAT5b肽(SEQ ID NO:18RRAKAADGYVKPQIKQVV)与5nM JAK1一起 在20mM Tris pH8.0、100mM NaCl、5mM 2-巯基乙醇、0.2mg ml

肿瘤细胞系

C57BL/6鼠科动物淋巴细胞系RMA是来源于Rauscher鼠科动物白血病 病毒诱导的RBL-5细胞系的T细胞淋巴瘤。分别用编码mCherry或GFP的 逆转录病毒载体(鼠科动物干细胞载体)转导生成细胞系RMA-mCherry和 m157

实验性肿瘤转移

将每个实验的6-14只小鼠组用于实验性肿瘤转移。这些组的大小用于 确保检测生物学差异的足够能力。根据本研究中预先确立的标准没有小鼠被 排除，并且无主动随机化应用于实验组。研究者并非不了解实验期间和/或评 估结果时的组分配。除非特别说明，否则所有肿瘤实验均进行一次。将 B16F10黑素瘤、RM-1前列腺癌或LWT1黑素瘤细胞的单细胞悬浮液静脉 内注射至指定小鼠品系的尾静脉(2.5-7.5×10

原位E0771.L.MB和自发性E0771转移

为了产生原发性肿瘤，将1×10

CYT-387合成

液相色谱质谱(LCMS)通过使用反相高效液相色谱(HPLC)分析的 Finnigan LCQAdvantage Max进行(柱：Gemini 3μC18 20×4.0mm 110A)溶剂 A：水0.1％甲酸，溶剂B：乙腈0.1％甲酸，梯度：10-100％B超过10min， 检测：100-600nm和电喷雾电离(ESI)。所有提交用于生物化学测定的化合物 均被评估为具有通过在254nm UV吸收下的HPLC分析测定的95％的纯度。 使用

4-(4-((2-(4-(乙氧基羰基)苯基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸苄酯(S3)

将p-TsOH(0.978g,5.13mmol)加入磁力搅拌的于二氧杂环乙烷(20mL)的 嘧啶S2(1.50g,5.71mmol)和苯胺S1(2.31g,7.42mmol)中的悬浮液中。将混合 物加热回流24h。冷却混合物，在DCM(250mL)中稀释并用NaHCO

4-(4-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)苯甲酸乙酯(S4)

将化合物S3(500mg,0.93mmol)溶解于MeOH(75mL)和THF(50mL)中， 在45℃下使用Pd/C(10％)管柱，使溶液在全H

4-(4-((4-(4-(5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)苯甲酸(S5)

在N

4-(4-((4-(4-(5-氨基戊酰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-(氰甲基)苯甲酰胺(S6)

在室温、N

迄今为止，人们对理解抑制NK细胞应答的抑制性信号有着极大的兴趣， 但仍不理解细胞内IL-15信号传导如何关闭。细胞因子信号传导抑制剂 (SOCS)基因家族成员是STAT5应答基因，并且通常被诱导以限制作为经典 负反馈系统的一部分的细胞因子受体信号传导的程度。为了研究哪些SOCS 蛋白可能调节IL-15信号传导，从而调节NK细胞发育和功能，本发明人首 先分析了培养的NK细胞中的IL-15诱导的SOCS表达。在2h的IL-15治疗内诱导NK细胞中的Cish、Socs1、Socs2和Socs3 mRNA，Cish的早期和瞬 时诱导代表通过其靶细胞因子诱导Socs(图1a)。与饱和浓度的IL-15中mRNA 的快速诱导一致，在60分钟的刺激内在NK细胞裂解物中检测到CIS蛋白 (图1b)。

为了研究CIS在IL-15信号传导中的生理作用，本发明人利用种系Cish 缺失的小鼠(Cish

为了检查Cish-裸NK细胞中异常IL-15信号传导的程度，本发明人对 Cish

SOCS蛋白是E3泛素连接酶复合物的衔接子，它使SOCS相互作用蛋 白泛素化，靶向该蛋白以进行蛋白酶体降解(Zhang等人，1999)。CIS是第一 个被发现的SOCS家族蛋白质(Matsumoto等人，1997)，虽然其被报道为与 IL-2受体复合物缔合(Aman等人，1999)，但是如何准确地介导该相互作用 仍不清楚。Cish

为了证实JAK1酶活性升高和检查CIS缺陷作用的选择性如何，本发明 人利用基于质谱的方法来定量活性JAK水平的变化。合成泛JAK抑制剂(来 源于CYT-387；JAK1/2/3)，将其偶联至琼脂糖凝胶珠粒并用作亲和捕获试剂， 然后进行胰蛋白酶消化和质谱分析。由于抑制剂结合至激酶结构域中的ATP 结合位点，因此优先富集处于活性构象的激酶。通过Cish

