一种高成骨活性仿生羟基磷灰石纳米粒子的制备方法

摘要

本发明公开了一种高成骨活性仿生羟基磷灰石纳米粒子的制备方法，所述方法包括将磷源与钙源混合搅拌，调节pH至8‑13反应生成羟基磷灰石沉淀，然后洗涤、冷冻干燥羟基磷灰石沉淀得到所述羟基磷灰石的步骤。本发明的方法无需煅烧，且避免了传统化学沉淀法中的粒径大、不均匀和团聚的问题，还可通过控制反应条件间接控制棒状纳米粒子的长径比；通过对产物的形貌结构和生物活性等指标的表征，发现本发明合成的羟基磷灰石纳米粒子具有高生物活性，具备良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及羟基磷灰石纳米材料技术领域，特别涉及一种高生物活性促成骨分化拟生物态羟基磷灰石纳米棒及其制备方法。

背景技术

天然骨的纳米复合结构(纤维状胶原和嵌入的矿物质)对维持骨细胞活性和新的细胞外基质(ECM)合成具有非常重要的作用。骨组织的矿物质有纳米级的羟基磷灰石(HAp)，其骨仿生性使其被广泛应用于生物医学领域，可用作骨内金属植入物的涂层材料，药物输送载体，牙齿修复材料，骨缺损复合支架等。近年来，国内外研究人员针对纳米HAp进行了大量的研究，但研究主要集中在羟基磷灰石的合成，结构和性质等方面。众所周知，除了生物因子(如生长因子，激素)会影响细胞行为和组织功能外，材料的成分、结构和力学性能等性质也会产生一定的生物学效应。

制备纳米羟基磷灰石的方法主要分为干法(固相反应法)和湿法(溶液反应法)。干法制备出的羟基磷灰石粉体粒径较大，并且长时间混磨原料导致原料容易被污染；而湿法设备需求简单，并且得到的粉体粒径小且均匀，故通常采用湿法。湿法有：水热法、化学沉淀法、微乳液法、溶胶-凝胶法等。工业化生产纳米羟基磷灰石需要操作简单、成本可控，故化学沉淀法在实际生产中得到了广泛运用。

化学沉淀法是制备纳米HAp粉体的常见方法，有着较少受到实验条件限制、反应的过程易控制、成本低等优点。该方法是将磷源与钙源相混合搅拌，然后用氨水调节pH，进而生成HAp沉淀，然后经过静置、洗涤、干燥等步骤后，将粉体煅烧，从而得到HAp晶体，但是化学沉淀法制备出的纳米羟基磷灰石粉体团聚情况比较严重，均匀性差。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种制备棒状纳米羟基磷灰石粉体的方法，该方法无需煅烧，并解决了传统化学沉淀法制备羟基磷灰石粉体粒径大、粒径分布不均匀且制备过程容易出现团聚的问题，还能够通过控制反应条件间接控制棒状纳米粒子的长径比。

本发明的第一方面，提供一种羟基磷灰石的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

i)配制磷源水溶液和钙源水溶液；

ii)用pH调节试剂将磷源水溶液的pH调节至8～13；

iii)在搅拌下将钙源水溶液倒入磷源水溶液，加入pH调节试剂将混合物溶液 pH调整至8～13后进行化学沉淀反应，其中钙离子与磷离子的物质的量之比为1.67，化学沉淀温度为0～100℃，反应时间为0.5～32h；

iv)收集步骤iii)形成的沉淀，洗涤后冷冻干燥，即可得到所需羟基磷灰石。

在另一优选例中，所述磷源选自磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸钠或磷酸二氢钾。

在另一优选例中，所述钙源为氯化钙、硝酸钙、四水合硝酸钙或磷酸二氢钙。

在另一优选例中，所述钙源水溶液中溶质的浓度为0.01～0.6mol/L。

在另一优选例中，所述磷源水溶液中溶质的浓度为0.01～0.6mol/L。

在另一优选例中，所述化学沉淀温度为20～80℃。

在另一优选例中，所述反应时间为1～24h。

在另一优选例中，所述步骤ii)中，所述pH调节试剂选自氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水。

在另一优选例中，所述步骤iii)中，pH调节试剂选自氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水。

