一种基于不同微生物细胞工厂异源表达酶的快速优化方法

摘要

本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种优化微生物细胞工厂异源表达酶的方法，该方法包括：通过设计程序化实验的方法，分别测定不同外部环境因素下酶表达水平和微生物细胞工厂生长水平，并以最高酶表达水平作为酶参比水平，最高微生物细胞工厂生长水平作为细胞参比水平；选择酶表达水平达到酶参比水平至少90％且微生物细胞工厂生长水平达到细胞参比水平至少70％时的条件作为微生物细胞工厂异源表达酶的优化条件。本发明提供的方法具有综合考虑酶表达特性与宿主细胞生长特性，确定定性定量的生产表达方法，能够实现从菌株构建到生物催化工艺的快速跳跃的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种优化微生物细胞工厂异源表达酶的方法和应用，特别是常规模式细菌或模式真菌的诱导表达和培养工艺开发，综合考虑酶表达特性与宿主细胞生长特性，确定定性定量的生产表达方法，实现从菌株构建到生物催化工艺的快速跳跃。

背景技术

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体，是一种自然界中存在含量极少的稀有单糖，其具有热量值极低，与蔗糖甜度相似但吸收率仅为蔗糖的0.3％的特点，故可以作为低热甜味剂替代蔗糖。研究表明，D-阿洛酮糖具有多种营养学和生理学功能，例如可以增强胰岛素耐受性，抑制餐后血糖升高，减少腹内脂肪堆积，且具有预防糖尿病的作用。此外，阿洛酮糖还有抗炎效果，具有保护神经，清除活性氧自由基，以及治疗动脉粥状硬化的作用。在2014年，阿洛酮糖已经被美国食品和药物管理局认定为安全食品(GRAS)。

目前，D-阿洛酮糖的化学合成比较困难，过程副产物较多，尚未有突破性进展。而生物转化方法单一，纯化步骤简单，因此受到科研人员的重点关注。国内外学者对于不同来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)基因进行了克隆表达，D-阿洛酮糖与D-果糖之间的平衡转化率均在30％左右，但异源表达的工艺并没有被详细描述或者系统性研究。江南大学报道了不同梭菌来源的DPEase的菌株构建与酶催化效果，对于DPEase表达的优化仅参考了常规发酵条件，并没有基于DPEase的特性和工程细胞生长特性的结合，系统地优化出(非)诱导培养工艺。中国科学院天津工业生物技术研究所也报道了瘤胃球菌属来源的DPEase在枯草芽孢杆菌体系的异源表达，温度和pH等环境参数并没有综合比较。后来该团队通过全通路代谢工程改造，形成了D-阿洛酮糖直接合成工艺，但菌株稳定性有待验证。

异源蛋白的诱导和非诱导性表达，与菌体生长的特性息息相关，发酵表达水平同时会关系到工程酶的产业化应用，因此快速有效的开发出低成本高表达的培养表达工艺，对于工业酶产品项目的落地转化至关重要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的酶异源表达优化过程中并未兼顾微生物细胞工厂本身细胞生长特性和酶的表达特性的缺陷，提供一种优化微生物细胞工厂异源表达酶的方法和应用，该方法具有综合考虑酶表达特性和宿主细胞生长特性，快速确定定性定量的生产表达方法，能够实现从菌株构建到生物催化工艺的快速跳跃的特点。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种优化微生物细胞工厂异源表达酶的方法，其特征在于，该方法包括：通过设计程序化实验的方法，分别测定不同外部环境因素下酶表达水平和宿主细胞生长水平，并以最高酶表达水平作为酶参比水平，最高宿主细胞生长水平作为细胞参比水平；选择酶表达水平达到酶参比水平至少90％且宿主细胞生长水平达到细胞参比水平至少70％时的条件作为微生物细胞工厂异源表达酶的优化条件。

本发明第二方面提供上述微生物细胞工厂异源表达酶的优化方法在优化微生物细胞工厂异源表达蛋白中的应用。

通过上述技术方案，本发明所述方法实现了结合酶表达条件与宿主细胞生长条件，优化出不同细胞工厂异源表达DPEase的理想工艺，从而实现从菌株构建到生物催化工艺的快速跳跃。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明一方面提供一种优化微生物细胞工厂异源表达酶的方法，其特征在于，该方法包括：通过设计程序化实验的方法，分别测定不同外部环境因素下酶表达水平和宿主细胞生长水平，并以最高酶表达水平作为酶参比水平，最高宿主细胞生长水平作为细胞参比水平；选择酶表达水平达到酶参比水平至少90％且宿主细胞生长水平达到细胞参比水平至少70％时的条件作为微生物细胞工厂异源表达酶的优化条件。