表1.CYT-387亲和力富集后的定量蛋白质组学分析，其示出了与图2相关 的培养的Cish

表2.定量蛋白质组学分析示出了培养的Cish

与其他SOCS蛋白一样，CIS结构域含有结合至靶蛋白中的磷酸化酪氨 酸基序和SOCS框的SH2结构域，SH2结构域与延伸蛋白B和C、支架蛋 白滞蛋白5和RING蛋白Rbx2一起构成E3泛素连接酶。鉴于在Cish

本发明人接下来研究了CIS是否可以在不存在IL-2受体复合物的情况 下调节JAK水平。293T细胞(其缺乏IL-2R)中JAK的过表达引起组成型JAK 自磷酸化。CIS或SOCS1的共表达将JAK1水平降低至可比较的程度，对应 的JAK1磷酸化也减少。相比之下，在该测定中SOCS3不能抑制JAK活性 (SOCS3需要受体结合)(图3b)。出乎意料的是，虽然本发明人观察到CIS结 合至JAK3 Tyr980肽(图3a)，但在该测定中JAK3磷酸化未受抑制(图3b)。

本发明人接下来查询哪些CIS结构域是JAK1抑制必须的。SOCS框中 的CIS-SH2结构域(R107K)或滞蛋白-5结合位点(P241A/L242A/P243A)的突 变足以减少CIS抑制活性(图3c)。另外，细胞与蛋白酶体抑制剂(MG132)的 预温育减少了CIS介导的JAK1磷酸化调节(图3c)，支持CIS由此通过其 SH2结构域结合至JAK1，然后靶向JAK1以进行蛋白酶体降解的模型。免 疫共沉淀用于证实JAK1和CIS之间的复合物形成(图3d)。为了正式证实 CIS介导的JAK1泛素化，在无细胞体系中将Flag标记的全长JAK1蛋白(通 过在293T细胞中表达产生)与重组hCIS-SH2-SB复合物、滞蛋白5、Rbx2、 E1、E2(UbcH5c)和游离的泛素一起温育。如上文通过蛋白质印迹检测到的 高分子量物质所示，CIS有效地介导磷酸化JAK1的泛素化(图3e)。这些数 据共同证实CIS能够直接调节JAK蛋白水平。

过去，仅SOCS1和SOCS3显示出结合至和调节JAK活性。SOCS1和 SOCS3经由非经典SH2来抑制JAK，所述SH2结合至JAK1、JAK2和Tyk2 插入环中存在的“GQM”基序，并使激酶抑制区(KIR)结合至催化裂口 (Kershaw等人，2013)。CIS不含有“KIR”区，并且先前未提出它能够调节JAK 酶活性。然而，有几条证据表明涉及另外的机制。首先，本发明人偶尔观察 到在不存在总JAK1水平变化的情况下JAK1磷酸化的抑制(例如，图3c)。 其次，尽管野生型NK细胞的MG132治疗引起内源性JAK1磷酸化增加， 但本发明人未观察到延长的动力学，以及实际上JAK磷酸化的迅速减少。这 与CIS的表达增加相关，所述CIS被保护免于蛋白酶体降解(图9d)。所以， 本发明人询问CIS是否可以抑制JAK1激酶活性。使用体外激酶测定，CIS-SH2-BC复合物能够抑制底物肽的JAK1磷酸化，IC

Cish

所以，本发明人通过用一组已知激活和受NK细胞控制的同系肿瘤细胞 系攻击Cish

类似地，当向Cish

使用针对抑制性受体PD-1和CTLA-4的抗体的联合免疫疗法目前是针 对人晚期黑素瘤的最有效治疗(Larkin等人，2015；Postow等人，2015； Yoshimura等人，2015)。为了将该基准免疫疗法与NK细胞中的Cish缺失相 比较，向Cish

Cish的诱导首先显示为对白介素(IL)-3、IL-2和促红细胞生成素(EPO)的 应答，并且CIS的强制表达已显示出通过这些受体抑制信号传导(Matsumoto 等人，1997；Aman等人，1999)。尽管得到这些观察结果，但在这些通路中 的生理作用的证据仍然有限。老年(10-18月龄)Cish

严重脱靶效应和耐药性目前限制了我们对传统化学疗法(通常大部分癌 症的第一线治疗)的使用。因此，仍需要发现新靶向疗法和免疫疗法，所述靶 向疗法和免疫疗法可以联合使用和作为化学疗法的补充。