在另一优选例中，所述制备方法包括以下步骤：

i)配制磷源水溶液和钙源水溶液；

ii)用pH调节试剂将磷源水溶液的pH调节至8～13；

iii)在搅拌下将钙源水溶液快速倒入磷源溶液，加入pH调节试剂将混合物溶液pH调整至8～13后进行化学沉淀反应，其中钙离子与磷离子的物质的量之比为 1.67，化学沉淀温度为0～100℃，反应时间为1～32h；

iv)收集步骤iii)形成的沉淀，洗涤后冷冻干燥，即可得到所需羟基磷灰石。

本发明的第二方面，提供第一方面所述的制备方法制备的纳米羟基磷灰石。

在另一优选例中，所述纳米羟基磷灰石为棒状结构，长度为14.5～80.0nm，直径为4.0～13.2nm。

在另一优选例中，所述纳米羟基磷灰石的长径比为1.1～20。

本发明的有益效果为：

1)采用水溶液进行共沉淀相对环保且成本低，而且配合电磁搅拌有效避免了团聚现象。

2)由于高结晶度的羟基磷灰石生物活性低且生物毒性大，本发明在近似模拟生物体内温度的条件下制备，可以有效提高其生物活性。

附图说明

图1不同尺寸HAp对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)作用7d的毒性；

图2与不同HAp共培养7d和14d rBMSCs的碱性磷酸酶(ALP)活性(HA 浓度：1000μg/mL，统计学差异显著(n＝3,*:p<0.05))；

图3与不同HAp(浓度：1000μg/mL)共培养7d和14d的rBMSCs成骨基因的表达(图中示出骨桥蛋白(OPN)、成骨细胞特异性转录因子(Osx)、ALP、 I型胶原(Col I)、骨钙素(OCN)表达的增加倍数，统计学上显著性差异(n＝3,*: p<0.05))；

图4蛋白质印记(Western blot)法测与不同HAp共培养7d(A)和14d(B) 的rBMSCs细胞成骨相关蛋白的表达，以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为标准参照；

图5培养14d后成骨标志物Runt-related转录因子(Runx2)的免疫荧光染色(HAp浓度：1000μg/mL)；

图6培养14d后成骨标志物OCN的免疫荧光染色(HAp浓度：1000μg/mL)；

图7不同Hap及对照物的X-射线衍射分析(图中，(A)烧结Hap，(B)HAp-100， (C)HAp-70，(D)HAp-30，(E)HAp-0，(F)生牛骨，(G)标准PDF卡(JCPDS 09-0432))。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

配制四水合硝酸钙水溶液和磷酸氢二铵水溶液，其中，四水合硝酸钙水溶液中溶质的浓度为0.08mol/L，磷酸氢二铵水溶液中溶质的浓度为0.048mol/L；用氨水将磷酸氢二铵水溶液的pH调节至12；在磁力搅拌下将四水合硝酸钙水溶液快速倒入磷酸氢二铵溶液，继续加入氨水将混合物溶液pH调整至12，两溶液中钙离子与磷离子的物质的量之比为1.67；控制化学沉淀温度为0℃，反应时间为32h，获取纳米羟基磷灰石沉淀；将反应液经真空抽滤收集沉淀，用去离子水和乙醇交替进行抽滤处理滤饼4次，然后冷冻干燥，得纳米羟基磷灰石样品标记为HA-0。

得到的HA-0未出现团聚现象，粒径分布均匀，长度为14.46±5.66nm，宽度为7.05±1.56nm，长径比为2.05。

实施例2

配制四水合硝酸钙水溶液和磷酸氢二铵水溶液，其中，四水合硝酸钙水溶液中溶质的浓度为0.08mol/L，磷酸氢二铵水溶液中溶质的浓度为0.048mol/L；用氨水将磷酸氢二铵水溶液的pH调节至11；在磁力搅拌下将四水合硝酸钙水溶液快速倒入磷酸氢二铵溶液，继续加入氨水将混合物溶液pH调整至11，两溶液中钙离子与磷离子的物质的量之比为1.67；控制化学沉淀温度为30℃，反应时间为24h，获取纳米羟基磷灰石沉淀；将反应液经真空抽滤收集沉淀，用去离子水和乙醇交替进行抽滤处理滤饼4次，然后冷冻干燥，得纳米羟基磷灰石样品标记为HA-30。

