一种能增加调理肠胃功能效果的干酪乳杆菌制剂及其制备方法

摘要

本发明属于益生菌生产技术领域，具体涉及一种能增加调理肠胃功能效果的干酪乳杆菌制剂及其制备方法。本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Miao Tech‑01，其保藏编号为CGMCC 20863。本发明的干酪乳杆菌具有良好的调理肠胃的效果，并且本发明制备得到的菌剂调理肠胃效果显著，不但具有更高活力的干酪乳杆菌菌体，而且还含有发酵过程中所产生的代谢产物。

说明书

技术领域

本发明属于益生菌生产技术领域，具体涉及一种能增加调理肠胃功能效果的干酪乳杆菌制剂及其制备方法。

背景技术

由于生活节奏加快，现代都市人由于生活作息不规律、吃饭不定时、饮食过于精细或随便应付，忍饥挨饿或暴饮暴食等，造成肠道过于饥饿或过于饱食，导致肠道异常，主要的症状有便秘、腹泻、腹痛、腹胀、肠鸣、消化不良、胃肠道炎症等。

便秘与腹泻是由肠道功能紊乱引起的两个极端排泄症状。其中，便秘指粪便干燥、排出困难。产生便秘的原因包括：肠道的蠕动能力减弱(肠道肌肉张力过低，或摄入的食物、水分过少，粪便量太少，不足以刺激结肠的正常蠕动等)；肠道梗阻(癌症或畸形等)；排便反射功能失调等(排便反射过程中的任何环节有障碍或病变等)。腹泻俗称“拉肚子”，常见症状包括排便频率增加、粪质稀薄、水分增加、含有异常成分(如未消化食物、脓血、黏液等)，此外，常伴有排便急迫感、肛门不适、失禁等症状。腹泻常常会使胃肠道功能紊乱，消化吸收能力下降。腹泻产生的原因主要包括：细菌病毒感染、食物中毒、小腹着凉等、食物过敏、肠道炎症、精神过度紧张、焦虑抑郁等。严重的腹泻会引起肌体脱水及电解质失衡。

益生菌对肠道具有“双向调节”功能，改善由人体胃肠道功能紊乱引起的便秘和腹泻症状，达到调理肠胃的作用。干酪乳杆菌属于乳杆菌属，是革兰氏阳性菌，干酪乳杆菌存在于人的口腔、肠道中，也常常出现在牛奶和干酪、乳制品、饲料、面团和垃圾中。干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活。现有技术指出，干酪乳杆菌具有调节肠道菌群，改善肠道健康的作用。然而，目前的益生菌剂效果均不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌。

本发明的再一目的在于提供上述干酪乳杆菌的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述干酪乳杆菌的应用。

根据本发明具体实施方式的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Miao Tech-01,其保藏编号为CGMCC 20863。

本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Miao Tech-01，于2020年10月12日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC 20863。

本发明还提供上述干酪乳杆菌Miao Tech-01的应用，尤其是在制备调理肠胃方面的应用。

根据本发明具体实施方式的具有调理肠胃效果的干酪乳杆菌菌剂，所述菌剂包含权利要求1所述的干酪乳杆菌Miao Tech-01。

根据本发明具体实施方式的干酪乳杆菌菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)干酪乳杆菌Miao Tech-01菌种培养；

(2)将步骤(1)所得菌种接种于MRS液体培养基中，制备液体菌种；

(3)将步骤(2)所得液体菌种接种于含MRS液体培养基的发酵罐中，进行液体培养；

(4)将步骤(3)的发酵液离心分离，得到湿菌体，湿菌体的含水量为75～80％；

(5)将湿菌体与固体培养基混合得到培养物，进行固体培养，其中，培养物的含水量为45～55％；

(6)干燥步骤(5)所得的发酵产物。

根据本发明具体实施方式的干酪乳杆菌菌剂的制备方法，步骤(1)中使用MRS固体培养基进行菌种的平板培养和斜面培养，MRS固体培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K

根据本发明具体实施方式的干酪乳杆菌菌剂的制备方法，步骤(2)、(3)中，MRS液体培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K

