基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法

摘要

本发明公开了基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，具体包括如下步骤：101)筛选标准株系步骤、102)基因信息采集步骤、103)建立定量标准步骤、104)高通量检测步骤、105)判定步骤；本发明提供了结合本身科研实践需求开发了基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，其成本节约、更加高效和精准化的监测有害藻华种。

说明书

技术领域

本发明涉及藻华种检测技术领域，更具体的说，它涉及基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法。

背景技术

由于工业的加速与全球一体化进程，自20世纪70年代之后，环境污染与气候变化，特别是营养盐、污染物的排放与海上船运量的激增所引起的船舶压舱水在世界范围的移动等因素都导致了有害藻华发生频度的增加、并向高纬度发展以及全世界范围的扩散。有害藻华在全球范围内呈现频繁化、长期化、有毒化与灾害化。我国海域中东海海域也深受有害藻华的问题，是我国沿海居民健康、水产经济受影响最严重的区域。东海原甲藻、海洋原甲藻、米氏凯轮藻、短凯轮藻、塔玛亚历山大藻、锥状施克里普藻、底刺膝沟藻、夜光藻、中肋骨条藻、尖刺拟菱形藻等是我国东海区域常见的有害藻华爆发原因种。其中，以东海原甲藻和米氏凯轮藻造成的藻华为主。2005年爆发于浙江沿海的米氏凯伦藻藻华，给渔民造成的经济损失高达19.7亿元。在中国东海海域有害藻华爆发频繁的原因种中，原甲藻属与鳍藻属等藻类能够产生腹泻性贝类毒素，且引发了中毒事件。但是，由于有害藻华原因种个体微小，低密度时通过显微镜镜检较难检测到或难以进行准确鉴定，而当达到可检测的浓度时，或已造成渔业灾害或中毒事件发生。而且近来科研人员发现尽管是同一藻种，也有产毒与不产毒之分。诸多通过荧光定量PCR(qPCR)与高通量测序方法对浮游植物种群及有害藻华原因种以及基因型研究结果表明，利用分子检测技术对浮游植物种群与有害藻华原因种进行检测具有快速、准确、灵敏度高的优点。然而，由于浮游植物特别是甲藻等，不同生物间甚至是不同株系分子遗传信息差别较大，基于不同地域，尤其是国外不同海区分离的目标藻株系所构建的分子快速检测技术，很难直接应用于我国有害藻华种的分子快速检测。

目前的形态观察鉴定法作为日常水环境监测的常规手段存在诸多缺陷及挑战：(1)有害藻华的发生通常是由一些海洋微藻暴发性增殖造成，在其发生早期，野外水体中有害藻华原因种的细胞浓度较低，一些常规的镜检手段对定性和定量检测较为困难；(2)有害藻华原因种趋于微小化，通过光学显微镜识别极其困难，时常只能鉴定到属，而要将其进一步精确鉴定到种，常需要进行电子显微镜观察。电子显微镜样品的制备过程繁锁，且样品制备技术要求较高，制备好的样品还不一定观察的到理想的细胞形态；(3)有些有害藻华原因种无细胞壁，在固定后发生皱缩，形态变化较大，有些细胞在加入固定剂后甚至直接破裂，严重影响有害藻华原因种种群的观察，并无法对其进行准确的丰度测定；(4)有害藻华原因种藻细胞形态多变，其表观形态特征可能易随生活环境和生长阶段发生变化，增加了不同海域自然水体中有害藻华种源的鉴定难度；(5)有害藻华原因种鉴定的经验依赖度高，初学者和普通人难以快速掌握鉴定技术并精准进行样品鉴定，而培养一个经验丰富可相对准确鉴定现场样品的技术人员，则需要数月甚至是数年的培训与历练；(6)形态鉴定法费时、费力，难以对大量样品进行快速、精确定量分析。因此通过形态学镜检分析水体样品而进行有害藻华监测所需要的人力和物力极大。在大规模监测中，想要对目标种进行快速定量检测是非常困难的，这也可以理解对有害藻华监控以及预测的难度之大。为此，鉴于传统的形态学鉴定和检测法在实际应用中的局限性，以及对有害藻华监测的需求，开发更加高效和精准化的监测方法是十分必要的。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，结合本身科研实践需求开发了基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，其成本节约、更加高效和精准化的监测有害藻华种。

本发明的技术方案如下：

基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，具体包括如下步骤：

101)筛选标准株系步骤：从相应海区采集目标有害藻华水样，用毛细管分离进行分离纯化并在控制条件下培养，对藻株进行形态学分析确认其形态分类学地位；其中通过从GenBank数据库检索、下载相应亲缘关系的物种信息，从分子进化分析角度以确定采集到的藻华水样的分类学地位；

102)基因信息采集步骤：扩增步骤101)采集到的藻华水样的rDNA序列，进行同源检索和比对分析，并利用其高变区和保守区来分别进行种特异性和通用引物的设计和筛选；

