一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组及其试剂盒

摘要

本发明具体涉及一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组及其试剂盒，属于体外核酸分子检测领域。本发明设计了新型冠状病毒的N基因、ORF1ab基因、E基因和人ACTB基因的引物、探针，可以同时检测新型冠状病毒的靶标基因以及人内参基因，实现新型冠状病毒的双重、三重甚至四重检测。本发明在42℃、20分钟内可完成扩增，能够有效避免实验过程出现的假阴性问题，反应结果既可以通过实时荧光检测的方式实现，又可结合侧向层析试纸条对检测结果进行肉眼判读。本发明检测时间短，特异性强，灵敏度高，重复性好，并通过人内参基因的检测实现样本采集、提取和扩增过程中的质量监控，有利于疫情的进一步管控，具有较好的实用价值。

说明书

技术领域

本发明属于体外核酸分子检测领域，具体为一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组及其试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)是2019年年底出现的一种新型病毒，其具有高度的传染性，在短期内迅速造成了世界范围内的广泛传播，现仍是全球面临的公共卫生紧急事件。更为糟糕的是，对于新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia,NCP)患者的治疗,目前的手段仍是对症治疗，没有合适的药物抑制病毒复制。且目前也没有适合各个年龄段人群接种的疫苗，现有疫苗也只适合于18-59岁的健康人，而老人、婴幼儿、高血压、糖尿病、白血病患者以及孕妇等众多群体均不在适合接种的范畴内，恰恰这些人群才是重点防护对象。因此，如何快速、准确的诊断SARS-CoV-2对于当前疫情的防控具有重要意义。

然而，针对SARS-CoV-2的检测，目前多采用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)。但是，该方法存在一些局限性，如扩增所需时间长(往往需要1.5-2小时，即便是快速PCR也需要1小时左右的扩增时间，通常来说，完成检测需要5-6个小时)且RT-PCR对扩增所需的模板纯度要求高，此外，对操作人员具有很高的要求。重要的是，RT-PCR技术需要精密且昂贵的核酸扩增仪。在资源匮乏地区，核酸扩增仪数量少甚至缺乏。一旦局部地区爆发疫情，RT-PCR很难达到大规模人群筛查，及时隔离感染者的要求。因此，在全球疫情仍未结束之际，RT-PCR技术不利于疫情再度爆发时大规模的检测，也不符合临床实验室要求的快速、准确发放报告的原则。综上，针对SARS-CoV-2的检测仍有必要开发出更加简单、快速的检测方法。重组酶聚合酶扩增技术是一种恒温扩增技术，可在37-42℃的条件下实现靶标基因的扩增，其扩增结果既可以通过实时荧光定量检测的方式实现，也可以结合侧向层析试纸条对检测结果进行肉眼判读，可满足不同场合的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组，本发明的目的之二在于提供一种用于检测新型冠状病毒的实时荧光法检测试剂盒，本发明的目的之三在于提供一种用于检测新型冠状病毒的侧向层析试纸条检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组，所述引物组包括用于扩增人ACTB基因的引物对和用于扩增新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因或E基因的引物对中的一种或多种；所述探针组包括用于扩增人ACTB基因的探针和用于检测新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、E基因的探针中的一种或多种；

所述用于扩增新型冠状病毒N基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；所述用于扩增新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述用于扩增新型冠状病毒E基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示；所述用于扩增人ACTB基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID NO:22所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；

所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:21；所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:16；所述用于检测新型冠状病毒E基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:45；所述用于检测人ACTB基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:30。

作为优选的技术方案之一，所述探针组中的探针有四个修饰位点：在距5’端约30个碱基处、距3’端约15个碱基处使用四氢呋喃及其类似物替代原有碱基，作为核酸外切酶的识别位点；四氢呋喃及其类似物上游的T碱基上标记一个荧光基团，下游的T碱基上标记一个荧光基团对应的淬灭基团，两个基团之间的间距为2-4nt；在3’末端标记阻断探针延伸的阻断基团。

作为优选的技术方案之一，所述荧光基团包括FAM、VIC、CY5或ROX。

作为优选的技术方案之一，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3。

作为优选的技术方案之一，所述阻断基团包括C3-Spacer、胺基、生物素-三甘醇或磷酸基。

作为优选的技术方案之一，所述引物组中N基因、ORF1ab基因、E基因或人ACTB基因的反向引物用抗原标签1标记，N基因、ORF1ab基因、E基因或人ACTB基因的正向引物分别用抗原标签2、3、4、5标记，所述抗原标签1与抗原标签2、3、4、5不相同。

