一种黑曲霉二糖磷酸化酶及其在黑曲霉二糖制备中的应用

摘要

本发明公开了一种黑曲霉二糖磷酸化酶及其在黑曲霉二糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明提供了提供一种新型黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP及其高效表达方法。由化学法合成编码来源于运动厌氧孢杆菌(Anaerosporobacter mobilis DSM 15930)的黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP的核苷酸序列，以穿梭质粒pBSMμL3为表达载体，以Bacillus subtilisWSH11为表达宿主，实现了黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达。黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP与麦芽糖磷酸化酶LbMP协同反应可催化麦芽糖转化生成黑曲霉二糖，产率达到最高为67.75％，黑曲霉二糖的产量能达到338.75g/L，为目前已报道黑曲霉二糖酶法制备的最高产量。因此此酶适合食品、医药等工业应用的需要，能由于黑曲霉二糖的工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种黑曲霉二糖磷酸化酶及其在黑曲霉二糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

黑曲霉二糖(Nigerose)是一种自然界中稀少存在的α-1,3键合的葡萄糖二糖，天然存在于清酒、酱汁等发酵食品中，有优秀的呈味性，具有低甜度、增鲜、具有醇香、预防龋齿、调节肠道健康等多种功效。研究表明，黑曲霉二糖在小鼠体内发挥免疫增强作用，具有作为益生元的潜力；也已被评估为人类细胞系冷冻保存培养基中的添加剂，同时有希望成为生物相容性纳米载体的持续给药模块。

化学合成和酶法制备是生产黑曲霉低聚糖的主要方法，相对于酶法制备，化学合成法成本高昂、产量少，且反应过程中因有重金属离子的参与难以保证其安全性，难以大量生产。日本采用真菌Acremoniun sp.S4G13分泌的α-葡萄糖苷酶以麦芽糖为底物催化制备黑曲霉低聚糖转化率为37％，其中包含黑曲霉二糖组分为23％，整体底物利用率和生产效率较为低下，且产品为α-1,3、α-1,4键型寡糖的混合物，纯度较低。糖苷磷酸化酶(glycoside phosphorylase)是一种催化糖类物质磷酸解生成葡萄糖-1-磷酸及相应残糖的一类酶，同时可催化其逆磷酸解合成反应。与α-葡萄糖苷酶相比，由糖苷磷酸化酶催化的可逆合成反应所用糖基供体为葡萄糖-1-磷酸，反应平衡更有利于糖苷键的合成，转化率一般较高。而葡萄糖-1-磷酸通常可利用相对廉价的糖类底物通过磷酸化反应获得，底物成本低，使得磷酸化酶在工业方面的研究更加广泛。随着新型黑曲霉二糖磷酸化酶的发现与鉴定，使用黑曲霉二糖磷酸化酶与麦芽糖磷酸化酶协同反应成为催化黑曲霉二糖合成的新方法，反应过程如图1所示。

但是目前此种方法的生产效率仍较低，无法实现工业化的需求。

发明内容

鉴于目前黑曲霉二糖产量和生产效率较低的问题，本发明鉴定得到了一种新型黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP，将此酶与麦芽糖磷酸化酶协同催化麦芽糖，可使得黑曲霉二糖产量得到显著提升。

本发明提供了一种重组菌，表达来源于Anaerosporobacter mobilis DSM 15930的黑曲霉二糖磷酸化酶。

在一种实施方式中，编码所述黑曲霉二糖磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，以枯草芽孢杆菌为出发菌株。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis WSH11，记载于公布号为CN108102997A的专利中。

在一种实施方式中，以pBSMμL3为表达载体，载体序列记载于公布号为CN107058205A的专利中。

本发明提供了一种制备黑曲霉二糖的方法，所述方法是以麦芽糖、或麦芽糖和葡萄糖的混合物为底物，将麦芽糖磷酸化酶和利用权利要求1-4任一项所述重组菌表达的黑曲霉二糖磷酸化酶、或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的黑曲霉二糖磷酸化酶共同转化生产黑曲霉二糖。