103)建立定量标准步骤：利用相应海区分离得到纯培养目标藻株进行基因组DNA的提取和定量分析，建立目标藻株细胞数量和核酸浓度的关系；用核酸进行qPCR，建立核酸浓度与Ct值的关系；并进一步绘制目标藻株细胞浓度与Ct值的标准曲线，求得定量回归曲线；从相应海区的有害藻华爆发海区采集现场水样，利用实验室优化的检测技术对其中的有害藻华藻进行qPCR定量分析，同时对样品中的目标有害藻华藻进行镜检计数，比较两种检测方法的差异性以及相关性，建立镜检计数和qPCR计数之间的回归关系，以此建立定量检测标准；

104)高通量检测步骤：通过对步骤102)中藻华水样的rDNA序列中的多个通用区段的比较测试，比对选择不同生物信息学数据库，选取可以得到目标藻的种类最多的靶基因的测序区段与生物信息学数据库，从而反映现场样品有害藻类类群与藻类的相对丰度；

105)判定步骤：利用步骤103)建立好的定量检测标准，拟合经步骤104)获得的高通量分析结果，从而实现高通量测序的可定量化。

进一步的，rDNA序列包括SSU rDNA、LSU rDNA和ITS区段。

进一步的，rDNA扩增测序得到序列后，进行blast检索，筛选出与其序列相似性在95％以上的序列，然后将序列下载后，通过序列分析软件对序列进行比对；保守区为序列98％以上全部相同。

进一步的，采用CTAB法提取有害藻华种的总基因组rDNA，用通用引物对SSU rDNA、LSU rDNA和ITS进行PCR扩增，对其测序后，将得到的序列用于针对于目标有害藻的特异性引物设计，通过qPCR进行验证以及筛选，得到效率最高专一性最强的引物序列；

将最强的引物序列用于目标有害藻华的扩增中，并比对所有的SSU rDNA、LSUrDNA和ITS序列，筛选出最高效的探针序列，即筛选能够扩增出目标藻而且Ct数值较低的引物。

进一步的，将blast检索出的所有序列进行比对分析，将高变区作为检测靶标区域，并设计通用引物用于高通量检测，以得到更多有害藻华种序列。

进一步的，还包括修正步骤，其包括建立定量标准步骤和高通量检测步骤；

建立定量标准步骤的修正是将采集的样品，一部用戊二醛或者鲁格试剂固定用于镜检，通过直接计数法得到各目标有害藻华藻的细胞浓度；一部分采用微孔滤膜过滤法收集藻细胞用于总rDNA的提取；用各个目标有害藻的特异性引物进行qPCR分析，获得的Ct值，用定量回归方程对各种有害藻华藻进行精确定量；同时比较qPCR定量与常规镜检的结果差异，以修正定量标准；

高通量检测是利用筛选的通用引物，对采集的样品进行高通量测序分析，得到各目标有害藻华的相对丰度，通过选取已用qPCR标定的某种或多种有害藻华原因种作为内参种，换算不同样品中多种目标有害藻华种在现场样品中的丰度，并对比采集的样品镜检结果，进行现场样品与高通量检测的结果差异，以修正高通量检测数据。

本发明相比现有技术优点在于：

本方案将相应海区自有浮游植物种群与有害藻华原因种藻株，筛选标准株系与内参基因，基于qPCR和高通量测序对相应沿海典型的有害藻华原因种进行检测、定量的快速检测技术。将传统显微镜分析与分子检测技术进行结合，通过对比和矫正数据，建立相应海区的典型有害藻华种分子定量检测与镜检定量检测的相关关系，优化由于不同物种间遗传信息差异所造成的定量差异。

本方案将对今后相应海区快速检测、监测有害藻华，维持海洋生态系统健康，保障渔业生产与食品安全，以及研究有害藻华预警和目标有害藻华生物的种群动态分析的调查研究等均提供重要科学数据。

本方案将选择常见的危害严重的有害藻华藻种为研究对象，包括其不同基因型，并为现行的形态鉴定法提供必要的补充，提高海区有害藻华藻种检测方法的灵敏性、高通量性和时效性。qPCR与高通量测序的理论检测极限可达0.1pgDNA，即便当1升现场水样品中仅有一个目标藻的情况，其也能被检测到；并且qPCR可同时获得多个样品的丰度信息；高通量测序可以同时获得多个目标藻的多样性与相对丰度数据。因此qPCR与高通量测序联动检测分析可以对大量样品进行高通量检测，实现多种有害藻华藻的并行定性和定量检测，更适于水环境的长期监测及有害藻华藻的种群动态监测、分析与研究。

附图说明

图1为本发明的有害藻华种分子快速检测开发流程图；

图2为本发明的有害藻华种分子快速检测应用流程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。

如图1至图2所示，基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，具体包括如下步骤：

101)筛选标准株系步骤：从相应海区采集目标有害藻华水样，用毛细管分离进行分离纯化并在控制条件下培养，对藻株进行形态学分析确认其形态分类学地位。其中通过从GenBank数据库检索、下载相应亲缘关系的物种信息，从分子进化分析角度以确定采集到的藻华水样的分类学地位。

