提高桑树抵御干旱胁迫的NCED基因及其构建和用途

摘要

本发明公开了提高桑树抵御干旱胁迫的NCED基因，所述NCED基因为如下(a)、(b)、(c)或(d)的碱基序列：(a)如SEQ ID NO:1所示；(b)如SEQ ID NO:2所示；(c)编码如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明还公开了重组载体、宿主细胞和构建方法、桑树NCED基因于提高桑树抵御逆境胁迫、桑树抗旱新品种的培育和/或科学研究中的用途。本发明为研究桑树ABA代谢合成机制奠定基础，为通过基因工程调控植物体内ABA的代谢和积累提供基因源，从而为提高桑树的抗旱性提供一个理论基础。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种提高桑树抵御干旱胁迫的NCED基因及其构建和用途。

背景技术

桑树(Morus L.)是重要的经济作物，属于桑科桑属，在我国不同地方均有种植。桑树是一种重要的经济作物，桑叶不仅用于养蚕，桑树中还含有很多有益成分，如酚类物质、生物碱、多糖等。桑树中的DNJ和多糖都有降血糖的功能。不仅如此，桑树还是重要的生态林树种，能在干旱和盐碱地区种植，从而可以用于石漠化和盐碱化土地的治理，同时还能用于重金属污染土壤的修复，所以提高桑树对干旱胁迫的耐受力具有重要意义。

类胡萝卜素是广泛分布于自然界的一种色素，同时也是合成多种活性物质的前体，而类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs)在这个过程中起到了重要作用。CCDs家族包括CCDs和9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因(9-cis-epoxycarotenoid dioxy genase，NCEDs)两个亚家族。在拟南芥中，CCDs家族共含有9个基因，其中5个属于NCEDs亚家族，参与裂解9一顺式一类胡萝卜素最终形成ABA；另外4个(AtCCDl，AtCCD4，AtCCD7和AtCCD8)则属于CCDs亚家族，参与多种类胡萝卜素的裂解。

脱落酸(abscisic acid，ABA)是一类重要的植物激素，研究表明它不仅与果实的成熟和衰老有着密切的关系，也在植物对抗干旱胁迫过程中起着重要作用。有学者认为高等植物主要通过2个途径合成ABA，分为直接途径和间接途径。在间接途径合成脱落酸的过程中NCED起着重要作用。首先玉米黄素(C40类胡萝卜素)在玉米黄质环氧化酶(ZEP)的催化作用下，经过两步环氧化作用生成全反式紫黄质。全反式紫黄质可在β一胡萝卜素羟化酶作用下经过多次反应转化成9一顺式一紫黄质和9一顺式一新黄质，再经NCED于11，12和11'，12'双键处裂解形成C15黄质醛，黄质醛再经短链脱氢酶(ABA2)催化形成ABA醛，ABA醛再经脱落酸醛氧化酶(AAO)作用最终产生脱落酸。

胡萝卜素裂解后的主要产物有脱落酸，而脱落酸参与了植物抵御逆境胁迫的过程，了解NCED基因的功能对进一步探索类胡萝卜素裂解在植物抵御逆干旱胁迫过程中的作用尤为重要。而桑树中的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的功能还没有被鉴定，所以研究桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶的功能是将来培育桑树抗旱品种的理论基础。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供提高桑树抵御干旱胁迫的NCED基因。

本发明再有一个目的是提供提高桑树抵御干旱胁迫的NCED重组载体的构建方法。

本发明另有一个目的是提供桑树NCED基因于提高桑树抵御逆境胁迫、桑树抗旱新品种的培育和/或科学研究中的用途。

为此，本发明提供的技术方案为：

提高桑树抵御干旱胁迫的NCED基因，所述NCED基因为如下(a)、(b)、(c)或(d)的碱基序列：

(a)如SEQ ID NO:1所示；

(b)如SEQ ID NO:2所示；

(c)编码如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(d)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有提高桑树抵御干旱胁迫功能的核苷酸序列。

一种重组载体，其含有所述的NCED基因和与所述NCED基因可操作地连接的用于表达的调节序列。

宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的NCED基因或所述的重组载体。

提高桑树抵御干旱胁迫的蛋白质，其为如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列。

提高桑树抵御干旱胁迫的NCED重组载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、从川桑中分别利用如SEQ ID NO:5和如SEQ ID NO:6所示的引物对、如SEQID NO:7和如SEQ ID NO:8所示的引物对扩增得到包含SEQ ID NO:1的碱基序列和包含SEQID NO:2所示的碱基序列，并分别连接到peasy-blunt载体，构建出peasy-blunt-NCED1和出peasy-blunt-NCED3重组载体；