在一种实施方式中，麦芽糖磷酸化酶和黑曲霉二糖磷酸化酶的加酶量比例为(1～2.5):(1～2.5)。

在一种实施方式中，麦芽糖磷酸化酶和黑曲霉二糖磷酸化酶的加酶量比例为1:2.5或2.5:1。

在一种实施方式中，所述麦芽糖磷酸化酶的加酶量为0.2～2.5U/mL

在一种实施方式中，所述麦芽糖磷酸化酶的加酶量为0.6～1.0U/mL。

在一种实施方式中，反应体系中的磷酸盐浓度为10-25mM。

在一种实施方式中，以麦芽糖为底物时，麦芽糖的浓度为200-500g/L.

在一种实施方式中，以麦芽糖和葡萄糖的混合物为底物时，麦芽糖浓度为200g/L，葡萄糖浓度为50-100g/L。

在一种实施方式中，在pH5.0-7.0、30-40℃下反应，反应时间不低于24h。

在一种实施方式中，反应pH为6.0-7.0。

本发明的有益效果：本发明提供了提供一种新型黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP及其高效表达方法。由化学法合成编码来源于运动厌氧孢杆菌(Anaerosporobacter mobilis DSM15930)的黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP的核苷酸序列，以穿梭质粒pBSMμL3为表达载体，以Bacillus subtilis WSH11为表达宿主，实现了黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达。将黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP与麦芽糖磷酸化酶LbMP协同反应可催化麦芽糖转化生成黑曲霉二糖，当麦芽糖底物浓度为50％时，产率达到最高为67.75％，此时黑曲霉二糖的产量能达到338.75g/L，为目前已报道黑曲霉二糖酶法制备的最高产量。因此此酶适合食品、医药等工业应用的需要，能由于黑曲霉二糖的工业化生产。

附图说明

图1是黑曲霉二糖磷酸化酶与麦芽糖磷酸化酶协同反应合成黑曲霉二糖的流程图。

图2是葡萄糖氧化酶(GOD)试剂盒测定葡萄糖含量标准曲线图。

图3是黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP和麦芽糖磷酸化酶LbMP重组酶液电泳图；M为marker，FS、PS、PC分别表示重组菌胞外发酵上清、菌体破壁上清和破壁沉淀图。

图4是不同温度下黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP的磷酸解活性相对酶活图。

图5是不同pH下黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP的磷酸解活性相对酶活图。

图6是二糖磷酸化酶催化制备黑曲霉二糖反应产物离子色谱检测结果图。

图7是加酶量对二糖磷酸化酶催化制备黑曲霉二糖转化率的影响图。

图8是磷酸浓度对二糖磷酸化酶磷酸解活性和制备黑曲霉二糖转化率的影响图。

图9是不同底物下二糖磷酸化酶催化制备黑曲霉二糖转化率图。

具体实施方式

(一)二糖磷酸化酶酶活力分析：

(1)酶活单位定义：每毫升酶液每分钟磷酸解黑曲霉二糖或麦芽糖产生1μmol的葡萄糖的酶活力为一个酶活单位。

(2)酶活力测定步骤

通过葡萄糖氧化酶(GOD)试剂盒测定葡萄糖含量计算获得，具体反应步骤如下：取70μL终浓度为4mM的黑曲霉二糖的磷酸盐缓冲液溶液，与70μL适当稀释的酶液混合均匀，于适当温度下反应10min，煮沸5min终止反应，然后加入2.1mL GOD显色液显色10min，使用分光光度计测定OD

表1 GOD法葡萄糖标准曲线的制定

(二)培养基：

LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

TB培养基：酵母粉24g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨12g/L，K

RM培养基：酵母提取物5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，山梨醇90.0g/L，甘露醇70.0g/L。