根据本发明具体实施方式的干酪乳杆菌菌剂的制备方法，步骤(5)中，固体培养基包含以下重量份的原料(以湿菌体100g为100份基准计算)：葡萄糖20份、蛋白胨粉10份、酵母浸出物粉10份、番茄粉10份、K

根据本发明具体实施方式的干酪乳杆菌菌剂的制备方法，步骤(5)中，固体培养基包含以下重量份的原料(以湿菌体100g为100份基准计算)：葡萄糖20份、蛋白胨粉10份、酵母浸出物粉10份、番茄粉10份、K

可利用湿菌体、无菌水或液态培养液等含水物料调节固体培养基达到45％-55％的含水量。

本发明的有益效果：

1.本发明的干酪乳杆菌具有如下的特性：

(1)最适生长pH为6.0，在pH5.0以上的pH环境下生长良好，在pH

(2)在34-40℃的温度环境下生长良好，最佳生长温度为37℃；

(3)具有良好的肠胃功能的效果。

2.本发明的制备方法包括液态培养、固液分离、固态培养等步骤，本发明的制备方法培养速度快，固液分离后的湿菌种菌体数量高，以及固态培养可使干酪乳杆菌的菌种活力有较大的恢复和增长，并且在固态培养过程中还能产生有机酸、细菌素等抗菌物质。本发明的制备方法所得菌剂具有以下特点：

(1)活菌数有所增加，产品活菌数能达到10

(2)菌剂中含有会产生有机酸、细菌素等抗菌物质；

固态培养添加的固态培养基还具有干燥保护剂的作用，且固态培养产生的菌体在干燥时应激小，菌体干燥时死亡率低，最终获得的产品菌种活力高、并含有适量的细菌素、有机酸，在实际的使用过程中具有更好的调理肠胃功能的效果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1菌株的分离、鉴定与菌种特性

1.1样品采集

从发酵乳制品中采集干酪乳杆菌样品。

1.2菌株的分离

发酵乳样品来自于自然发酵的牛奶。取牛奶公司已经发酵变质的酸牛奶5mL，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL新鲜牛奶，振荡混匀后置于30℃隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释至10

1.3菌株的鉴定

(1)菌落形态与生理生化实验分析

本发明菌株的菌落为白色、圆形、表面光滑、湿润、边缘整齐、细胞呈杆状。不运动、不液化明胶、H

本发明菌株的最适生长pH6.0，在pH5.0以上能生长；最适生长温度为30-35℃，15℃以上能生长。

本发明菌株能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、半乳糖；发酵葡萄糖时产酸、不产气。

(2)16S rRNA部分序列分析

将筛选菌株的基因组DNA进行PCR扩增，用1％琼脂糖进行凝胶电泳检测。使用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R(5’GGTTACCTTGTTCGACTT-3’)进行PCR扩增，纯化后测序，得到的PCR产物序列，并进行菌种鉴定。

综合菌落形态分析、生理生化实验分析和16S rRNA部分序列分析的结果，将本发明菌株鉴定为干酪乳杆菌，并命名为“干酪乳杆菌MiaoTech-01”。

实施例2干酪乳杆菌MiaoTech-01的特性

2.1耐酸性

将经过活化的干酪乳杆菌MiaoTech-01菌种接种于MRS液体培养基中，培养后得到菌种种子液，取1mL干酪乳杆菌MiaoTech-01种子液接种于19mL pH分别为5.0、5.5和6.0的MRS液体培养基中，在37℃下厌氧培养24h，测定初始和结束后的OD600值(即在600nm波长处的吸光度值，通常可以用来比较培养液中的菌体细胞密度或菌体生长情况),以pH6.0的OD600值作对照(即以pH6.0培养的菌数为100％计)，按照下列公式计算不同pH培养基中的菌体生长情况：