步骤二、以peasy-blunt-NCED1重组载体为模板、利用如SEQ ID NO:9和如SEQ IDNO:10所示的引物对进行扩增得到包含SEQ ID NO:1的碱基序列，经过酶切和连接后转化入大肠杆菌E.coli DH5a中得到PLGNL-NCED1表达载体；

步骤三、以peasy-blunt-NCED3重组载体为模板、利用如SEQ ID NO:11和如SEQ IDNO:12所示的引物对进行扩增得到包含SEQ ID NO:2的碱基序列，经过酶切和连接后转化入大肠杆菌E.coli DH5a中得到PLGNL-NCED3表达载体。

优选的是，提高桑树抵御干旱胁迫的NCED重组载体的构建方法中，步骤二和步骤三中，所述酶切均采用Kpn I和Spe I双酶切体系酶切基因产物和植物表达载体PLGNL。

桑树NCED基因于提高桑树抵御逆境胁迫、桑树抗旱新品种的培育和/或科学研究中的用途，所述桑树NCED基因为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的碱基序列。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明为研究桑树ABA代谢合成机制奠定基础，为通过基因工程调控植物体内ABA的代谢和积累提供基因源，从而为提高桑树的抗旱性提供一个理论基础。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中桑树NCED基因克隆的电泳检测凝胶图，注：M.5000DNA Marker 1.MnNCED12.MnNCED3；

图2为本发明其中一个实施例中MnNCEDs蛋白序列比对分析图，注：使用ClustalX2.1软件创建比对，Mn024617:MnNCED1，Mn021647:MnNCED3；

图3为本发明其中一个实施例中桑树与其他物种中的NCED蛋白的进化分析图，注：三角形表示桑树的NCED，Mn024617:MnNCED1，Mn021647:MnNCED3；

图4为本发明其中一个实施例中桑树NCED基因结构示意图，注：左边白色的矩形为5'UTR，右边白色的多边形为3'UTR，中间浅灰色、深灰色和黑色矩形均为外显子，其中浅灰色带斜杆的代表叶绿体转运肽，深灰色代表RPE65结构域，浅灰色三角形为转录起始位点。Mn024617:MnNCED1，Mn021647:MnNCED3；

图5为本发明其中一个实施例中PLGNL-MnNCED载体构建中的电泳检测凝胶图，其中5A为MnNCED的双酶切电泳检测凝胶图，5B为MnNCED的大肠杆菌菌液PCR鉴定电泳检测凝胶图；注：M：Marker；a甬道1：MnNCED1 2：MnNCED3；b甬道1-5：MnNCED1；b甬道6-10：MnNCED3。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供提高桑树抵御干旱胁迫的NCED基因，所述NCED基因为如下(a)、(b)、(c)或(d)的碱基序列：

(a)如SEQ ID NO:1所示；如SEQ ID NO:1所示的碱基序列编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。Mn024617、MnNCED1或NCED1基因均指的是如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。

(b)如SEQ ID NO:2所示；如SEQ ID NO:2所示的碱基序列编码如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。Mn021647、MnNCED3或NCED3基因均指的是如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。

(c)编码如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(d)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有提高桑树抵御干旱胁迫功能的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组载体，其含有所述的NCED基因和与所述NCED基因可操作地连接的用于表达的调节序列。

本发明还提供了宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的NCED基因或所述的重组载体。

本发明还提供了提高桑树抵御干旱胁迫的蛋白质，其为如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列。

本发明还提供了提高桑树抵御干旱胁迫的NCED重组载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、从川桑中分别利用如SEQ ID NO:5和如SEQ ID NO:6所示的引物对、如SEQID NO:7和如SEQ ID NO:8所示的引物对扩增得到包含SEQ ID NO:1的碱基序列和包含SEQID NO:2所示的碱基序列，并分别连接到peasy-blunt载体，构建出peasy-blunt-NCED1和出peasy-blunt-NCED3重组载体；

步骤二、以peasy-blunt-NCED1重组载体为模板、利用如SEQ ID NO:9和如SEQ IDNO:10所示的引物对进行扩增得到包含SEQ ID NO:1的碱基序列，经过酶切和连接后转化入大肠杆菌E.coli DH5a中得到PLGNL-NCED1表达载体；