伊匹单抗(Ipilimumab)是靶向效应和调节T细胞上的CTLA-4的基于抗 体的疗法，并且被批准用于治疗晚期恶性黑素瘤，提供10-12％的肿瘤应答以 及一些复杂的免疫相关不良事件。这是靶向所谓的免疫检查点分子的一流单 克隆抗体。抗体(相同种类)识别PD-1(在T细胞和NK细胞上表达)或其配体、 PD-L1(一旦发生T细胞活化，即在很多肿瘤上表达)，并且帕姆单抗 (pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)(抗人PD-1)在晚期黑素瘤、肾癌、非 小细胞肺癌(NSCLC)和其他癌症适应症的I/II期试验中已经产生20-50％的 客观应答率。针对晚期恶性黑素瘤的纳武单抗和伊匹单抗联合产生了甚至更 迅速和显著的抗癌效应，包括抗转移性疾病。尽管取得了这些进展，但是一 些癌症(例如，前列腺癌、结肠直肠癌)显示出并不显著的应答，甚至在黑素 瘤中仍存在许多其中抗CTLA-4和抗PD-1/PD-L1联合无效的患者。

在此，本发明人示出了，NK细胞中IL-15诱导的CIS累积充当限制NK 细胞功能的细胞内免疫检查点。CIS功能的消融释放了对NK细胞活性的抑 制，导致实验性肿瘤转移的急剧减少，大于CTLA-4/PD-1阻断的观察结果， 并且无不良反应的迹象。我们的结果揭示，CIS是新的NK细胞检查点，并 且表明人中CIS功能的有效治疗阻断可以改善某些癌症的预后。

实施例10 CIS N-末端区或PEST基序的缺失增强了CIS抑制JAK1激 酶活性的能力

为了研究CIS N-末端区和PEST基序的作用，本发明人制备了人CIS的 大肠杆菌(E.coli)表达构建体，该构建体缺乏PEST基序(残基173-202； ΔPEST)、前24个残基(ΔN34)、N-末端区(残基1-66)和PEST基序(ΔNTΔPEST) 或对应于全长蛋白质(CIS)。所有CIS蛋白与延伸蛋白B和C一起表达，并 且如上文所述纯化三聚复合物。然后使用体外激酶反应评估抑制JAK1激酶 结构域(JH1)的能力。与之前数据(图3F)一致，CIS-ΔNTΔPEST抑制JAK1， IC

实施例11 CIS-SH2与磷酸肽的相互作用对于JAK1激酶活性的CIS抑 制是必需的

磷酸苯酯(PP)加入体外激酶反应消除了所有CIS构建体抑制JAK1激酶 活性的能力(图11B)。类似地，对应于单磷酸化JAK1或双磷酸化JAK3、活 化环的游离磷酸肽的添加显著降低了CIS抑制JAK1激酶活性的能力(图11C)。这些数据进一步证实了SH2结构域与磷酸酪氨酸基序的经典结合对于 CIS抑制JAK1活性是必需的。

实施例12 CIS N-末端区或PEST基序的缺失不对与磷酸肽的结合具有 主要影响

使缺乏PEST基序(残基173-202；ΔPEST)、前24个残基(ΔN34)、N-末 端区(残基1-66)和PEST基序(ΔNTΔPEST)或对应于全长CIS的CIS构建体 与延伸蛋白B和C一起表达，并使用ITC测试其结合JAK1磷酸肽的能力。 所有构建体以2.2-10μM的亲和力结合磷酸肽，观察到N-末端34个残基的 缺失时结合降低最大(图12A)。类似地，全长CIS和CIS-ΔNTΔPEST以可比 较的亲和力结合JAK3磷酸肽(图12B)。

这些数据共同表明N-末端区和/或PEST基序是自体抑制的，而这些区 域对SH2结构域结合磷酸肽的能力影响最小，它们对CIS抑制JAK1激酶活 性的能力具有主要影响。不希望受理论的限制，翻译后修饰或构象变化(诸如 对于结合至磷酸酪氨酸)可能释放自体抑制，并且需要活化CIS。这表明稳定 N-末端区和PEST基序的构象/位置或阻断CIS的翻译后修饰的试剂可以是 有效的CIS阻断剂。类似地，模拟N-末端区或PEST基序的试剂也可以是有 效的CIS阻断剂。

实施例13 CIS-SH2结构域结合至延伸的肽界面

ITC用于研究侧接磷酸酪氨酸(JAK1 Y1034)的哪个残基有助于结合亲和 力(和特异性)。位于+5、+3或-3位置的丙氨酸置换仅对结合具有适度作用(在 +3处减少～4倍)(图13)。这表明CIS-SH2结构域与其靶肽序列进行多次接 触。

