黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母和黑曲霉中的分泌表达

摘要

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase EC1.1.3.4.)全称为β-D-吡喃型葡萄糖需氧脱氢酶，简称GOD。在氧气存在时它能将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸从而有效地将氧去除。由于其天然无毒副作用而被广泛地用于食品加工、医药及生物领域。目前葡萄糖氧化酶的工业化生产主要采用黑曲霉或者青霉发酵，但是在发酵过程中，较低的表达量以及杂蛋白的存在给分离纯化带来很大困难，导致产品的成本增高。通过基因工程方法构建工程菌以实现葡萄糖氧化酶的快速高效表达，是一条经济有效的途径。
　　 本实验从一株产葡萄糖氧化酶的黑曲霉中克隆得到葡萄糖氧化酶基因，分别构建毕赤酵母表达载体及黑曲霉表达载体，将重组载体转化到毕赤酵母和高产糖化酶的生产菌种黑曲霉中，以期实现葡萄糖氧化酶的高效分泌表达，以解决葡萄糖氧化酶单位产量低的问题，从而为其工业化生产探索出一条新途径。
　　 本论文的主要研究结果如下：
　　 1.GOD基因在毕赤酵母中的表达
　　 以一株产葡萄糖氧化酶的黑曲霉为材料，通过PCR方法克隆得到GOD基因，测序表明GOD基因全长1818 bp，经Blast比对发现克隆得到的GOD基因与登录号为EU532181.1的基因相似度达100％。将GOD基因与实验室前期构建的毕赤酵母表达载体pGAPHαM连接，构建毕赤酵母表达载体pGAPHαM-GOD。将载体质粒用限制性内切酶BglⅡ线性化后电击转化法转毕赤酵母GS115，经PCR鉴定获得重组转化子，但在重组转化子的发酵液上清中并未检测到GOD酶活。
　　 2.农杆菌介导的黑曲霉转化体系的建立
　　 从培养基的选择、共培养的温度与时间、筛选的温度与时间、头孢噻肟钠对农杆菌的抑制浓度、潮霉素对黑曲霉的筛选压力等方面进行摸索。最终确定使用PDA培养基、在28℃下共培养72 h，32℃下筛选一周以上，共培养时乙酰丁香酮(AS)终浓度200μmol/L，筛选时头孢及潮霉素B终浓度为400 mg/L和200 mg/L。
　　 3.黑曲霉表达载体的构建及在黑曲霉中的表达
　　 利用重叠延伸PCR技术，将5'Gla、GOD和GOD、3'Gla进行连接，得到重叠延伸产物5'Gla-GOD和GOD-3'Gla，将两段重叠延伸产物酶切后连接，得到拼接产物5'Gla-GOD-3'Gla。将此产物与实验室前期构建的黑曲霉表达载体pSZH连接，构建重组表达载体pSZH-GOD。
　　 将质粒pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGLI，挑取农杆菌转化子PCR鉴定正确后与黑曲霉在已建立好的转化条件下进行共培养与筛选，将抗性菌提取基因组并PCR验证。表明得到的转化子均为同源重组转化子，但其中混有非同源重组菌较难对其进行分离。对转化子进行酶活测定，酶活数据结果表明GOD基因在重组菌中得到了分泌表达。在不同培养基中的分泌表达量有所不同，在pH5.5的淀粉培养基中添加0.01% Triton可使酶活达到最高，为13.208U/mL。