步骤三、以peasy-blunt-NCED3重组载体为模板、利用如SEQ ID NO:11和如SEQ IDNO:12所示的引物对进行扩增得到包含SEQ ID NO:2的碱基序列，经过酶切和连接后转化入大肠杆菌E.coli DH5a中得到PLGNL-NCED3表达载体。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤二和步骤三中，所述酶切均采用Kpn I和Spe I双酶切体系酶切基因产物和植物表达载体PLGNL。

本发明还提供了桑树NCED基因于提高桑树抵御逆境胁迫、桑树抗旱新品种的培育和/或科学研究中的用途，所述桑树NCED基因为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的碱基序列。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

本发明克隆鉴定了桑树NCED基因的功能，具体包括NCED亚家族候选基因的确定、生物信息学分析以及表达载体的构建。本发明为研究桑树ABA代谢合成机制奠定基础，为通过基因工程调控植物体内ABA的代谢和积累提供基因源，从而为提高桑树的抗旱性提供一个理论基础。

1.NCED基因的克隆

以NCBI中下载的已经报道的NCEC基因的氨基酸序列作为query，在川桑蛋白质数据库进行BLASTP比对，得到10条候选氨基酸序列，将得到的结果在NCBI保守结构域预测网站进行结构域预测。结果均属于RPE65 super family家族，其中三条属于NCED亚家族(Mn024617和Mn021647)，其余属于CCD亚家族。这3条NCED候选序列的mRNA为模板设计定量引物，通过Real-time quantitative RT-PCR分析方法在川桑中只鉴定到了2条NCED基因，并通过设计全长特异引物克隆到了2条类NCED基因的全长编码序列(图1)。将类胡萝卜素裂解双加氧酶目的基因如SEQ ID NO:1和2分别所示的碱基序列插入peasy-blunt载体，构建出重组载体，转入大肠杆菌，挑取阳性克隆，经上海生工公司测序，目的片段均是1818bp编码605个氨基酸的蛋白质(图2)，与推测的片段长度均相符，序列均一致，说明已经成功克隆出桑树NCED基因的编码区。4个引物的序列如下：

NCED1-F:5’-ATGGCTTCATCAACTTCTACCAAC-3’(SEQ ID NO:5)

NCED1-R:5’-TCACATCTGCTTCTCCAAATCCTTG-3’(SEQ ID NO:6)

NCED3-F:5’-ATGGCTTCCTCTTTTTTGGCAC-3’(SEQ ID NO:7)

NCED3-R:5’-TCATGCCTGGTGAACCAAGTCC-3’(SEQ ID NO:8)

2.NCED序列分析

利用ClustalX2.1本地软件将桑树类胡萝卜素NCED蛋白序列(SEQ ID NO:3、SEQID NO:4)与已报导的其他物种的NCED蛋白序列进行比对分析，并通过软件MEGA5得到桑树NCED与其他物种NCED的进化图谱(图3)。由进化树可知Mn024617与葡萄的NCED1聚为一支，Mn021647与葡萄的NCED2聚为一支，表明这两个基因属于NCED亚家族，NCBI上的注释为MnNCED1和MnNCED3。

3.桑树NCED氨基酸序列相关性质的预测与分析

通过NCBI保守结构域分析对桑树NCED的氨基酸序列进行了保守结构域在线预测，结果表明桑树NCED均属于RPE65超家族，再分别对其进行信号肽、叶绿体转运肽以及亚细胞定位在线预测，结果表明桑树NCED家族的蛋白都不含有信号肽，但含有叶绿体转运肽，亚细胞定位在线预测结果表明Mn024617(MnNCED1)定位在叶绿体中而Mn024617(MnNCED3)细胞质中，这可能与它们的功能分化有关，根据生物信息学分析绘制出桑树NCED基因结构图(图4)。

4.桑树NCDE基因植物表达载体的构建

根据MnNCED1和MnNCED3基因cDNA全序列的编码区和植物表达载体PLGNL的多克隆位点，设计一对特异引物用于MnNCED1和MnNCED3基因完整开放阅读框的扩增，分别在5’和3’引入Kpn I和Spe I酶切位点

(NCED1-F:5’-ggggtaccccATGGCTTCATCAACTTCTACCAAC-3’，(SEQ ID NO:9)