实施例14 CIS抑制是剂量依赖性的

CIS小分子抑制剂不可能再现CIS功能的完全丧失。所以，本发明人研 究了一个等位基因的丧失是否足以增强NK细胞对IL-15的应答。从Cish

实施例15 CIS-SH2结构域作为治疗靶标的进一步验证

本发明人使用CRISPR技术制备了Cish基因中携带种系突变的“敲入” 突变小鼠。该突变将SH2结构域中的Arg107变为Lys，消除了SH2与磷酸 肽的结合。突变的作用使用重组蛋白和ITC结合(未示出)证实，并且与图3C 中的数据一致，其显示该突变消除了CIS抑制JAK1磷酸化的能力。从SH2 突变小鼠(Cish

实施例16 CIS诱导的动力学与人NK细胞中JAK/STAT信号传导的抑 制一致

人和小鼠CIS在氨基酸水平上具有90.7％同一性。类似地，人和小鼠 JAK1具有94.4％同一性，而活化环具有100％保守性。原代人NK细胞和许 多人NK细胞系的免疫印迹分析显示，IL-15处理1-2h诱导了CIS，并且伴 随着JAK1和STAT5磷酸化减少。这些数据与CIS抑制JAK/STAT信号传导 一致(图15)。此外，虽然用IL-15和蛋白酶体抑制剂(MG-132)处理原代人NK 细胞2h足以提高总JAK1和CIS水平，但是JAK1磷酸化仍然减少(图15A)。 这支持了以下前提：CIS经由JAK1的泛素化和JAK自磷酸化的抑制来抑制 人NK细胞中的IL-15信号传导，与我们使用小鼠NK细胞的结果一致。

此外，IL-15处理在人NK细胞系NK-92和KHYG-1中诱导Cish mRNA(图16)。值得注意的是，Cish诱导的程度远大于Socs1和Socs3的观 察结果，即使在很低水平，Socs1和Socs3也会被诱导(图16)。这很好地预示 了，在无其他SOCS家族成员的补偿的情况下，CIS的抑制引起了IL-15信 号传导的增强。

实施例17 CIS上的磷酸化和泛素化位点的鉴定

本发明人示出了CIS本身受蛋白酶体降解调节(图9D和图15A)，还提 出了CIS的翻译后修饰可以调节N-末端/PEST介导的自体抑制。为了鉴定 潜在磷酸化和泛素化位点，使FLAG标记的CIS在293T细胞中表达，并进 行亲和力纯化，然后通过质谱分析。鉴定出六个磷酸化位点，其中五个位点 在小鼠和人CIS之间是保守的(图17和表3)。在PEST基序(pSDpSPDPAPpT) 内检测到三个磷酸化事件，与以下观点一致：磷酸化可以改变该基序的分子 内定位和/或结合相互作用从而改变CIS功能。还鉴定了三个泛素化位点(图 17，表3)，与之前报道一致(Jensik等人，2015)。这些结果鉴定了CIS内可 以通过泛素化或磷酸化修饰的许多残基。

实施例18 CIS是具有升高的和功能性TGF-β的疾病中的治疗靶标

若干使用抗TGF-β防止EMT(上皮至间质转化)的临床试验正在进行中， 然而TGF-β也是强效免疫抑制剂(Chen等人，2016)。本发明人发现，CIS裸 NK细胞在很大程度上难以抑制体外TGF-β介导的增殖(图18)。

然而，虽然与野生型细胞相比，CIS裸NK细胞能够耐受TGF-β，但是 TGF-β受体信号传导仍存在一些抑制作用，因为CIS裸NK细胞的增殖小于 TGF-β受体裸NK细胞(TgfbRII

实施例19 Cish缺陷对于NK细胞依赖性抗转移疗法更有效

本发明人接下来试图将Cish缺陷与同期免疫疗法比较，包括免疫检查 点阻断(抗PD-1、抗CTLA-4、抗CD96)和细胞因子(IFNα/β,IL-2)，它们促进 了B16F10实验性转移模型中的NK细胞功能。值得注意的是，Cish缺陷型 小鼠比用抗PD-1、I型IFN(IFN-αβ)或IL-2方案处理的野生型小鼠更能耐受 B16F10肺转移(图20A)。所有这些免疫疗法的使用在治疗晚期人黑素瘤方面 已取得了一定程度的成功。虽然B16F10转移的水平在cIg处理的Cish