根据本发明，所述微生物细胞工厂可以为任意细胞工程中常用的微生物细胞工厂，优选地，所述微生物细胞工厂为细菌和/或真菌。

更优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌中的至少一种。

更优选地，所述真菌包括酵母和/或丝状真菌。

进一步优选地，所述真菌包括毕赤酵母、酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉中的至少一种。

根据本发明，所述酶可以为任意利用细胞工程手段，使用模式微生物进行异源表达的酶，优选地，所述酶为D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)。

根据本发明，具体地，所述微生物细胞工厂的获得方式为：

(1)通过分子生物学手段将目标酶相关基因导入宿主细胞；

(2)经过稳定遗传验证后得到相应的微生物细胞工厂菌株。

根据本发明，所述目标酶相关基因的获取方式可以为本领域中常用的任意获取方式。优选地，所述目标酶相关基因的获取方式为通过生物信息学数据库(如NCBI等)查找。

根据本发明，所述DPEase的来源不限，任何获得DPEase的方法均适用于本发明所述的方法。

优选地，所述DPEase的来源为通过生物信息学数据库(如NCBI等)查找相关基因，并将所述查找到的相关基因通过分子生物学手段导入宿主细胞表达获取。

根据本发明，具体地，所述外部环境因素包括培养基成分、温度、pH、金属离子辅因子的种类、金属离子辅因子的用量、诱导剂的种类和诱导剂的用量中的一种或多种。

根据本发明，所述金属离子辅因子的作用为：辅助促进生长关键酶和DPEase酶的合成与表达。任意可达到上述目的的金属离子辅因子均可以适用于本发明所述的方法。

优选地，所述金属离子辅因子包括镁离子、钴离子、锰离子、铁离子中的至少一种。

根据本发明，所述诱导剂的作用为：启动异源蛋白酶表达。任意可达到上述目的的诱导剂均可以适用于本发明所述的方法。

优选地，所述诱导剂包括乳糖、IPTG、甲醇中的一种。

优选地，除使用诱导剂外，还可以通过温度变化诱导酶的表达。

根据本发明，优选地，所述外部环境因素的参数变量确定需要兼顾DPEase表达特性和宿主细胞生长特性。

优选地，以枯草芽孢杆菌为例，葡萄糖为碳源，酵母粉为氮源，同时添加硫酸钠，温度37℃、pH 7.2，过程流加葡萄糖。

优选地，以大肠杆菌为例，葡萄糖为碳源、酵母粉为氮源、pH7，0.5mM IPTG诱导，培养温度37℃，诱导温度25℃，过程中流加葡萄糖和硫酸镁。

优选地，以毕赤酵母为例，甘油为碳源，无氨基酵母(YNB)为氮源，温度30℃，pH7.2，饥饿培养2-4h后，恒速流加甲醇直至发酵结束。

优选地，以黑曲霉为例，液糖化淀粉为碳源，还原糖DE值在70％以上，玉米浆为氮源，碳氮比为40，温度28℃，pH 6。

根据本发明，所述程序化实验可以是本领域任意常规实验方式。

具体地，所述程序化实验为单因素实验、正交实验和响应面实验中的一种或多种。

本发明第二方面提供上述微生物细胞工厂异源表达酶的优化方法在优化微生物细胞工厂异源表达蛋白中的应用，所述蛋白包括酶和其他任意可采用微生物细胞工厂异源表达的蛋白。

以下将通过具体实施例对本发明进行进一步的解释和说明。应当理解的是，本发明的实施例仅用于解释和说明本发明，而不用于限制本发明。

在本发明的以下实施例中所使用的细胞工厂均为商购获得，其中，枯草芽孢杆菌WB800、毕赤酵母GS115购自Invitrogen，大肠杆菌BW25113购自Novagen，黑曲霉ATCC9029购自ATCC。

在本发明的以下实施例中所使用的果葡糖浆为购自中粮生化(成都)有限公司的果葡糖浆F42。

实施例1

以枯草芽孢杆菌WB800为宿主菌株，DPEase来源于鲍式梭菌(GenebankNo.A8RG82)，组成型无诱导表达，构建得到枯草芽孢杆菌WB800-Bs03。通过响应面方法优化培养基成分、正交试验确定温度和pH条件，结合发酵周期等因素，确定了在枯草芽孢杆菌WB800中DPEase高效表达的诱导培养工艺：以20g/L葡萄糖为碳源，20g/L酵母粉为氮源，同时添加1g/L硫酸钠，温度37℃，pH 7.2，过程流加600g/L葡萄糖。