NCED1-R:5’-ggactagtccTCACATCTGCTTCTCCAAATCCTTG-3’；(SEQ ID NO:10)

NCED3-F:5’-ggggtaccccATGGCTTCCTCTTTTTTGGCAC-3’，(SEQ ID NO:11)

NCED3-R:5’-ggactagtccgaattcTCATGCCTGGTGAACCAAGTCC-3’)。(SEQ ID NO:12)

基因片段和植物表达载体PLGNL经Kpn I和Spe I双酶切，回收目的片段和载体片段(图5a)。将NCED基因片段和载体片段在T4连接酶的作用下16℃过夜连接，连接产物转化感受态E.coli DH5a，涂在含有kan(卡那霉素)的LB平板上，挑取单克隆，进行菌液PCR和测序验证(图5b)。经过测序验证的阳性的重组表达质粒命名为PLGNL-NCED即为构建好的表达载体。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的提高桑树抵御干旱胁迫的NCED基因及其构建和用途的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区蚕业技术推广站

<120> 提高桑树抵御干旱胁迫的NCED基因及其构建和用途

<130> 2019

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1818

<212> DNA

<213> 桑树（Morus L.）

<400> 1

atggcttcat caacttctac caacacttgg gttaattccc aaatccttcc ttcaagttca 60

agcacaagaa ctaataattc tgcaaataca agaaggacca attacataac ttgctctctt 120

caaacccctt ctcttgtaag aattcccaaa cacaccacta ccactccgac ttaccaagcc 180

cccacaacca ttaatccaat ccccaaaatc aagaccccaa aagacaattc ttctaagaat 240

actatttctc tgccaaacca acaatggaac ctccttcaga gagccgccgc agcagcgctg 300

gacgcggcag aaaccgcctt ggtagcccaa gagcgccgcc acccgcttcc aaaaactgcc 360

gaccctcgag tccaaattgc cggaaacttt gctccggtgc cggagcagcc ggtccagcac 420

tcacttcctg tgaccgggaa agtcccgaat tgcattgagg gagtctacgt cagaaacggc 480

gccaaccccc attatgagcc ggtcgccggc caccacttct ttgacggtga cggcatggtc 540

cacgccgtca aattcaataa cggcgccgcc agctacgcct gtcggttcac cgagactaag 600

cggctcgtcc aggagcgggc ccttggtcga ccggtcttcc cgaaggcaat cggcgagcta 660

cacggccatt ccggcatcgc caggctcctc ctcttctacg cccgtggact cttcggcctc 720

gtcgatgcca gccacggcat gggcgtcgcc aacgccggcc tcgtctactt caaccgccgc 780

ctcctcgcta tgtcagaaga cgacttgcct taccacgtga gggtgactcc cgccggagat 840

ttaaaaacgg tcgaccggtt cgacttcaac ggtcagctca agtccgccat gatcgcccat 900

ccaaagctcg atcctgtctc cggcgagctc ttcgctttga gctacgacgt cataaagaag 960

ccttacctca aatacttcaa attctccacc gacgggaaga aatccgacga cgtcgaaatc 1020

cctatcgatc agccgactat gatgcacgat ttcgccatca ctgaaaactt tgtcgtcatc 1080

cccgatcagc aggtcgtgtt caaattgccg gagatgatcc gtggaggctc tccggtggtt 1140

tacgacaaga acaagacctc aagattcggg gtcttagaca agaatgcaaa gggtgaaaag 1200

gatattaagt ggatcgaagc tccggattgc ttctgcttcc acttatggaa tgcttgggag 1260

gagcccgaga gcgacgagat cgtcgtgatc ggatcctgca tgacgccggc ggactccatt 1320

ttcaacgaat gtgaagagag cttaaaaagc gtcttgtcgg aaatcaggct aaatctcaaa 1380

accggcaagt cgactcggcg acccatcatt accgattcgg aacaggtgaa cttggaagcc 1440

gggatggtga accgtaacca gctaggtcgg aaaacccggt tcgcgtacct tgcgctggct 1500

gagccgtggc cgaaagtctc cggttttgct aaagtggact tgtttactgg ccaagtgacc 1560

aagtacttgt atggggatca acgctttggc ggtgagcctc tgtttttgcc tagagagtct 1620

gatattaact ttagctcgga agaagacgat ggatatattc tggcgtttgt tcatgacgag 1680

aaggaatgga aatcacagct tcaaatcatt aacgccatga acatgaagct cgaagcttcc 1740