总体来说，这些实验表明NK细胞抗转移活性的CIS调节独立于免疫检 查点抗体的抗转移活性。最后，用BRAF

实施例20肉瘤的治疗

Cish

实施例21急性骨髓性白血病的治疗

NK细胞抗肿瘤功效的开创性实例处于单倍体相同的骨髓移植中，其中 供体NK细胞与宿主急性骨髓性白血病(AML)强烈反应(Ruggeri等人，2016)， 表明如果这种NK细胞充分活化，AML可能对自身NK细胞具有免疫原性。 本发明人发现，当用编码AML诱导的癌基因MLL-AF9的慢病毒转染自身 骨髓，并且注射至WT小鼠时，这些小鼠在注射后约40天死于AML(图23)。 相比之下，如果用MLL-AF9表达骨髓注射Cish

实施例22 CIS缺陷促进体内NK细胞增殖和分化

初始实验表明，在体内稳态下，Cish

实施例23 MCA1956肉瘤的增强控制需要NK细胞和CD8 T细胞

当皮下注射免疫原性MCA诱导的纤维肉瘤MCA1956时，Cish

实施例24 Cish

鉴于NK细胞和CD8 T细胞之间转录调节、效应子程序和细胞因子依赖 性的相似性，体内缺乏明显的CD8 T细胞表型稍微出乎意料。为了特别测试 CD8 T细胞是否对IL-15或抗原受体刺激具有超应答性，将6-8周龄WT- Ly5.1(n＝3)和Cish

通过用PMA/离子霉素刺激4小时，然后是细胞内染色和FACS分析来 评估IFNγ产生。在所有测试条件下，Cish

在培养的第4天通过FAC分析经由CTV稀释的增殖和表面标记物表达 来检查培养物(图27)。在不存在αCD3刺激的情况下，在IL-15

在所有检查条件下，WT和Cish

实施例25肿瘤微环境中的IL-15的水平升高诱导肿瘤侵润性NK细胞 中的Cish水平升高

本发明人确定IL-15迅速诱导培养NK细胞中的Cish表达，并且在IL- 15刺激后1小时后诱导CIS蛋白表达。为了可视化体内Cish表达，利用 Cish-lacZ报告基因(Cish

实施例26人Cish

为了评估人Cish

本领域的技术人员将会理解，可以如具体实施方案中所示对本发明进行 许多变化和/或修改，而不脱离广泛描述的本发明的精神或范围。所以，本发 明的实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。

本专利申请要求2016年12月16日提交的AU 2015905220的优先权， 该专利的全部内容以引用的方式并入本文。

本文引用的所有出版物据此以引用的方式整体并入。当引用URL或其 他此类标识符或地址时，应当理解此类标识符可改变，互联网上的具体信息 是不断变化的，但等同的信息可通过搜索互联网获得。此类信息引用证实了 其可用性和公开传播。

对已经包括在本说明书中的文档、法案、材料、装置、文章等等的任何 讨论仅仅是出于为本发明提供背景的目的。并不视为承认任何或全部这些事 项构成现有技术基础的一部分，或是与本发明相关的领域中的普通常识，因 为它在本专利申请的每项权利要求的优先权日之前存在。

表3.CIS中检测到的磷酸化和泛素化位点汇总

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序列表

<110> 沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院

<120> NK细胞中对细胞因子诱导的SH2蛋白的抑制

<130> P20137343WPD

<150> AU 2015905220

<151> 2015-12-16

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> 磷酸化酪氨酸

<400> 1

Ala Ile Glu Thr Asp Lys Glu Tyr Tyr Thr Val Lys Asp Asp Arg Asp

1 5 10 15

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> X

<222> (3)..(3)

<223> [F2PMP]2-磷酸酪氨酰模拟物

4-(膦酰二氟甲基)苯基丙氨酸部分

<400> 2

Lys Glu Xaa Thr Val

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> 磷酸化残基

<400> 3

Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> 磷酸化酪氨酸

<400> 4

Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> 磷酸化酪氨酸

<400> 5

Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp

1 5 10

<210> 6

<211> 258

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Val Leu Cys Val Gln Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Glu Arg

1 5 10 15

Thr Gly Gln Arg Pro Leu Trp Ala Pro Ser Leu Glu Leu Pro Lys Pro

20 25 30

Val Met Gln Pro Leu Pro Ala Gly Ala Phe Leu Glu Glu Val Ala Glu

35 40 45

Gly Thr Pro Ala Gln Thr Glu Ser Glu Pro Lys Val Leu Asp Pro Glu

50 55 60

Glu Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Glu Ser

65 70 75 80

Gly Trp Tyr Trp Gly Ser Ile Thr Ala Ser Glu Ala Arg Gln His Leu

85 90 95

Gln Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Thr His Pro

100 105 110

Ser Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr Arg Gly Pro Thr Asn

115 120 125

Val Arg Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Ser Phe Arg Leu Asp Ser Asn Cys