菌体生长情况(％)＝(其它pH培养的OD)/pH6.0培养的OD×100％。

结果见表1：

表1干酪乳杆菌MiaoTech-01在不同pH培养基中的生长情况

结果如表1所示，在初始pH5.0和5.5的培养基中培养得到的菌液，与pH6.0的培养基培养的菌液OD值相比，有一定程度的降低，但与空白对照组比较，仍然具有较高的生长速率。因此，干酪乳杆菌MiaoTech-01在pH5.0、5.5较低pH环境下仍然具有一定的生长能力。

将上述在pH6.0条件培养的干酪乳杆菌MiaoTech-01菌种，经过离心分离、磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次后用PBS重悬。取1mL重悬液分别与9mL pH

以未经人工胃液处理的菌数作对照，按照下列公式计算人工胃液处理前后的存活率：

存活率(％)＝(处理前的菌数-处理后的菌数)/处理前的菌数×100％。

结果见表2：

表2干酪乳杆菌MiaoTech-01在不同pH人工胃液处理后的存活率

结果如表2所示，经过不同pH的人工胃液处理后，菌体存活率为70％以上，仍然具有较高的存活率，因此，能够在正常的食用条件下以活菌形式进入肠道。

2.2耐温性

将经过活化的干酪乳杆菌MiaoTech-01菌种接种于MRS液体培养基中，培养后得到菌种种子液，取1mL干酪乳杆菌MiaoTech-01种子液接种于19mL pH分别为6.0的MRS液体培养基中，分别在31℃、34℃、37℃、40℃的温度下厌氧培养24h，测定初始和结束后的OD600值。

以37℃的OD600值作对照(即以37℃培养的菌数为100％计)，按照下列公式计算不同pH培养基中的菌体生长情况：

菌体生长情况(％)＝(其它温度培养的菌数)/37℃培养的菌数×100％。

结果见表3：

表3干酪乳杆菌MiaoTech-01在不同温度下的生长情况

结果如表3所示，在37℃的温度下培养得到的菌体数量最高，其它的温度条件下，与37℃的温度相比，培养产生的菌数较少，但与对照相比，仍然具有较高的生长速率。因此，干酪乳杆菌MiaoTech-01的最适温度为37℃，其在34～40℃温度环境下生长良好，具有在良好的耐温性。

2.3增加肠胃功能效果

见实施例7。

实施例3液态法制备的干酪乳杆菌原粉及其制剂(液态法对比例)

3.1培养基

(1)MRS固体培养基(用于斜面培养和平板培养)：

葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K

(2)MRS液体培养基(用于三角瓶培养和发酵罐培养)：

葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K

3.2液态培养法干酪乳杆菌原粉及其制剂的制备方法

传统的干酪乳杆菌原粉及其制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌种培养：

使用上述MRS固体培养基进行菌种的斜面培养或平板培养。

(2)三角瓶培养或菌种罐培养：

将斜面或平板培养得到的菌种接种于三角瓶MRS液体培养基中，于厌氧培养箱中在37℃下培养24h得到三角瓶液体菌种，

(3)液态培养：

采用上述三角瓶液体菌种或种子罐液体菌种接种于发酵罐，在发酵罐中37℃下厌氧液态培养24h，获得菌体培养液；

(4)离心分离：

将上述液态培养液用管式离心机或碟式离心机进行分离，离心机转速为10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80％；

(5)干燥

将湿菌体置于冷冻干燥机中在-40℃冷冻干燥20h即得到液态法干酪乳杆菌原粉；

经测定：干酪乳杆菌原粉的总菌数为3.12×10

(6)造粒、包衣和包装。

在益生菌原粉中加入适量的辅料(如：海藻糖、脱脂奶粉等)，即得到液态法制备的干酪乳杆菌制剂；

经测定：干酪乳杆菌制剂产品的总菌数为2.97×10

实施例4制备的干酪乳杆菌原粉及其制剂(固态法1)