作为优选的技术方案之一，所述抗原标签1包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。

作为优选的技术方案之一，所述抗原标签2包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。

作为优选的技术方案之一，所述抗原标签3包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。

作为优选的技术方案之一，所述抗原标签4包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。

作为优选的技术方案之一，所述抗原标签5包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。

2、一种用于检测新型冠状病毒的实时荧光法检测试剂盒，所述试剂盒包括溶解缓冲液、冻干酶粉、醋酸镁溶液、所述的引物组和探针组；所述溶解缓冲液包括30-50mM Tris缓冲液、50-150mM醋酸钾；所述冻干酶粉包括100-500ng/μL重组酶、100-400ng/μL重组酶辅因子、400-900ng/μL单链DNA结合蛋白、50-200ng/μL DNA聚合酶、100-500ng/μL核酸外切酶、50-100ng/μL逆转录酶、1-3mM ATP、30-100mM磷酸肌酸、200-300ng/μL肌酸激酶、200-500μM dNTPs、5％-10％w/v聚乙二醇20000、1-5mM二硫苏糖醇。

作为优选的技术方案之一，所述试剂盒的使用方法为：

1)配置反应体系：29.4μL溶解缓冲液，所述引物组中各基因正向引物、反向引物的终浓度均为200-600nM；所述探针组中各探针的终浓度均为60-180nM，共50μL；

2)将配置好的反应体系加入冻干酶粉中，混匀，加入2.5μL 28mM醋酸镁溶液于管盖中，离心，实时荧光PCR扩增42℃反应20分钟。

3、一种用于检测新型冠状病毒的侧向层析试纸条检测试剂盒，所述试剂盒包括溶解缓冲液、冻干酶粉、醋酸镁溶液、扩增产物稀释液、侧向层析试纸条、羊抗鼠单克隆抗体、抗人ACTB基因抗原标签的单克隆抗体、抗1个或多个所述SARS-CoV-2靶基因抗原标签的单克隆抗体、所述的引物组和探针组；所述溶解缓冲液包括30-50mM Tris缓冲液、50-150mM醋酸钾；所述冻干酶粉包括100-500ng/μL重组酶、100-400ng/μL重组酶辅因子、400-900ng/μL单链DNA结合蛋白、50-200ng/μL DNA聚合酶、50-100ng/μL逆转录酶、1-3mM ATP、30-100mM磷酸肌酸、200-300ng/μL肌酸激酶、200-500μM dNTPs、5％-10％w/v聚乙二醇20000、1-5mM二硫苏糖醇。

作为优选的技术方案之一，扩增产物稀释液无酶水或Tris缓冲液。

作为优选的技术方案之一，所述试剂盒的使用方法为：

1)配置反应体系，29.4μL溶解缓冲液，所述的引物组和探针组，所述引物组中各基因正向引物、反向引物的终浓度均为200-600nM；所述探针组中各探针的终浓度均为60-180nM，共50μL；

2)将配置好的反应体系加入冻干酶粉中，混匀，加入2.5μL 28mM醋酸镁溶液于管盖中，离心，恒温保持42℃反应20分钟；

3)在侧向层析试纸条上标记羊抗鼠的单克隆抗体、待测人ACTB基因抗原标签的单克隆抗体和1个或多个SARS-CoV-2靶基因抗原标签的单克隆抗体；

4)取10μL扩增产物，加入190μL扩增产物稀释液并混匀，在其中垂直插入侧向层析试纸条，5分钟之后观察结果。

本发明的有益效果在于：

现有的检测SARS-CoV-2的方法除RT-PCR外，恒温扩增方面的报道也相应增加，但现有的恒温扩增检测技术大多只是针对SARS-CoV-2的单管单靶标检测，缺少相应的内参基因指示样本采集过程以及样本提取过程的有效性，这不利于检测结果的解释，难以避免实验操作带来的假阴性结果。在遵循快速检测SARS-CoV-2原则的基础上，本发明建立了一种检测SARS-CoV-2的多重重组酶聚合酶扩增技术，用来同时检测SARS-CoV-2的靶标基因和人ACTB基因。根据重组酶聚合酶扩增技术的引物、探针设计原则，分别设计了相应的引物、探针序列并对多重反应体系进行优化得到最优的靶标基因扩增情况，重点解决了监控临床采样有效性的问题，建立多重实时荧光重组酶聚合酶扩增技术。结果显示建立的反应体系灵敏度佳、特异性强，除阳性假病毒和SARS-CoV-2临床模拟样本核酸有明显扩增外，其它呼吸道病毒及细菌和人类冠状病毒及阴性质控品均无荧光值增加。在42℃反应条件下，完成扩增反应只需20分钟，且操作过程简单、应用范围广，能广泛适用于多种荧光检测设备，也可以通过结合侧向层析试纸条的方式对检测结果进行肉眼判读。本发明所需的检测时间短，特异性强，重复性好，能通过对人内参基因的检测结果对样本提取和扩增过程进行质量监控，具有较好的实用价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为实时荧光重组酶聚合酶扩增技术的SARS-CoV-2基因引物筛选结果图；

