一种山羊PRNT基因单核苷酸多态性标记在性状早期选择中的应用

摘要

本发明公开了一种山羊PRNT基因单核苷酸多态性标记在性状早期选择中的应用。以山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增山羊PRNT基因部分片段，通过测序鉴定该基因的g.149C>T突变位点在山羊群体中的多态性。根据关联分析结果，PRNT基因的这一单核苷酸多态性位点的基因型与山羊的胸围、胸宽极显著相关，可用于快速建立遗传资源优良的山羊群体，从而可以通过山羊性状的早期标记辅助选择加快育种进程。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及山羊PRNT基因单核苷酸多态性(SNP)的分型检测及在分子标记辅助选择育种中的应用。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是一类重要的遗传标记，具有数量大、二态性、稳定遗传和易于自动化检测等特点。伴随着人类基因组计划的开展和完成，世界各地的科研人员陆续开展了囊括大量物种的基因组测序工作，公布了大量的基因组DNA序列，同时构建了包含基因组序列、基因标签、突变位点等生物信息的数据库。基因组学的研究成果极大促进了SNP的发掘和检测技术的发展。SNP检测与分型技术已广泛应用于畜禽遗传学研究、品种选育、种质资源保护等领域，促进了畜禽产业的发展。

测序法是最便捷的SNP检测方法，其基本原理是通过对目的DNA序列进行测序，将结果与参考DNA序列进行对比，以判断目的DNA是否发生碱基突变。测序法具有检出率极高的特点，应用测序法可获知核苷酸突变的类型和突变位点，为后续的SNP分型提供重要基础。同时，随着测序技术自动化程度不断提高，相关测序的成本也不断降低，也为相关研究提供了便利。

PRNT基因作为朊病毒基因家族的成员之一，最初一直以睾丸特异性基因著名。尽管PRNT基因最初由于在成年反刍动物中表达较弱被认为是假基因，但随后PRNT蛋白就在公羊的睾丸和精子中被鉴定出。同时，还有研究发现PRNT基因参与了精子顶体反应并降低了受精率。有研究表明山羊PRNT基因不仅在睾丸中表达，在卵巢中也有表达，因此推测PRNT可以作为山羊的繁殖性能候选基因。

迄今为止，已在牛、绵羊及山羊中鉴定出PRNT内相对少数的多态性。在牛的PRNT基因中鉴定出2个SNP，但未进行多态性与繁殖性状之间的关联分析。同时，在葡萄牙绵羊中鉴定出4个具有3种单倍型的SNP(c.17C>T，c.112G>C，c.129T>C和c.144A>G)。前期研究已经在绵羊PRNT基因中鉴定出7个SNP，这些SNP对5个绵羊品种的生长特性产生了重大影响。此外，尽管最早可以追溯到2017年的韩国本土黑山羊中已经鉴定出4个SNP，但从未有报道它们与山羊生长性状存在关联性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊PRNT基因单核苷酸多态性标记在性状早期选择中的应用，以快速建立优良生长性状的山羊遗传资源群体。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种山羊PRNT基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

以待测山羊(例如，陕北白绒山羊个体)全基因组DNA为模板，通过PCR扩增山羊PRNT基因的部分片段，然后对扩增产物进行直接测序，根据测序结果鉴定山羊个体PRNT基因单核苷酸多态性位点的基因型，所述单核苷酸多态性位点选自山羊PRNT基因核苷酸序列第149位突变位点g.149C>T(登记号：AM412782.1)。

优选的，所述PCR的扩增引物对为：

上游引物：5’-GCCTTCTATATCTCTCTCCTCAC-3’(23nt)

下游引物：5’-ATACTGCACTTCCCTATCTTCTT-3’(23nt)。

优选的，所述PCR采用的反应程序为：95.0℃预变性5min；94.0℃变性30s，68.0℃复性30s，72.0℃延伸20s，每个循环复性温度减1℃，共18个循环；94.0℃变性30s，50.0℃复性30s，72.0℃延伸20s，共30个循环；72.0℃延伸10min。

优选的，根据测序结果，所述单核苷酸多态性位点主要有2种基因型，其中，野生纯合型基因型CC表现为测序图上单峰，杂合型基因型CT表现为测序图上双峰。

一种山羊PRNT基因单核苷酸多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括上述上游引物和下游引物。

上述山羊PRNT基因单核苷酸多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述山羊PRNT基因核苷酸序列第149位突变位点g.149C>T的杂合型基因型为提高山羊胸围和/或胸宽的DNA标记(具体为SNP标记)。