130 135 140

Leu Ser Arg Pro Arg Ile Leu Ala Phe Pro Asp Val Val Ser Leu Val

145 150 155 160

Gln His Tyr Val Ala Ser Cys Thr Ala Asp Thr Arg Ser Asp Ser Pro

165 170 175

Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Pro Lys Glu Asp Ala Pro

180 185 190

Ser Asp Pro Ala Leu Pro Ala Pro Pro Pro Ala Thr Ala Val His Leu

195 200 205

Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg Ser Leu Gln

210 215 220

His Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg Leu Val Ala Asp Val Asp Cys

225 230 235 240

Leu Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp Tyr Leu Arg Gln Tyr Pro Phe

245 250 255

Gln Leu

<210> 7

<211> 164

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Glu Ser Gly

1 5 10 15

Trp Tyr Trp Gly Ser Ile Thr Ala Ser Glu Ala Arg Gln His Leu Gln

20 25 30

Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Thr His Pro Ser

35 40 45

Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr Arg Gly Pro Thr Asn Val

50 55 60

Arg Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Ser Phe Arg Leu Asp Ser Asn Cys Leu

65 70 75 80

Ser Arg Pro Arg Ile Leu Ala Phe Pro Asp Val Val Ser Leu Val Gln

85 90 95

His Tyr Val Ala Ser Cys Thr Ala Asp Thr Arg Ser Ala Thr Ala Val

100 105 110

His Leu Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg Ser

115 120 125

Leu Gln His Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg Leu Val Ala Asp Val

130 135 140

Asp Cys Leu Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp Tyr Leu Arg Gln Tyr

145 150 155 160

Pro Phe Gln Leu

<210> 8

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Ser Ser Ala Arg Ser Leu Gln His Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg

1 5 10 15

Leu Val Ala Asp Val Asp Cys Leu Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp

20 25 30

Tyr Leu Arg Gln Tyr Pro Phe Gln Leu

35 40

<210> 9

<211> 257

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 9

Met Val Leu Cys Val Gln Gly Ser Cys Pro Leu Leu Ala Val Glu Gln

1 5 10 15

Ile Gly Arg Arg Pro Leu Trp Ala Gln Ser Leu Glu Leu Pro Gly Pro

20 25 30

Ala Met Gln Pro Leu Pro Thr Gly Ala Phe Pro Glu Glu Val Thr Glu

35 40 45

Glu Thr Pro Val Gln Ala Glu Asn Glu Pro Lys Val Leu Asp Pro Glu

50 55 60

Gly Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Glu Ser

65 70 75 80

Gly Trp Tyr Trp Gly Ser Ile Thr Ala Ser Glu Ala Arg Gln His Leu

85 90 95

Gln Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Thr His Pro

100 105 110

Ser Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr Arg Gly Pro Thr Asn

115 120 125

Val Arg Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Ser Phe Arg Leu Asp Ser Asn Cys

130 135 140

Leu Ser Arg Pro Arg Ile Leu Ala Phe Pro Asp Val Val Ser Leu Val

145 150 155 160

Gln His Tyr Val Ala Ser Cys Ala Ala Asp Thr Arg Ser Asp Ser Pro

165 170 175

Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Ser Lys Gln Asp Ala Pro

180 185 190

Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala Val His Leu Lys

195 200 205

Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg Ser Leu Gln His

210 215 220

Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg Leu Val Ala Asp Val Asp Cys Leu

225 230 235 240

Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp Tyr Leu Arg Gln Tyr Pro Phe Gln

245 250 255

Leu

<210> 10

<211> 257

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 10

Met Val Leu Cys Val Gln Gly Ser Cys Pro Leu Leu Val Val Glu Gln

1 5 10 15

Ile Gly Gln Arg Pro Leu Trp Ala Gln Ser Leu Glu Leu Pro Gly Pro

20 25 30

Ala Met Gln Pro Leu Pro Thr Gly Ala Phe Pro Glu Glu Val Thr Glu

35 40 45

Glu Thr Pro Val Gln Ser Glu Asn Glu Pro Lys Val Leu Asp Pro Glu

50 55 60

Gly Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Glu Ser

65 70 75 80

Gly Trp Tyr Trp Gly Ser Ile Thr Ala Ser Glu Ala Arg Gln His Leu

85 90 95

Gln Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Thr His Pro

100 105 110

Ser Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr Arg Gly Pro Thr Asn

115 120 125

Val Arg Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Ser Phe Arg Leu Asp Ser Asn Cys