得到的HA-30未出现团聚现象，粒径分布均匀，长度为22.95±5.14nm，宽度为7.92±2.01nm，长径比为2.90。

实施例3

配制四水合硝酸钙水溶液和磷酸氢二铵水溶液，其中，四水合硝酸钙水溶液中溶质的浓度为0.08mol/L，磷酸氢二铵水溶液中溶质的浓度为0.048mol/L；用氨水将磷酸氢二铵水溶液的pH调节至11；在磁力搅拌下将四水合硝酸钙水溶液快速倒入磷酸氢二铵溶液，继续加入氨水将混合物溶液pH调整至11，两溶液中钙离子与磷离子的物质的量之比为1.67；控制化学沉淀温度为70℃，反应时间为4h，获取纳米羟基磷灰石沉淀；将反应液经真空抽滤收集沉淀，用去离子水和乙醇交替进行抽滤处理滤饼4次，然后冷冻干燥，得纳米羟基磷灰石样品标记为HA-70。

得到的HA-70未出现团聚现象，粒径分布均匀，长度为55.55±13.58nm，宽度为14.31±2.76nm，长径比为3.88。

实施例4

配制四水合硝酸钙水溶液和磷酸氢二铵水溶液，其中，四水合硝酸钙水溶液中溶质的浓度为0.08mol/L，磷酸氢二铵水溶液中溶质的浓度为0.048mol/L；用氨水将磷酸氢二铵水溶液的pH调节至10.5；在磁力搅拌下将四水合硝酸钙水溶液快速倒入磷酸氢二铵溶液，继续加入氨水将混合物溶液pH调整至10.5，两溶液中钙离子与磷离子的物质的量之比为1.67；控制化学沉淀温度为100℃，反应时间为2h，获取纳米羟基磷灰石沉淀；将反应液经真空抽滤收集沉淀，用去离子水和乙醇交替进行抽滤处理滤饼4次，然后冷冻干燥，得纳米羟基磷灰石样品标记为HA-100。

得到的HA-100未出现团聚现象，粒径分布均匀，长度为80.00±6.25nm，宽度为18.32±2.62nm，长径比为4.37。

对上述各实施例制备的样品进行如下检测：

(1)细胞毒性试验

采用CCK-8法检测各样品对rBMSCs细胞作用7d的毒性，其基本原理为:该试剂中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)，它在电子载体(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。具体步骤如下：

以1×10

检测结果如图1所示，以相对吸光度为指标，表征不同浓度的HAp纳米粒子分散液培养BMSCs细胞贴壁7天生存能力。不同颜色代表不同反应温度/时间下生成的HAp纳米粒子，参照样代表不添加羟基磷灰石纳米粒子的新鲜细胞培养基溶液。随着HAp浓度的增大，细胞存活率大致呈下降趋势，因此吸光度也逐渐减小。

(2)碱性磷酸酶(ALP)表达

通过ALP活性来研究不同长径比的HAp颗粒对rBMSCs细胞的成骨分化的影响差异。选取HAp的浓度为1000μg/mL。

ALP表达检测的实验步骤如下：

以2×10

检测结果如图2所示，所有与HAp共培养的干细胞成骨活性都有所提高，30℃下制备的HAp纳米粒子的促成骨活性提升最为显著。

(3)成骨相关基因表达检测(rt-PCR)

通过转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chainreaction， rt-PCR)实验来研究不同长径比的羟基磷灰石颗粒与rBMSCs共培养后， rBMSCs的成骨相关基因的表达情况。选取HAp的浓度为1000μg/mL。

具体的实验步骤如下：

①RNA的提取：细胞接种方法同(2)。每孔加入500μL Trizol裂解液用于裂解细胞，15min后，将裂解液吸取至离心管；加入裂解液1/5体积的三氯甲烷，高速离心15min，小心转移上层液体到新离心管内；加入与上清液体积比为1:1的异丙醇，摇晃20下，静置，然后再高速离心15min；弃上层液体后，加入1mL 75％的乙醇，5000～10000rpm转速下离心10min，底部白色沉淀即为RNA；弃上层液体，与室温干燥后用焦碳酸二乙酯溶解RNA，并在 260nm处测定其OD值；

②RNA的逆转录：逆转录液按Prime Script逆转录试剂盒进行配制；加适量逆转液与RNA混合均匀后于基因转录仪中在37℃保持15min后得到cDNA； 85℃保持15s以使逆转录酶失效。