atagaccttc cctcaagagt cccatacggt tttcacggta cttttataag ctccaaggat 1800

ttggagaagc agatgtga 1818

<210> 2

<211> 1818

<212> DNA

<213> 桑树（Morus L.）

<400> 2

atggcttcct cttttttggc acccaactcc agcagttggg ttggagtcca attgacacac 60

tcttctcccc cttcctcatc ttcatcatta acggacttgg gcttctcatc aaagtccacc 120

atctccgtca agaacaagcc caatagtact agtagtacta ctcgctgcgc tcttcactct 180

ccttctgtac ttcatttccc caaacaaccc tacaatcagc cggtaattac gaaagagccc 240

aagaaaactc accaccacca acccccacag tggaacttcc tacagagagc cgccgccatg 300

gcactcgacg cggccgagac cgcgttgatc tcacgcgagc gcctacaccc tctccctaaa 360

acggccgatc cacgtgttca aatctctgga aacttcgctc ccgtccccga acagcccgtt 420

caccataact tacccgtgac tggcacaatc cccgactgca ttaacggcgt ctatctccga 480

aacggcgcca acccactctt cgagccggtt gccggtcacc acttctttga cggcgacggt 540

atggtccacg ccgttaaaat taacgccggc tcggccagct atgcttgccg gttcacggaa 600

acccaacggc tggttcagga aagagagctt ggccggccgg ttttccccaa agcgatcggc 660

gagctccacg gacattccgg tattgcccgt cttctcctgt tctacgcccg agggcttttt 720

ggtcttctcg accacagcca gggaaccggc gtcgccaacg ccggtctggt ctactttaat 780

ggccgcttgc tagccatgtc ggaggacgac attccgtacc aggtacggat aacggattcc 840

ggcgacctcg aaacagtcgg ccgttacgat ttcaacgacc agcttaaatc caccatgatc 900

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gagattcctc ttgatgttcc aacaatgatg cacgacttcg cgattaccga gaattttgtc 1080

gtgattcccg atcagcaagt ggtgttcaag ttggaggaga tggtgagagg cggttctccg 1140

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gcttcggata ttctgtgggt cgaatcgccg gatacttttt gctttcattt atggaatgct 1260

tgggaggagc cagagacgga ggaggtggtg gtgatcgggt cgtgcatgac acctgccgac 1320

tcgatcttca acgaatgcga tgagagcctt aagagcgttt tgtcggaaat taggcttaat 1380

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gaggtaagga agtactttta cggcaaccgg agatatggcg gggagccgtt ctttctccct 1620

agggatccga attcggagaa ggaagacgac ggtcacgtca tggcgttcgt tcacgacgag 1680

aggacgggga aatcggagat gcagattgtg aacgctgtgg atttggagtt ggaggcatcc 1740

gtgaagctcc cttctagggt gccgtacggt tttcatggaa cttttgtgga ctcaaaggac 1800

ttggttcacc aggcatga 1818

<210> 3

<211> 605

<212> PRT

<213> 桑树（Morus L.）

<400> 3

Met Ala Ser Ser Thr Ser Thr Asn Thr Trp Val Asn Ser Gln Ile Leu

1 5 10 15

Pro Ser Ser Ser Ser Thr Arg Thr Asn Asn Ser Ala Asn Thr Arg Arg

20 25 30

Thr Asn Tyr Ile Thr Cys Ser Leu Gln Thr Pro Ser Leu Val Arg Ile

35 40 45

Pro Lys His Thr Thr Thr Thr Pro Thr Tyr Gln Ala Pro Thr Thr Ile

50 55 60

Asn Pro Ile Pro Lys Ile Lys Thr Pro Lys Asp Asn Ser Ser Lys Asn

65 70 75 80

Thr Ile Ser Leu Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Leu Gln Arg Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Ala Leu Asp Ala Ala Glu Thr Ala Leu Val Ala Gln Glu Arg