130 135 140

Leu Ser Arg Pro Arg Ile Leu Ala Phe Pro Asp Val Val Ser Leu Val

145 150 155 160

Gln His Tyr Val Ala Ser Cys Thr Ala Asp Thr Arg Ser Asp Ser Pro

165 170 175

Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Val Pro Lys Pro Asp Ala Pro

180 185 190

Gly Asp Pro Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala Val His Leu Lys

195 200 205

Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg Ser Leu Gln His

210 215 220

Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg Leu Val Thr Asp Val Asp Cys Leu

225 230 235 240

Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp Tyr Leu Arg Gln Tyr Pro Phe Gln

245 250 255

Leu

<210> 11

<211> 1154

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Met Gln Tyr Leu Asn Ile Lys Glu Asp Cys Asn Ala Met Ala Phe Cys

1 5 10 15

Ala Lys Met Arg Ser Ser Lys Lys Thr Glu Val Asn Leu Glu Ala Pro

20 25 30

Glu Pro Gly Val Glu Val Ile Phe Tyr Leu Ser Asp Arg Glu Pro Leu

35 40 45

Arg Leu Gly Ser Gly Glu Tyr Thr Ala Glu Glu Leu Cys Ile Arg Ala

50 55 60

Ala Gln Ala Cys Arg Ile Ser Pro Leu Cys His Asn Leu Phe Ala Leu

65 70 75 80

Tyr Asp Glu Asn Thr Lys Leu Trp Tyr Ala Pro Asn Arg Thr Ile Thr

85 90 95

Val Asp Asp Lys Met Ser Leu Arg Leu His Tyr Arg Met Arg Phe Tyr

100 105 110

Phe Thr Asn Trp His Gly Thr Asn Asp Asn Glu Gln Ser Val Trp Arg

115 120 125

His Ser Pro Lys Lys Gln Lys Asn Gly Tyr Glu Lys Lys Lys Ile Pro

130 135 140

Asp Ala Thr Pro Leu Leu Asp Ala Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Phe Ala

145 150 155 160

Gln Gly Gln Tyr Asp Leu Val Lys Cys Leu Ala Pro Ile Arg Asp Pro

165 170 175

Lys Thr Glu Gln Asp Gly His Asp Ile Glu Asn Glu Cys Leu Gly Met

180 185 190

Ala Val Leu Ala Ile Ser His Tyr Ala Met Met Lys Lys Met Gln Leu

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Lys Asp Ile Ser Tyr Lys Arg Tyr Ile Pro Glu Thr