4.1培养基

(1)MRS固体培养基(用于斜面培养和平板培养)：

葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K

(2)MRS液体培养基(用于三角瓶培养和发酵罐培养)：

葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K

(3)固体培养的培养基(用于固态培养)：

按照下列配方的比例准备固态培养的原料(以100g湿菌体为基准计算)：

葡萄糖20g、蛋白胨粉10g、酵母浸出物粉10g、番茄粉10g、K

除了湿菌体外，其余各种原料分别杀菌(分别用高温瞬时杀菌设备在150℃杀菌10s)，冷却后无菌混合均匀，作为固态培养基的原料备用。

4.2干酪乳杆菌原粉及其制剂的固态培养制备方法

本发明的干酪乳杆菌菌剂的固态培养制备方法，包括以下步骤：

(1)菌种培养：

使用上述MRS固体培养基进行菌种的斜面培养或平板培养。

(2)三角瓶培养或菌种罐培养：

将斜面或平板培养得到的菌种接种于三角瓶MRS液体培养基中，于厌氧培养箱中在37℃下培养24h得到三角瓶液体菌种，

(3)液态培养：

采用上述三角瓶液体菌种或种子罐液体菌种接种于发酵罐，在发酵罐中37℃下厌氧液态培养24h，获得菌体培养液；

(4)离心分离：

将上述液态培养液用管式离心机或碟式离心机进行分离，离心机转速为10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80％；立即将湿菌体转入固态培养基培养；

(5)固态培养：

在无菌室按照配方将上述湿菌体与无菌的固态培养基混合，固态培养基配方为：湿菌体100g、葡萄糖20g、蛋白胨粉10g、酵母浸出物粉10g、番茄粉10g、K

(6)干燥：

在-40℃下冷冻干燥20h，即得到固态培养法(1)制备的干酪乳杆菌原粉。

经测定：本发明制备所得的干酪乳杆菌原粉产品，其总菌数为3.65×10

(7)造粒、包衣和包装。

将干酪乳杆菌原粉造粒、包衣，即得到固态培养法(1)的制备干酪乳杆菌制剂。

经测定：本发明制备所得的干酪乳杆菌制剂产品，其总菌数为3.19×10

实施例5制备的干酪乳杆菌制剂(固态法2)

实施例5的工艺操作与实施例4基本相同，仅更改部分操作参数，用于说明在不同的操作条件下生产的固态培养益生菌产品的效果。

5.1培养基

在实施例4的固体培养基基础上增加乳清粉10g，其他同实施例4。

5.2干酪乳杆菌菌剂的培养制备方法

实施例5控制固体培养基的水分含量为52％，在37℃下密封厌氧固态培养96h。采用冷冻干燥方法对固体培养物进行干燥，其他步骤同实施例4，分别制成原粉产品和制剂产品。

经测定：本实施例所制备的干酪乳杆菌原粉产品总菌数为4.26×10

实施例6制备的干酪乳杆菌制剂(固态法3)

6.1培养基

实施例6培养基同实施例4。

6.2干酪乳杆菌菌剂的培养制备方法

三角瓶培养、液体培养和固体培养的温度为37℃，控制固体培养基的水分含量为55％，在37℃下密封厌氧固态培养120h，其他参数同实施例4，分别制成原粉产品和制剂产品。

经测定：本实施例所制备的干酪乳杆菌原粉产品总菌数为3.66×10

本发明的制备方法中，若发酵罐培养基较大，可将三角瓶液体菌种再接种于1-3级菌种罐中扩大培养，从而获得用于发酵罐的液体菌种，小规模培养则直接只用三角瓶培养的菌种进行接种。

实施例7效果对比试验(治疗腹泻的效果)

选取上述实施例3-6所得到的干酪乳杆菌原粉和制剂产品，分别进行了产品的调理肠胃实验，具体实验方案及实验结果如下：

7.1相同重量时产品的治疗腹泻效果对比

以实施例3所制备的干酪乳杆菌原粉或制剂产品作为对照，选取实施例4～6所制备的干酪乳杆菌原粉或制剂产品对治疗腹泻的功效进行比较。

分别选取150名具有腹泻问题的成人服用，随机分为6组，每组25人。每组分配的受试人员年龄、性别、身体状况基本一致。分别服用实施例或对照例的干酪乳杆菌成品，2g/次，3次/日，口服14日。口服期间饮食如常，不服用其它乳酸菌饮料或药物。