102)基因信息采集步骤：扩增步骤101)采集到的藻华水样的rDNA序列，进行同源检索和比对分析，并利用其高变区和保守区来分别进行种特异性和通用引物的设计和筛选。其中，rDNA序列包括SSU rDNA、LSU rDNA和ITS区段。rDNA扩增测序得到序列后，进行blast检索，筛选出与其序列相似性在95％以上的序列，然后将序列下载后，通过序列分析软件(Sequencher 5.4.5等序列分析软件)对序列进行比对。保守区为序列98％以上全部相同。高变区就是序列相似度低的区域。

具体采用CTAB法提取有害藻华种的总基因组rDNA，用通用引物对SSU rDNA、LSUrDNA和ITS进行PCR扩增，对其测序后，将得到的序列用于针对于目标有害藻的特异性引物设计，通过qPCR进行验证以及筛选，得到效率最高专一性最强的引物序列。其中SSU rDNA、LSU rDNA为核糖体rRNA的编码基因，即分别为转录区的小亚基，大亚基；ITS为核糖体转录间隔区。不同的藻类，这三段的保守性不同，有些藻类是SSU rDNA保守性好，有的LSU rDNA保守性好，而有的则是ITS保守性好。

将最强的引物序列用于目标有害藻华的扩增中，并比对所有的SSU rDNA、LSUrDNA和ITS序列，筛选出最高效的探针序列，即筛选能够扩增出目标藻而且Ct数值较低的引物。

103)建立定量标准步骤：利用相应海区分离得到纯培养目标藻株进行基因组DNA的提取和定量分析，建立目标藻株细胞数量和核酸浓度的关系。用核酸进行qPCR，建立核酸浓度与Ct值的关系。并进一步绘制目标藻株细胞浓度与Ct值的标准曲线，求得定量回归曲线。从相应海区的有害藻华爆发海区采集现场水样，利用实验室优化的检测技术对其中的有害藻华藻进行qPCR定量分析，同时对样品中的目标有害藻华藻进行镜检计数，比较两种检测方法的差异性以及相关性，建立镜检计数和qPCR计数之间的回归关系，以此建立定量检测标准。具体通过显微镜直接计出细胞的数量；通过qPCR的方法，利用标准曲线，计算出细胞的数量；比对这两种方法建立细胞数量，以Ct为横轴，细胞数量为Y轴建立回归曲线即可。

104)高通量检测步骤：通过对步骤102)中藻华水样的rDNA序列中的多个通用区段的比较测试，比对选择不同生物信息学数据库，选取可以得到目标藻的种类最多的靶基因的测序区段与生物信息学数据库，从而反映现场样品有害藻类类群与藻类的相对丰度等。其中，可将blast检索出的所有序列进行比对分析，将高变区作为检测靶标区域，并设计通用引物用于高通量检测，以得到更多有害藻华种序列。

具体将步骤103)中得到的有害藻华种SSU rDNA序列进行BLAST同源检索，下载亲缘关系相近物种的基因序列，将所有序列进行比对分析，将高变序列作为检测靶标区域，设计通用引物用于高通量测序，以尽可能多且高效的得到更多有害藻华种序列。

105)判定步骤：利用步骤103)建立好的定量检测标准，拟合经步骤104)获得的高通量分析结果，从而实现高通量测序的可定量化。即利用已建立好的qPCR方法与定量分析结果，选取经测试标定的有害藻华藻作为内参，拟合高通量分析结果，从而实现高通量检测的可定量化。将相应海区样品显微镜观察群落分析、多个目标有害藻华藻qPCR分析结果与高通量检测方法的丰度结果回归关系分析，达到通过一次高通量测序分析与一次qPCR分析，可以实现对相应海区主要有害藻华藻进行快速准确的定量分析。即简单讲是通过高通量检测得到物种多样性信息，通过qPCR做出定量标准对其进行定量分析。

作为优选，还包括修正步骤，其包括建立定量标准步骤和高通量检测步骤。

建立定量标准步骤的修正是将采集的样品，一部用戊二醛或者鲁格试剂固定用于镜检，通过直接计数法得到各目标有害藻华藻的细胞浓度。一部分采用微孔滤膜过滤法收集藻细胞用于总rDNA的提取。用各个目标有害藻的特异性引物进行qPCR分析，获得的Ct值，用定量回归方程对各种有害藻华藻进行精确定量。同时比较qPCR定量与常规镜检的结果差异，以修正定量标准。

高通量检测是利用筛选的通用引物，对采集的样品进行高通量测序分析，得到各目标有害藻华的相对丰度，通过选取已用qPCR标定的某种或多种有害藻华原因种作为内参种，换算不同样品中多种目标有害藻华种在现场样品中的丰度，并对比采集的样品镜检结果，进行现场样品与高通量检测的结果差异，以修正高通量检测数据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明保护范围内。