实施例1：黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP重组菌株的构建及发酵产酶

根据Genbank数据库中运动厌氧孢杆菌(Anaerosporobacter mobilis DSM15930)黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP氨基酸序列(SHM33122.1)，化学合成核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的基因。

将合成的基因片段与pET-24a酶切后(酶切位点：Nde I和EcoR I)连接得到连接产物；将连接产物通过热激转化法转化至大肠杆菌E.coli.JM109。得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有0.05mg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子。

热激转化法：

(1)将E.coli.JM109感受态细胞提前放在冰上5min中，待感受态完全融化后，向其中加入10μL完整质粒或者PCR产物，轻柔吹吸均匀后，置于冰上放置45min。

(2)将感受态放置到42℃水浴锅中热激90s，热激结束后，放置在冰上5min。

(3)冰浴结束后，向感受态中加入0.8mL LB液体培养基，混匀后放到37℃摇床中震荡培养60min左右。

(4)培养结束的感受态3000rpm离心5min，弃部分上清液，留200μL左右的发酵液将菌体重新吹吸重悬，涂布到含10μg/mL氨苄抗生素的LB固体平板上，37℃培养箱静置培养10h左右，等待平板长出单菌落。

挑取单克隆菌落接种至含10μg/mL氨苄青霉素抗性LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pET24a-AmNP。

以质粒pET24a-AmNP和pBSMμL3为模板，分别设计上下游包含15bp同源臂的目的基因引物和载体引物，PCR扩增带同源臂的目的基因片段tsbgl(引物1和2)及模板片段pBSMμL3(引物3和4)；

引物1：TAAGGAGTGTCAAGAATGAGCATGATCGCCGATCTGAAGAACT；

引物2：GCGCAGTGATTAACCTTAATCTTCCAGGCCGTTATTTTTAATAAC；

引物3：AAGCTTGGTAATAAAAAAACACCTC；

引物4：CATTCTTGACACTCCTTATTTG。

PCR体系为：2×Super Pfx MasterMix 25μL，两条引物各1.25μL，ddH

反应条件为：①94℃、4min，②94℃、1min，③55℃、1min，④72℃、2min，将②～④扩增35个循环后，⑤72℃、5min，⑥4℃保温；分别扩增得到目的基因片段AmNP及模板片段pBSMμL3。

扩增的片段通过(天根生化科技有限公司)胶回收试剂盒回收，进行测序验证，将测序验证正确的两条回收片段通过In-Fusion HD Cloning Plus kit试剂盒连接，连接体系为：基因片段400ng，载体片段200ng，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，用水补足至10μL；将连接体系在50℃下反应25min后，得到连接产物，将连接产物转化克隆宿主JM109(具体实施方式参见上文热激转化法)，涂布到LB固体培养基上(含10μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养8-10h后，挑单菌落至含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h后收集菌体提取质粒(质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司)，得到pBSMμL3-AmNP质粒，酶切验证并送公司测序验证。

将酶切验证及测序正确的重组质粒pBSMμL3-AmNP线性化后电转化至Bacillussubtilis WSH11(Bacillus subtilis WSH11记载于公布号为CN108102997A的专利中)。重组质粒pBSMμL3-AmNP电击转化Bacillus subtilis WSH11感受态细胞：

(1)将Bacillus subtilis WSH11感受态细胞提前放在冰上5min，待感受态完全融化后，向其中加入10μL重组质粒，轻柔吹吸均匀后，置于冰上放置15min；

(2)电转仪提前打开预热30min，电击电压设置为2400V，将冰浴结束的感受态缓慢加入到提取预冷的直径为2mm规格的电击杯中，将电击杯外壁的水擦干净后，将电击杯放到转化仪中电击；

(3)电击结束后将快速向其中加入1mL提前预冷好的RM培养基，吹吸均匀后将菌液转移到1.5mL的灭菌的EP管中，置于37℃摇床中，200rpm震荡培养3h；

(4)培养结束的菌液3000rpm离心5min，弃部分上清液，留200μL左右的上清液将菌体重新吹吸重悬，涂布到含四环素抗性的LB固体平板上，37℃培养箱培养10h左右，等待平板长出单菌落；