210 215 220

Leu Asn Lys Ser Ile Arg Gln Arg Asn Leu Leu Thr Arg Met Arg Ile

225 230 235 240

Asn Asn Val Phe Lys Asp Phe Leu Lys Glu Phe Asn Asn Lys Thr Ile

245 250 255

Cys Asp Ser Ser Val Ser Thr His Asp Leu Lys Val Lys Tyr Leu Ala

260 265 270

Thr Leu Glu Thr Leu Thr Lys His Tyr Gly Ala Glu Ile Phe Glu Thr

275 280 285

Ser Met Leu Leu Ile Ser Ser Glu Asn Glu Met Asn Trp Phe His Ser

290 295 300

Asn Asp Gly Gly Asn Val Leu Tyr Tyr Glu Val Met Val Thr Gly Asn

305 310 315 320

Leu Gly Ile Gln Trp Arg His Lys Pro Asn Val Val Ser Val Glu Lys

325 330 335

Glu Lys Asn Lys Leu Lys Arg Lys Lys Leu Glu Asn Lys His Lys Lys

340 345 350

Asp Glu Glu Lys Asn Lys Ile Arg Glu Glu Trp Asn Asn Phe Ser Tyr

355 360 365

Phe Pro Glu Ile Thr His Ile Val Ile Lys Glu Ser Val Val Ser Ile

370 375 380

Asn Lys Gln Asp Asn Lys Lys Met Glu Leu Lys Leu Ser Ser His Glu

385 390 395 400

Glu Ala Leu Ser Phe Val Ser Leu Val Asp Gly Tyr Phe Arg Leu Thr

405 410 415

Ala Asp Ala His His Tyr Leu Cys Thr Asp Val Ala Pro Pro Leu Ile

420 425 430

Val His Asn Ile Gln Asn Gly Cys His Gly Pro Ile Cys Thr Glu Tyr

435 440 445

Ala Ile Asn Lys Leu Arg Gln Glu Gly Ser Glu Glu Gly Met Tyr Val

450 455 460

Leu Arg Trp Ser Cys Thr Asp Phe Asp Asn Ile Leu Met Thr Val Thr

465 470 475 480

Cys Phe Glu Lys Ser Glu Gln Val Gln Gly Ala Gln Lys Gln Phe Lys

485 490 495

Asn Phe Gln Ile Glu Val Gln Lys Gly Arg Tyr Ser Leu His Gly Ser

500 505 510

Asp Arg Ser Phe Pro Ser Leu Gly Asp Leu Met Ser His Leu Lys Lys

515 520 525

Gln Ile Leu Arg Thr Asp Asn Ile Ser Phe Met Leu Lys Arg Cys Cys

530 535 540

Gln Pro Lys Pro Arg Glu Ile Ser Asn Leu Leu Val Ala Thr Lys Lys

545 550 555 560

Ala Gln Glu Trp Gln Pro Val Tyr Pro Met Ser Gln Leu Ser Phe Asp

565 570 575

Arg Ile Leu Lys Lys Asp Leu Val Gln Gly Glu His Leu Gly Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Thr His Ile Tyr Ser Gly Thr Leu Met Asp Tyr Lys Asp Asp

595 600 605

Glu Gly Thr Ser Glu Glu Lys Lys Ile Lys Val Ile Leu Lys Val Leu

610 615 620

Asp Pro Ser His Arg Asp Ile Ser Leu Ala Phe Phe Glu Ala Ala Ser

625 630 635 640

Met Met Arg Gln Val Ser His Lys His Ile Val Tyr Leu Tyr Gly Val

645 650 655

Cys Val Arg Asp Val Glu Asn Ile Met Val Glu Glu Phe Val Glu Gly

660 665 670

Gly Pro Leu Asp Leu Phe Met His Arg Lys Ser Asp Val Leu Thr Thr

675 680 685

Pro Trp Lys Phe Lys Val Ala Lys Gln Leu Ala Ser Ala Leu Ser Tyr

690 695 700

Leu Glu Asp Lys Asp Leu Val His Gly Asn Val Cys Thr Lys Asn Leu

705 710 715 720

Leu Leu Ala Arg Glu Gly Ile Asp Ser Glu Cys Gly Pro Phe Ile Lys

725 730 735

Leu Ser Asp Pro Gly Ile Pro Ile Thr Val Leu Ser Arg Gln Glu Cys

740 745 750

Ile Glu Arg Ile Pro Trp Ile Ala Pro Glu Cys Val Glu Asp Ser Lys

755 760 765

Asn Leu Ser Val Ala Ala Asp Lys Trp Ser Phe Gly Thr Thr Leu Trp

770 775 780

Glu Ile Cys Tyr Asn Gly Glu Ile Pro Leu Lys Asp Lys Thr Leu Ile

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<223> 磷酸化酪氨酸

<400> 27

Ile His Ser Pro Tyr Trp Pro Pro Pro Cys Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> 磷酸化酪氨酸

<400> 28

Pro Pro Pro Cys Tyr Ser Leu Lys Pro Glu Ala

1 5 10

<210> 29

<211> 38

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 磷酸化丝氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> 磷酸化丝氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> 磷酸化苏氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> 泛素化赖氨酸

<400> 29

Ala Ala Asp Thr Arg Ser Asp Ser Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Met Ser Lys Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile

20 25 30

Pro Val Ala Thr Ala Val

35

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

Ser Asp Ser Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Ser Lys

1 5 10 15

<210> 31

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

Arg Pro Leu Trp Ala Gln Ser Leu Glu Leu Pro Gly Pro Ala Met Gln

1 5 10 15

Pro Leu Pro Thr Gly Ala Phe Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu Thr Pro

20 25 30

Val Gln Ala Glu Asn Glu Pro Lys

35 40

<210> 32

<211> 43

<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

Ser Asp Ser Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Ser Lys

1 5 10 15

Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala

20 25 30

Val His Leu Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg

35 40

<210> 33

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala

1 5 10 15

Val His Leu Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg

20 25 30

<210> 34

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

Val Leu Asp Pro Glu Gly Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser

1 5 10 15

Tyr Leu Arg

<210> 35

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

Gln His Leu Gln Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg

1 5 10

<210> 36

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

Asp Ser Thr His Pro Ser Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr

1 5 10 15

Arg Gly Pro Thr Asn Val Arg

20

<210> 37

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人

<400> 37

Ser Asp Ser Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Ser Lys

1 5 10 15

Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala

20 25 30

Val His Leu Lys

35

<210> 38

<211> 27

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala

1 5 10 15

Val His Leu Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg

20 25