③向cDNA中加入荧光染料(SYBR)及相应Osx、OCN、OPN、ALP、 Col I相应的引物，在RT-qPCR中进行扩增。

检测结果如图3所示，与不同组HA培养的rBMSCs细胞中成骨相关的 OPN、Osx、ALP、Col I和OCN的表达量多少的趋势是：HA-30>HA-100>HA- 70>HA-0。所有这些结果表明，在HA-30组共培养的rBMSCs细胞的成骨基因表达高于其它三组成骨基因的表达，这表明HA-30具有最佳的促进rBMSCs 成骨分化的作用。

(4)成骨相关蛋白的表达(Western Blot)

通过蛋白质印记法(Western Blot)法检测细胞内成骨相关蛋白的表达情况。选取HAp的浓度为1000μg/mL。

Western Blot的具体实验步骤如下：

细胞接种与培养步骤同(2)。至各培养时间点，移去培基用PBS(4℃) 清洗3次，每孔加入20μL细胞裂解液(PMSF：RIPA＝1：100)，裂解10min 后将上清液移入1.5mL离心管，在12000rpm转速下离心10min；用BCA试剂盒测蛋白浓度；溶液经涡流后置于100℃水浴5min使蛋白变性。冷却后置于-80℃进行保存。使用SDS-PAGE凝胶配制试剂进行蛋白电泳，至条宽与底边的距离为1cm，并将蛋白转膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。然后，使用免疫印迹膜清洗液(TBST)将蛋白膜清洗一遍，以5％的BSA的TBST溶液封闭蛋白印记膜1h。接着，分别用ColI、Osx、OPN、ALP和OCN的相关抗体在4℃下孵育过夜。吸出一抗回收利用，TBST清洗三遍后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育2h，吸取二抗，回收利用，TBST清洗三遍，无吐温膜清洗液(TBS)清洗1遍后加入显色液(ECL)显色，用化学发光成像仪检测光强。

检测结果如图4所示，7d时，具有适中长径比的HA-30组具有明显优于其它三组成骨相关蛋白的表达，同时可以看出HA-100与HA-30组的差距最小，HA-100组要优于HA-0和HA-70组。基于以上结果，HA-30具有更优的促进rBMSCs细胞骨向分化的能力。

(5)免疫荧光染色

通过免疫荧光染色来直观研究不同长径比的羟基磷灰石颗粒对rBMSCs 细胞Runx2和OCN的表达情况，Runx2属于RUNX转录因子家族，在矿化组织中表达最多。Runx2可以集中各种成骨信号并触发各种成骨基因的表达(比如Col I,OCN and OPN)。选取羟基磷灰石的浓度为1000μg/mL。

免疫荧光染色的实验步骤如下：

细胞接种方法与(2)相同，于37℃培养箱孵育14d。在第14d移去培养基后，每孔用PBS缓冲液洗涤2次，使用2.5％的多聚甲醛(Paraformaldehyde) 溶液在4℃下固定细胞15min后用PBS溶液清洗3次，然后每孔加入0.1％ Triton X-100将细渗透10min，并在室温下用5％的牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭2h。封闭后，将细胞在4℃下与1:200～1:1000稀释的OCN抗体和1:100～1:1000稀释的Runx2抗体孵育过夜。回收OCN和Runx抗体，PBS清洗5次，不同孔板加入一定浓度的Alexa Fluor 488标记的二抗在室温下染色 Runx2和OCN 1h。移去培养基，用PBS清洗5次，细胞进一步被Alexa Fluo 568标记的鬼笔环肽染色60min，DAPI染色15min，分别染色F-肌动蛋白和细胞核。

检测结果如图5和图6所示。由图可知，纳米颗粒HA-30组的荧光强度最强，表明该组具有最高的Runx2和OCN蛋白的表达，说明HA-30具有最优的促成骨效果。

(6)X射线衍射分析

通过旋转阳极X射线粉末衍射仪分析纳米颗粒的物相组成，结果如图7 所示。

由图中可知，HA-100的特征衍射峰位置与标准HA晶体的衍射峰一致，峰型尖锐，表明了羟基磷灰石的成功制备。伴随着反应温度的降低，特征峰衍射强度也随之降低，峰型变宽。表明了较低温度下合成的羟基磷灰石(HA-30， HA-0)尺寸减小且呈现了弱晶化，结晶度降低，与天然骨中的低结晶度羟基磷灰石相似。因此，证明可以通过改变反应温度条件，合成与天然骨中羟基磷灰石具有高度相似性的HAp颗粒，本发明所制备的HA-30组颗粒可作为类骨类材料用于骨损伤的修复。

当然，以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求保护的范围之内。