(5)挑取单菌落，测序验证，得到含有质粒pBSMμL3-AmNP的阳性转化子。

将含有重组质粒pBSMμL3-AmNP的阳性转化子接种至LB液体培养基中(含10μg/mL四环素)培养8-10h后，取5mL培养液转接到100mL TB培养基中，37℃培养2h，再33℃培养48h，发酵结束后，8000rpm离心20min收集菌体。向菌体中加入50mL的50mM pH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，充分重悬菌体后，使用高压匀浆机破壁，10000rpm离心20min后，收集破壁上清液即为粗酶液，OD

采用如上所述相同方法步骤构建获得Lactobacillus brevis来源麦芽糖磷酸化酶LbMP(氨基酸序列如Uniprot ID Q7SIE1所示，参考Stephan Hüwel等Maltosephosphorylase from Lactobacillus brevis:Purification,characterization,andapplication in a biosensor for ortho-phosphate公开于1997年)的重组菌株Bacillussubtilis WSH11/pBSMμL3-LbMP，并发酵获得粗酶液。

将收集到的二糖磷酸化酶AmNP和麦芽糖磷酸化酶LbMP粗酶液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，电泳图见图3。

实施例2：黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP应用条件的确定

(1)黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP最适温度

以黑曲霉二糖为底物，将实施例1中获得的黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP加入酶活测定反应体系中，pH为7.0，在不同温度下进行反应，测定酶活，并计算其相对酶活，结果见图4，具体数据见表2，可见在黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP最适温度为30℃。

表2黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP在不同温度下的相对酶活

(2)黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP最适pH

以黑曲霉二糖为底物，将实施例1中获得的黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP加入酶活测定反应体系中，不同pH下、30℃恒温水浴中反应10min。测定反应后的酶活，并计算其相对酶活，结果见图5，具体数据见表3，可见在黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP最适pH为7.0。

表3黑曲霉二糖磷酸化酶AmNP在不同pH下的相对酶活

实施例3：加酶量对二糖磷酸化酶催化制备黑曲霉二糖转化率的影响

以200g/L的麦芽糖为底物，在pH 7.0、30℃下反应72h，磷酸盐浓度10mM条件下，设置不同加酶量，探究以麦芽糖为底物反应生成黑曲霉二糖时加酶量对产物转化率的影响。

(1)LbMP：AmNP＝1:2.5：

0.2U/mL LbMP+0.5U/mL AmNP；

0.6U/mL LbMP+1.5U/mL AmNP；

1.0U/mL LbMP+2.5U/mL AmNP。

(2)AmNP：LbMP＝1:2.5：

0.2U/mL AmNP+0.5U/mL LbMP；

0.6U/mL AmNP+1.5U/mL LbMP；

1.0U/mL AmNP+2.5U/mL LbMP。

采用离子色谱检测酶转化产物，检测结果如图6所示。可见二糖磷酸化酶AmNP和麦芽糖磷酸化酶LbMP协同反应可有效催化麦芽糖转化为黑曲霉二糖，且产物浓度随着反应时间延长而增加。不同加酶量对黑曲霉二糖转化率的影响结果如图7所示，当加酶比例为LbMP：AmNP＝1:2.5时，黑曲霉二糖转化率较高，且在一定范围内，转化率随着加酶量的增加不断提高，当加酶量达到1.0U/mL LbMP+2.5U/mL AmNP时，底物转化率可达到67.75％，产量能达到136.5g/L。