观察服用后的效果：治疗后腹泻等伴随症状完全消失为特效；腹泻等伴随症状改善为有效；腹泻等伴随症状没有改善为无效。结果以“平均值±标准差”来表示，结果见表4：

表4相同重量时不同工艺生产的干酪乳杆菌对腹泻的治疗效果

结果如表4所示，对于原粉产品，本发明的益生菌原粉治疗腹泻效果优于液态法制备的益生菌原粉。

当益生菌原粉制成制剂之后，由于制剂工艺过程需要添加一些辅料，并且制剂过程对益生菌有一定的损伤，因而其治疗效果会略有损失。

对于制剂产品，本发明的干酪乳杆菌制剂(实施例4、5、6)治疗腹泻效果优于实施例3液态法制备的菌剂。

综上所述，本发明制备的益生菌产品比传统的液态法制备的益生菌产品具有更好的治疗腹泻效果。

7.2相同菌数时制剂产品的治疗腹泻效果对比

分别称取益生菌制剂成品10g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整益生菌总数浓度为1x10

按照实施例7.1的试验方法，测定相同菌数的实施例样品对腹泻的治疗效果，结果以“平均值±标准差”来表示，结果见表5：

表5相同菌数时不同工艺生产的干酪乳杆菌制剂产品对腹泻的治疗效果

结果如表5所示，在相同菌数情况下，本发明实施例4～6的菌剂治疗腹泻的效果优于实施例3的菌剂，说明本发明的菌剂中不但含有干酪乳杆菌，而且还含有干酪乳杆菌发酵过程中所产生的细菌素、有机酸等具有抑菌作用的代谢产物，干酪乳杆菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体的治疗腹泻效果。

实施例8效果对比试验(治疗便秘的效果)

选取上述实施例3-6所得到的干酪乳杆菌原粉和制剂产品，分别进行了产品的治疗便秘的实验，实验方案及实验结果如下：

8.1相同重量时产品的治疗便秘效果对比

以实施例3所制备的干酪乳杆菌原粉或制剂产品作为对照，选取实施例4-6所制备的干酪乳杆菌原粉或制剂产品治疗便秘的功效进行比较。

分别选取150名具有便秘问题的成人服用，随机分为6组，每组25人。每组分配的受试人员年龄、性别、身体状况基本一致。分别服用实施例或对照例的干酪乳杆菌成品，2g/次，3次/日，口服14日。口服期间饮食如常，不服用其它乳酸菌饮料或药物。

观察服用后的效果：治疗后便秘等症状完全消失为特效；便秘等症状改善为有效；便秘等症状没有改善为无效。结果见表6：

表6不同工艺生产的干酪乳杆菌对便秘的治疗效果

结果如表6所示，对于原粉产品，本发明的益生菌原粉治疗便秘的效果优于液态法制备的益生菌原粉。

当益生菌原粉制成制剂之后，由于制剂工艺过程需要添加一些辅料，并且制剂过程对益生菌有一定的损伤，因而其治疗效果会略有损失。

对于制剂产品，本发明的干酪乳杆菌制剂(实施例4、5、6)治疗便秘的效果优于实施例3液态法制备的菌剂。

综上所述，本发明制备的益生菌产品比传统的液态法制备的益生菌产品具有更好的治疗便秘的效果。

8.2相同菌数时制剂产品的治疗便秘效果对比

分别称取益生菌制剂成品10g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整益生菌总数浓度为1x10

按照实施例8.1的试验方法，测定相同菌数的实施例制剂样品对便秘的治疗效果，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表7：

表7相同菌数时不同工艺生产的干酪乳杆菌制剂产品对便秘的治疗效果

结果如表7所示，在相同菌数情况下，本发明实施例4～6的菌剂治疗便秘的效果优于实施例3的菌剂，说明本发明的菌剂中不但含有干酪乳杆菌，而且还含有干酪乳杆菌发酵过程中所产生的细菌多糖以及菌体细胞碎片等代谢产物，干酪乳杆菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体的治疗便秘的效果。

综上所述，本发明的干酪乳杆菌具有良好的双向调理肠胃功效，即可以治疗腹泻，又可以治疗便秘。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。