黑曲霉葡萄糖氧化酶在毕赤酵母SMD1168中的表达

摘要

葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，在分子氧的存在下，利用氧为电子受体，专一性氧化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。葡萄糖氧化酶在生物医学、食品工业等多个领域发挥着越来越重要的作用，其主要分布于多种动物、植物和微生物中，但从动植物中获取GOD量少且有一定的局限性，而细菌产的GOD也较少，最主要的生产菌株是黑曲霉和青霉，但黑曲霉和青霉生产GOD产量低、纯化工艺繁杂，因此用基因工程方法构建更优良的GOD生产菌株一直受到高度重视。
　　 巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的外源基因真核表达系统之一，其蛋白表达量高，且被表达的蛋白中杂蛋白少。毕赤酵母还具有能够严格调控外源蛋白的表达，对表达产物进行加工、折叠和翻译后修饰，以及可将外源蛋白分泌至胞外等优点。与其它真核表达系统相比，毕赤酵母表达系统更加快捷、方便、高效。
　　 启动子是基因表达调控的顺式作用元件，也是影响基因表达的关键元件。启动子在基因水平上的重要作用，不仅控制基因的表达水平，同时也控制着基因表达的时空顺序，因此启动子的活性很大程度上影响着基因的表达水平。而不同的启动子对同一种蛋白质所表现出的活性也往往是不同的。所以选用合适的启动子对于提高基因表达水平，促进外源蛋白在毕赤酵母中的生成是相当重要的。质粒pGAPZαA(3147bp)是一种表达型载体，自身携带3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子可在毕赤酵母中表达多种重组蛋白，这是一种组成型表达，无需其他诱导物。
　　 本研究利用从黑曲霉accc30161克隆的GOD基因构建了含GAP启动子的分泌型表达载体pGAPZα A-GOD，并在毕赤酵母 GS115、KM71和SMD1168菌株中对其进行了表达，以期观察GAP启动子对不同毕赤酵母菌株GOD蛋白表达水平的影响。
　　 实验方法:
　　 1.黑曲霉accc30161基因组的提取以及葡萄糖氧化酶基因的扩增与测序;
　　 2.葡萄糖氧化酶基因重组质粒的构建及电泳、PCR、酶切、测序鉴定;
　　 3.重组质粒电转化毕赤酵母SMD1168，并用PCR扩增分析转化结果;
　　 4.葡萄糖氧化酶SDS-PAGE蛋白电泳;
　　 5.葡萄糖氧化酶活性分析;
　　 6.温度及培养基pH对毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶的影响。
　　 实验结果:
　　 1.测序结果显示成功扩增得到了黑曲霉葡萄糖氧化酶基因;
　　 2.成功构建了葡萄糖氧化酶基因重组质粒pGAPZαA-GOD;
　　 3.筛选得到毕赤酵母转化子SMD1168-GOD;
　　 4.SDS-PAGE蛋白电泳结果显示葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中得到了表达;
　　 5.SMD1168-GOD表达的葡萄糖氧化酶具有活性;
　　 6.温度及培养基pH显著影响葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达。
　　 结论:
　　 用黑曲霉accc30161的葡萄糖氧化酶基因成功构建了葡萄糖氧化酶基因表达载体pGAPZαA-GOD。转化后，pGAPZαA-GOD相关DNA片段已整合进重组毕赤酵母SMD1168-GOD基因组中。SMD1168-GOD可高表达具有活性的GOD，在30℃、pH6的条件下，SMD1168-GOD培养液上清GOD酶活可达107.18 u/mL。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料

方法

结果

讨论

附表

附图

参考文献

致谢

硕士期间主要研究成果

学位论文评阅及答辩情况表