实施例4：磷酸浓度对二糖磷酸化酶磷酸解活性和制备黑曲霉二糖转化率的影响

以200g/L的麦芽糖为底物，在pH 7.0、30℃下反应72h，加酶量为1.0U/mL LbMP+2.5U/mL AmNP，设置不同磷酸盐浓度，探究以麦芽糖为底物反应生成黑曲霉二糖时加酶量对产物转化率的影响。结果如图8所示，在一定范围内，转化率随着磷酸浓度的增加不断提高，当磷酸浓度为10mM时转化率达到最高67.75％，继续增加磷酸浓度，由于二糖磷酸化酶AmNP和麦芽糖磷酸化酶LbMP的磷酸解活性显著提高，不利于合成反应的进行，导致产物黑曲霉二糖的转化率反而降低。因此，最佳磷酸盐浓度为10mM。

实施例5：不同底物下二糖磷酸化酶催化制备黑曲霉二糖转化率

在pH 7.0、30℃下反应72h，加酶量为1.0U/mL LbMP+2.5U/mL AmNP，磷酸盐浓度为10mM条件下，设置不同底物组成和浓度，探究底物组分对对产物转化率的影响。实验结果如图9所示，当以麦芽糖为底物时，黑曲霉二糖转化率随着麦芽糖浓度的增加不断提高，当底物为50％(500g/L)麦芽糖时转化率达到最高67.75％。在麦芽糖中添加5％(50g/L)和10％(100g/L)浓度的葡萄糖作受体，由于底物量的增加，导致产物黑曲霉二糖的转化率反而降低。因此，最佳底物浓度为50％麦芽糖。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种黑曲霉二糖磷酸化酶及其在黑曲霉二糖制备中的应用

<130> BAA210282A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatcgccg atctgaagaa ctggaccatt aaggaaagcg gcttcagcga agataaggtt 60