100 105 110

Arg His Pro Leu Pro Lys Thr Ala Asp Pro Arg Val Gln Ile Ala Gly

115 120 125

Asn Phe Ala Pro Val Pro Glu Gln Pro Val Gln His Ser Leu Pro Val

130 135 140

Thr Gly Lys Val Pro Asn Cys Ile Glu Gly Val Tyr Val Arg Asn Gly

145 150 155 160

Ala Asn Pro His Tyr Glu Pro Val Ala Gly His His Phe Phe Asp Gly

165 170 175

Asp Gly Met Val His Ala Val Lys Phe Asn Asn Gly Ala Ala Ser Tyr

180 185 190

Ala Cys Arg Phe Thr Glu Thr Lys Arg Leu Val Gln Glu Arg Ala Leu

195 200 205

Gly Arg Pro Val Phe Pro Lys Ala Ile Gly Glu Leu His Gly His Ser

210 215 220

Gly Ile Ala Arg Leu Leu Leu Phe Tyr Ala Arg Gly Leu Phe Gly Leu

225 230 235 240

Val Asp Ala Ser His Gly Met Gly Val Ala Asn Ala Gly Leu Val Tyr

245 250 255

Phe Asn Arg Arg Leu Leu Ala Met Ser Glu Asp Asp Leu Pro Tyr His

260 265 270

Val Arg Val Thr Pro Ala Gly Asp Leu Lys Thr Val Asp Arg Phe Asp

275 280 285

Phe Asn Gly Gln Leu Lys Ser Ala Met Ile Ala His Pro Lys Leu Asp

290 295 300

Pro Val Ser Gly Glu Leu Phe Ala Leu Ser Tyr Asp Val Ile Lys Lys

305 310 315 320

Pro Tyr Leu Lys Tyr Phe Lys Phe Ser Thr Asp Gly Lys Lys Ser Asp

325 330 335

Asp Val Glu Ile Pro Ile Asp Gln Pro Thr Met Met His Asp Phe Ala

340 345 350

Ile Thr Glu Asn Phe Val Val Ile Pro Asp Gln Gln Val Val Phe Lys

355 360 365

Leu Pro Glu Met Ile Arg Gly Gly Ser Pro Val Val Tyr Asp Lys Asn

370 375 380

Lys Thr Ser Arg Phe Gly Val Leu Asp Lys Asn Ala Lys Gly Glu Lys

385 390 395 400

Asp Ile Lys Trp Ile Glu Ala Pro Asp Cys Phe Cys Phe His Leu Trp

405 410 415

Asn Ala Trp Glu Glu Pro Glu Ser Asp Glu Ile Val Val Ile Gly Ser

420 425 430

Cys Met Thr Pro Ala Asp Ser Ile Phe Asn Glu Cys Glu Glu Ser Leu

435 440 445

Lys Ser Val Leu Ser Glu Ile Arg Leu Asn Leu Lys Thr Gly Lys Ser

450 455 460

Thr Arg Arg Pro Ile Ile Thr Asp Ser Glu Gln Val Asn Leu Glu Ala

465 470 475 480

Gly Met Val Asn Arg Asn Gln Leu Gly Arg Lys Thr Arg Phe Ala Tyr

485 490 495

Leu Ala Leu Ala Glu Pro Trp Pro Lys Val Ser Gly Phe Ala Lys Val

500 505 510

Asp Leu Phe Thr Gly Gln Val Thr Lys Tyr Leu Tyr Gly Asp Gln Arg

515 520 525

Phe Gly Gly Glu Pro Leu Phe Leu Pro Arg Glu Ser Asp Ile Asn Phe

530 535 540

Ser Ser Glu Glu Asp Asp Gly Tyr Ile Leu Ala Phe Val His Asp Glu

545 550 555 560

Lys Glu Trp Lys Ser Gln Leu Gln Ile Ile Asn Ala Met Asn Met Lys

565 570 575

Leu Glu Ala Ser Ile Asp Leu Pro Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe His

580 585 590

Gly Thr Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu Glu Lys Gln Met

595 600 605

<210> 4

<211> 605

<212> PRT

<213> 桑树（Morus L.）

<400> 4

Met Ala Ser Ser Phe Leu Ala Pro Asn Ser Ser Ser Trp Val Gly Val

1 5 10 15

Gln Leu Thr His Ser Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser Leu Thr Asp