在该条件下，酶表达水平达到酶参比水平的96％，宿主细胞生长水平达到细胞参比水平的83％。发酵培养36h，枯草芽孢杆菌的生物量达到100OD以上。由上述方法获得的DPEase催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率维持在29％以上。

转化率测定方法：发酵液离心收集菌体后，无菌生理盐水重悬至100OD，600bar压力下均质机处理2-3次，细胞破碎液经离心得到澄清酶液。新鲜酶液经稀释后，与30重量％浓度的果葡糖浆按1:20的体积比混合，55℃反应5min，反应后的样品100℃高温煮10min以终止酶反应。HPLC分析检测反应终止混合液中D-果糖和D-阿洛酮糖的峰面积，以此计算D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率。

实施例2

以大肠杆菌BW25113为宿主菌株，DPEase来源于解纤维梭菌(GenebankNo.B8I944.1)，采用Lac启动子，构建得到大肠杆菌BW25113-Ec01。通过单因素实验考察诱导温度、pH和诱导剂IPTG用量等因素对宿主细胞生长和酶表达的影响，试验范围综合考虑菌体生长的环境参数和蛋白折叠的环境参数，确定了大肠杆菌BW25113中DPEase高效表达的诱导培养工艺：以10g/L葡萄糖为碳源，5g/L酵母粉为氮源，添加0.6g/L硫酸镁，初始培养温度37℃，诱导温度25℃，pH恒定7.0，IPTG终浓度0.5mM，过程中流加600g/L葡萄糖和1g/L硫酸镁。

在该条件下，酶表达水平达到酶参比水平的99％，宿主细胞生长水平达到细胞参比水平的70％。由上述方法获得的大肠杆菌菌体浓度可达到70OD，DPEase催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率维持在30％以上。

转化率测定方法同实施例1。

实施例3

以毕赤酵母GS115为宿主菌株，DPEase来源于根癌土壤杆菌(GenebankNo.ANH56792.1)，构建得到毕赤酵母GS115-Pp01。甲醇诱导表达，分别通过单因素实验优化生长期和产物合成期的环境参数，确定培养基成分、温度、pH和饥饿时间等因素，确定了毕赤酵母GS115中DPEase高效分泌表达的诱导培养工艺：以60g/L甘油为碳源，10g/L无氨基酵母(YNB)为氮源，温度30℃，pH 7.2，饥饿培养约3h后，恒速流加100％甲醇直至发酵结束。

在该条件下，酶表达水平达到酶参比水平的93％，宿主细胞生长水平达到细胞参比水平的70％。由上述方法获得的DPEase催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率维持在28％以上，毕赤酵母的湿菌体生物量达到140g/L。

转化率测定方法：单位量的发酵液离心去除菌体后，清液浓缩得到澄清粗酶液。新鲜粗酶液经稀释后，与30重量％浓度的果葡糖浆按1:20的体积比混合，55℃反应5min。反应后的样品100℃高温煮10min以终止酶反应。HPLC分析检测反应终止混合液中D-果糖和D-阿洛酮糖的峰面积，以此计算D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率。

实施例4

以黑曲霉ATCC9029为宿主菌株，DPEase来源于解纤维梭菌(GenebankNo.B8I944.1)，采用糖化酶基因(glaA)启动子，构建得到黑曲霉ATCC9029-An05。通过单因素实验优化培养基成分和pH条件，确定了DPEase高效分泌表达的诱导培养工艺：在以120g/L液糖化淀粉为碳源，还原糖DE值在70％以上，玉米浆为氮源，使得碳氮比40，温度28℃、pH6.0。

在该条件下，酶表达水平达到酶参比水平的90％，宿主细胞生长水平达到细胞参比水平的75％。由上述方法获得的黑曲霉菌球浓度达到15g DCW/L，DPEase催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率维持在27％以上。

转化率测定方法：单位量的发酵液离心去除菌体后，清液浓缩得到澄清粗酶液。新鲜粗酶液经稀释后，与30重量％浓度的果葡糖浆按1:20的体积比混合，55℃反应5min。反应后的样品100℃高温煮10min以终止酶反应。HPLC分析检测反应终止混合液中D-果糖和D-阿洛酮糖的峰面积，以此计算D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括将各个具体技术特征以任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。但这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。