accagcaatg gcaacaagtt cctgtgcggc aatggttatc tgggtattcg cggtacactg 120

gaagaatttg acaaggaata cctgccgagc atcaacctgg caggtattta tgatcaggtg 180

ggtaacggtt ggcgtgaacc gttaaatgcc ccgaatggtc tgtatacccg tattaaaatc 240

gacggcgtgt actacgacct gccgaaaaat gaacctgtta accacgagca ggaggttaat 300

taccgtcatg gcattgtgac ccgcattacc cgttgggaaa cccgtcgtgg taatattacc 360

gttacctgtg agcgcttcgc acattatgat aaggtgcatc tgatctgcat gagatacagc 420

atcctggcag atttccacgc cgatgttgaa attctgaccg gcattgatgg cgatgtgtgg 480

gatattcatg gcccgcatta tgatcagctg ctgtttgaag aggaggacat tttcaccgcc 540

accggcatta cccatgaaaa taaagaccgc gtggccgttg cagaagaaat tagtgtgaac 600

cacccgtacg agcgcaaacg taaaaaagaa ggtcgcaagc tgctgcatcg tatttgtctg 660

attaccgagg caaacaagaa gatcgacctg gataagatgg tggccattta caccagtaag 720

gactgcaaag agccggaaga agccgccaaa aaagaagtgc gtgaagccct gcaacgtggc 780

tatgaagtgt gtaaaagcac ccacatgaac atctgggagg aacattggaa gaccgcagaa 840

atttacatcg agggcgatcc ggaagcaatg gaagccttaa attacagcct gtaccacctg 900

caatgtattg caccgcgcca tagcgatagc ctgagcattg cagcacgcgg tctgagtggt 960

cagacctata aaggcgcagt gttttgggat accgagatgt ttatgctgga ctacttcctg 1020

tatactcagc cggaagttgc aaagaccctg ctgcgttatc gcattgatac cctggaaggc 1080

gcaaaaaaaa aggcagaaag ctacggttac gagggcgcct tttatgcctg ggaaagccag 1140

gaaggtggtt atgatgcctg tagcgattac aacgtgaccg atgtgttcac caagcgcccg 1200

atgcgtaccc attttaaaga taagcagatc cacatcagcg cagccattgt gtatggcatt 1260

atgcgttacg tgaagatcac cggcgatcag cgctttctgg aacagggtgg tattgaaacc 1320

atcctggaat gcgcaaagtt ctacgatttc ctgctggtta agaaggtgca cagcgatcag 1380

tatgagctgc atgatgttat cggcccggat gaatatcacg aacgtgtgaa taacaacggt 1440

tacaccaacc gtatggccaa attcaccttc gaaaccgccg caaaactgct ggatgatctg 1500

atgaaattca gcaaggagac gatcgagaag atcgaagata actacgacgt ggagcgttgt 1560

aagatggatt accgcgaagc cgcagaacgt atttttatcc cgaagccgga tgagaacggt 1620

gttctggaac agtttgacgg ctatggcaaa ctggaagatg caagtgttga ggaagtgaag 1680

ggccgcctgc tgcatgaaaa agaatattgg ggcggtgcct acggtgttgc ctcacagacc 1740

aaagtgatta agcaggccga tgtggttacc tggctgacca tgtttagcga agatttcagc 1800

gaggaggtga tgctgaaaaa ctggcgctat tacgagccgc gcaccgaaca tggtagtagt 1860

ctgagcgcct gtatgtatgc actgctggcc tgccgttgtg gtatgcctca aaaagcctat 1920

agcttcttca tgaagagcgc cagcgccgat ctgctgcctg gtggtaagga atgggccggt 1980

ttagtttata tcggcggcac ccatccggca gctgccggtg gtgcatacat gaccgcaatt 2040

cagggctttg gtggtgtgta tgttgaggat ggcgaactga aagtgaagcc gcagctgcct 2100

gaacagtgga aaaaactgcg ctttaccatc aagtaccaga accagctgta cgaaatcatc 2160

gagacaaagg acagcgcagt gattaacccg ctgcatcatc atcatcacca ctaa 2214

<210> 2

<211> 731

<212> PRT

<213> Anaerosporobacter mobilis

<400> 2

Met Ile Ala Asp Leu Lys Asn Trp Thr Ile Lys Glu Ser Gly Phe Ser

1 5 10 15

Glu Asp Lys Val Thr Ser Asn Gly Asn Lys Phe Leu Cys Gly Asn Gly

20 25 30

Tyr Leu Gly Ile Arg Gly Thr Leu Glu Glu Phe Asp Lys Glu Tyr Leu

35 40 45

Pro Ser Ile Asn Leu Ala Gly Ile Tyr Asp Gln Val Gly Asn Gly Trp

50 55 60

Arg Glu Pro Leu Asn Ala Pro Asn Gly Leu Tyr Thr Arg Ile Lys Ile

65 70 75 80

Asp Gly Val Tyr Tyr Asp Leu Pro Lys Asn Glu Pro Val Asn His Glu

85 90 95

Gln Glu Val Asn Tyr Arg His Gly Ile Val Thr Arg Ile Thr Arg Trp

100 105 110

Glu Thr Arg Arg Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Glu Arg Phe Ala His