20 25 30

Leu Gly Phe Ser Ser Lys Ser Thr Ile Ser Val Lys Asn Lys Pro Asn

35 40 45

Ser Thr Ser Ser Thr Thr Arg Cys Ala Leu His Ser Pro Ser Val Leu

50 55 60

His Phe Pro Lys Gln Pro Tyr Asn Gln Pro Val Ile Thr Lys Glu Pro

65 70 75 80

Lys Lys Thr His His His Gln Pro Pro Gln Trp Asn Phe Leu Gln Arg

85 90 95

Ala Ala Ala Met Ala Leu Asp Ala Ala Glu Thr Ala Leu Ile Ser Arg

100 105 110

Glu Arg Leu His Pro Leu Pro Lys Thr Ala Asp Pro Arg Val Gln Ile

115 120 125

Ser Gly Asn Phe Ala Pro Val Pro Glu Gln Pro Val His His Asn Leu

130 135 140

Pro Val Thr Gly Thr Ile Pro Asp Cys Ile Asn Gly Val Tyr Leu Arg

145 150 155 160

Asn Gly Ala Asn Pro Leu Phe Glu Pro Val Ala Gly His His Phe Phe

165 170 175

Asp Gly Asp Gly Met Val His Ala Val Lys Ile Asn Ala Gly Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Ala Cys Arg Phe Thr Glu Thr Gln Arg Leu Val Gln Glu Arg

195 200 205

Glu Leu Gly Arg Pro Val Phe Pro Lys Ala Ile Gly Glu Leu His Gly

210 215 220

His Ser Gly Ile Ala Arg Leu Leu Leu Phe Tyr Ala Arg Gly Leu Phe

225 230 235 240

Gly Leu Leu Asp His Ser Gln Gly Thr Gly Val Ala Asn Ala Gly Leu

245 250 255

Val Tyr Phe Asn Gly Arg Leu Leu Ala Met Ser Glu Asp Asp Ile Pro

260 265 270

Tyr Gln Val Arg Ile Thr Asp Ser Gly Asp Leu Glu Thr Val Gly Arg

275 280 285

Tyr Asp Phe Asn Asp Gln Leu Lys Ser Thr Met Ile Ala His Pro Lys

290 295 300

Val Asp Pro Val Ser Gly Glu Leu Phe Ser Leu Ser Tyr Asp Val Val

305 310 315 320

Leu Lys Pro Tyr Leu Lys Tyr Phe Lys Phe Ser Pro Asn Gly Asp Lys

325 330 335

Ser Pro Asp Val Glu Ile Pro Leu Asp Val Pro Thr Met Met His Asp

340 345 350

Phe Ala Ile Thr Glu Asn Phe Val Val Ile Pro Asp Gln Gln Val Val

355 360 365

Phe Lys Leu Glu Glu Met Val Arg Gly Gly Ser Pro Val Ile Tyr Asp

370 375 380

Ser Lys Lys Lys Ser Arg Phe Gly Ile Leu Pro Lys Asn Ser Gln Asn

385 390 395 400

Ala Ser Asp Ile Leu Trp Val Glu Ser Pro Asp Thr Phe Cys Phe His

405 410 415

Leu Trp Asn Ala Trp Glu Glu Pro Glu Thr Glu Glu Val Val Val Ile

420 425 430

Gly Ser Cys Met Thr Pro Ala Asp Ser Ile Phe Asn Glu Cys Asp Glu

435 440 445

Ser Leu Lys Ser Val Leu Ser Glu Ile Arg Leu Asn Leu Arg Thr Gly

450 455 460

Glu Ser Thr Arg Arg Pro Ile Ile Ser Glu Glu Ser Glu Gln Val Asn

465 470 475 480

Leu Glu Ala Gly Met Val Asn Arg Asn Arg Leu Gly Arg Lys Thr Arg

485 490 495

Phe Ala Tyr Leu Ala Ile Ala Glu Pro Trp Pro Lys Val Ser Gly Phe

500 505 510

Ala Lys Val Asp Leu Arg Thr Gly Glu Val Arg Lys Tyr Phe Tyr Gly

515 520 525

Asn Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Pro Phe Phe Leu Pro Arg Asp Pro Asn

530 535 540

Ser Glu Lys Glu Asp Asp Gly His Val Met Ala Phe Val His Asp Glu

545 550 555 560

Arg Thr Gly Lys Ser Glu Met Gln Ile Val Asn Ala Val Asp Leu Glu

565 570 575

Leu Glu Ala Ser Val Lys Leu Pro Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe His

580 585 590

Gly Thr Phe Val Asp Ser Lys Asp Leu Val His Gln Ala

595 600 605

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<212> DNA

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<213> 人工序列

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