本发明的有益效果体现在：

本发明以山羊基因组DNA为模板，通过序列扩增和直接测序，可以高效、精确地检测山羊PRNT基因外显子区SNP位点(g.149C>T)在山羊(例如，陕北白绒山羊)群体中的不同基因型。根据对山羊PRNT基因的上述SNP位点与山羊的重要体尺性状进行关联分析的结果，本发明检测的山羊PRNT基因SNP位点存在作为提高山羊胸围、胸宽性状的分子标记(SNP标记)，可以用于山羊胸围、胸宽等生长性状的早期选择，快速建立生长性状优良的山羊种群，从而加快良种选育速度。

附图说明

图1为山羊PRNT基因PCR扩增产物测序图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明利用PCR及测序方法对山羊PRNT基因(登记号：AM412782.1)g.149C>T突变位点在陕北白绒山羊群体中可能产生的多态性进行检测，并将其不同基因型与山羊生长性状进行关联分析，揭示其可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记，具体说明如下。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker(100-600bp)(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品，包括柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10

1)提取组织样DNA所用溶液：

除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：

①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。

②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-HCl(pH 8.0)l mL、0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，以及2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝以及0.25％二甲苯青FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.设计山羊PRNT基因突变位点引物

参考前期研究，合成扩增包含山羊PRNT基因g.149C>T位点的DNA片段的引物。引物对序列如下：

上游引物：5’-GCCTTCTATATCTCTCTCCTCAC-3’(23nt)

下游引物：5’-ATACTGCACTTCCCTATCTTCTT-3’(23nt)。

以上述引物对山羊基因组进行扩增，扩增产物中包含山羊PRNT基因g.149C>T变异区域；扩增后的片段通过直接测序鉴定分型。

3.PCR扩增山羊PRNT基因目的片段

3.1陕北白绒山羊耳组织样采集

本发明具体以502头陕北白绒山羊作为检测对象，从陕西省榆林市横山县养殖基地采取耳组织样本，采样时间为：2017年6月-2017年9月。

3.2组织样品基因组DNA的提取与分离

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.4DNA的纯化

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至20ng/μL作为模板，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。

PCR反应体系：2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)、模板DNA(浓度为20ng/μL山羊基因组DNA)0.5μL，以及去离子水5.2μL；共13μL体积的PCR扩增体系。

3.7PCR反应的程序

1)95.0℃预变性5min，然后进入步骤2)；

2)94.0℃变性30s，68.0℃复性30s(每个循环减1℃)，72.0℃延伸20s，共18个循环，然后进入步骤3)；

3)94.0℃变性30s，50.0℃复性30s，72.0℃延伸20s，共30个循环；

4)经过步骤3)后，72.0℃延伸10min。

4.测序鉴定分型

PCR产物(366bp)通过直接测序法进行位点分型鉴定(图1)；其中，野生纯合型基因型CC表现为测序图上单峰，杂合型基因型CT表现为测序图上双峰。

5.山羊PRNT基因突变位点(g.149C>T)的基因型和基因频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率：

P

式中，P

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率：

P

式中，P

山羊PRNT基因突变位点(g.149C>T)的基因型频率、等位基因频率及遗传多态性指数如表1所示。

表1.陕北白绒山羊PRNT基因g.149C>T位点的遗传参数分析

根据对陕北白绒山羊PRNT基因进行基因型和基因频率分析(表1)，结果表明陕北白绒山羊PRNT基因第149位突变位点(g.149C>T)为一个SNP位点。

6.山羊PRNT基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后直接测序识别的基因型；

山羊生长性状数据：体高、体长、十字部高、胸围、管围、胸深、胸宽及髋宽。

关联分析模型：利用SPSS(23.0)软件分析品种不同因素与生长性状相关性。

首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应、基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定模型来进行相关分析，具体分析结果如表2所示。

其中，根据实际条件进行取舍，完整模型如下所示：

Y

式中，Y

表2.PRNT基因SNP位点与陕北白绒山羊生长性状的关联分析(平均值±标准误差)

注：同一行数据平均值肩上字母不同，表示具有统计学差异；具有TT基因型的个体样本量(n＝2)太小，不符合统计学条件，因此不纳入统计分析中。

由表2可以看出，对陕北白绒山羊的生长性状关联分析结果显示PRNT基因g.149C>T突变位点与胸围(P<0.01)和胸宽(P<0.01)极显著相关，CT基因型个体性状优于CC基因型个体。因此，山羊PRNT基因g.149C>T位点杂合基因型(CT)可作为提高山羊胸围、胸宽性状的DNA分子标记，可用于对山羊性状的早期标记辅助选择。

总之，本发明利用PCR扩增方法检测山羊PRNT基因一个新的单核苷酸多态性位点，并将其与陕北白绒山羊的生长性状进行关联分析，发现其存在山羊分子育种中辅助选择的分子标记，可以用于快速建立生长性状优良的山羊种群，从而加快良种选育速度。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种山羊PRNT基因单核苷酸多态性标记在性状早期选择中的应用

<160> 2

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

gccttctata tctctctcct cac 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 2

atactgcact tccctatctt ctt 23