115 120 125

Tyr Asp Lys Val His Leu Ile Cys Met Arg Tyr Ser Ile Leu Ala Asp

130 135 140

Phe His Ala Asp Val Glu Ile Leu Thr Gly Ile Asp Gly Asp Val Trp

145 150 155 160

Asp Ile His Gly Pro His Tyr Asp Gln Leu Leu Phe Glu Glu Glu Asp

165 170 175

Ile Phe Thr Ala Thr Gly Ile Thr His Glu Asn Lys Asp Arg Val Ala

180 185 190

Val Ala Glu Glu Ile Ser Val Asn His Pro Tyr Glu Arg Lys Arg Lys

195 200 205

Lys Glu Gly Arg Lys Leu Leu His Arg Ile Cys Leu Ile Thr Glu Ala

210 215 220

Asn Lys Lys Ile Asp Leu Asp Lys Met Val Ala Ile Tyr Thr Ser Lys

225 230 235 240

Asp Cys Lys Glu Pro Glu Glu Ala Ala Lys Lys Glu Val Arg Glu Ala

245 250 255

Leu Gln Arg Gly Tyr Glu Val Cys Lys Ser Thr His Met Asn Ile Trp

260 265 270

Glu Glu His Trp Lys Thr Ala Glu Ile Tyr Ile Glu Gly Asp Pro Glu

275 280 285

Ala Met Glu Ala Leu Asn Tyr Ser Leu Tyr His Leu Gln Cys Ile Ala

290 295 300

Pro Arg His Ser Asp Ser Leu Ser Ile Ala Ala Arg Gly Leu Ser Gly

305 310 315 320

Gln Thr Tyr Lys Gly Ala Val Phe Trp Asp Thr Glu Met Phe Met Leu

325 330 335

Asp Tyr Phe Leu Tyr Thr Gln Pro Glu Val Ala Lys Thr Leu Leu Arg

340 345 350

Tyr Arg Ile Asp Thr Leu Glu Gly Ala Lys Lys Lys Ala Glu Ser Tyr

355 360 365

Gly Tyr Glu Gly Ala Phe Tyr Ala Trp Glu Ser Gln Glu Gly Gly Tyr

370 375 380

Asp Ala Cys Ser Asp Tyr Asn Val Thr Asp Val Phe Thr Lys Arg Pro

385 390 395 400

Met Arg Thr His Phe Lys Asp Lys Gln Ile His Ile Ser Ala Ala Ile

405 410 415

Val Tyr Gly Ile Met Arg Tyr Val Lys Ile Thr Gly Asp Gln Arg Phe

420 425 430

Leu Glu Gln Gly Gly Ile Glu Thr Ile Leu Glu Cys Ala Lys Phe Tyr

435 440 445

Asp Phe Leu Leu Val Lys Lys Val His Ser Asp Gln Tyr Glu Leu His

450 455 460

Asp Val Ile Gly Pro Asp Glu Tyr His Glu Arg Val Asn Asn Asn Gly

465 470 475 480

Tyr Thr Asn Arg Met Ala Lys Phe Thr Phe Glu Thr Ala Ala Lys Leu

485 490 495

Leu Asp Asp Leu Met Lys Phe Ser Lys Glu Thr Ile Glu Lys Ile Glu

500 505 510

Asp Asn Tyr Asp Val Glu Arg Cys Lys Met Asp Tyr Arg Glu Ala Ala

515 520 525

Glu Arg Ile Phe Ile Pro Lys Pro Asp Glu Asn Gly Val Leu Glu Gln

530 535 540

Phe Asp Gly Tyr Gly Lys Leu Glu Asp Ala Ser Val Glu Glu Val Lys

545 550 555 560

Gly Arg Leu Leu His Glu Lys Glu Tyr Trp Gly Gly Ala Tyr Gly Val

565 570 575

Ala Ser Gln Thr Lys Val Ile Lys Gln Ala Asp Val Val Thr Trp Leu

580 585 590

Thr Met Phe Ser Glu Asp Phe Ser Glu Glu Val Met Leu Lys Asn Trp

595 600 605

Arg Tyr Tyr Glu Pro Arg Thr Glu His Gly Ser Ser Leu Ser Ala Cys

610 615 620

Met Tyr Ala Leu Leu Ala Cys Arg Cys Gly Met Pro Gln Lys Ala Tyr

625 630 635 640

Ser Phe Phe Met Lys Ser Ala Ser Ala Asp Leu Leu Pro Gly Gly Lys

645 650 655

Glu Trp Ala Gly Leu Val Tyr Ile Gly Gly Thr His Pro Ala Ala Ala

660 665 670

Gly Gly Ala Tyr Met Thr Ala Ile Gln Gly Phe Gly Gly Val Tyr Val

675 680 685

Glu Asp Gly Glu Leu Lys Val Lys Pro Gln Leu Pro Glu Gln Trp Lys

690 695 700

Lys Leu Arg Phe Thr Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Leu Tyr Glu Ile Ile

705 710 715 720

Glu Thr Lys Asp Ser Ala Val Ile Asn Pro Leu

725 730