图2为实时荧光重组酶聚合酶扩增技术反应特异性测试结果图；

图3为实时荧光双重重组酶聚合酶扩增技术反应体系检测结果图；

图4为实时荧光三重重组酶聚合酶扩增技术反应体系检测结果图；

图5为实时荧光四重重组酶聚合酶扩增技术反应体系检测结果图；

图6为重组酶聚合酶扩增技术结合侧向层析试纸条双重检测SARS-CoV-2结果图；

图7为重组酶聚合酶扩增技术结合侧向层析试纸条三重检测SARS-CoV-2结果图；

图8为重组酶聚合酶扩增技术结合侧向层析试纸条四重检测SARS-CoV-2结果图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。通过实施例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。

实施例1

用于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术的SARS-CoV-2特异性引物、探针的设计和筛选

(1)SARS-CoV-2特异性引物、探针的设计

根据CDC和WHO公布的SARS-CoV-2核酸序列，针对SARS-CoV-2的N基因、ORF1ab基因、E基因和人ACTB基因进行序列比对，在保守区域设计多条相应的特异性引物、探针，候选引物、探针序列如表1所示。

重组酶聚合酶扩增技术引物设计要求：总体原则与PCR相似，如GC含量不能超过70％或小于30％，引物之间避免形成引物二聚体等。使用的exo探针设计要求：不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；exo探针共有四个修饰位点：1.距离5’端30-35nt的位置使用四氢呋喃替代原有碱基，作为核酸外切酶的识别位点；2.四氢呋喃位点上游的T碱基上标记一个荧光基团(如本发明实施例中使用的FAM、VIC、ROX)，下游的T碱基上标记一个淬灭基团(如本发明实施例中使用的BHQ1)，两个基团之间的间距为2-4nt；3.在3’末端标记阻断探针延伸的阻断基团(如本发明实施例中使用的C3-Spacer)。

表1 N基因、ORF1ab基因、E基因和人ACTB基因的候选引物、探针序列

(2)SARS-CoV-2特异性引物、探针的筛选

反应体系：400nM N基因/ORF1ab基因/E基因/人ACTB基因的正向、反向引物，29.4μL溶解缓冲液(40mM Tris缓冲液、100mM醋酸钾)、120nM N基因/ORF1ab基因/E基因/人ACTB基因的探针，2μLSARS-CoV-2假病毒提取样本，无酶水补足至50μL。将上述配好的反应体系加入到冻干酶粉(500ng/μL重组酶、300ng/μL重组酶辅因子、400ng/μL单链DNA结合蛋白、100ng/μL DNA聚合酶、150ng/μL核酸外切酶、100ng/μL逆转录酶、3mM ATP、50mM磷酸肌酸、300ng/μL肌酸激酶、500μM dNTPs、5.5％w/v聚乙二醇20000、2mM二硫苏糖醇)中，充分溶解混匀，加入2.5μL 280mM醋酸镁于管盖中，离心后转至实时荧光定量PCR仪(Bio-rad，美国，CFX96)进行扩增，42℃运行20分钟。

结果如图1所示，在相同反应条件下，不同引物组合扩增均有效，但扩增效果有所差异，综合反应阈值时间和相对荧光强度这两个指标,取阳性阈值时间较早、相对荧光单位较高，且曲线为一典型的S型曲线的引物组为最佳引物组,因此，N基因最佳引物组为R1F1、ORF1ab基因的最佳引物组为R4F7、E基因最佳引物组为R4F6、人ACTB基因的最佳引物组为R1F1，各基因的最佳引物组、探针如表2所示。

表2各基因的最佳引物对、探针

(3)实时荧光重组酶聚合酶扩增技术反应特异性测试

用上述筛选的N基因、ORF1ab基因、E基因最佳引物组及各基因组探针检测其他病原体，包括人冠状病毒(OC43、HKU1、229E、NL63、SARS),中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV),甲型流感病毒(Flu A),乙型流感病毒(Flu B),人副流感病毒(HPIV),呼吸道合胞病毒(RSV),人巨细胞病毒(HMPV),铜绿假单胞菌(Pae),肺炎克雷伯菌(Kpn),金黄色葡萄球菌(Sau),鲍曼不动杆菌(Aba)。

按照上述反应体系、与反应条件进行实时荧光PCR，结果如图2所示，除阳性假病毒和SARS-CoV-2临床模拟样本核酸有明显扩增外，其它呼吸道病毒及细菌和人类冠状病毒及阴性质控品均无荧光值增加，本发明方法可特异性检测SARS-CoV-2,与其他病原体之间没有交叉反应。

实施例2

实时荧光多重重组酶聚合酶扩增技术检测SARS-CoV-2

(1)实时荧光双重重组酶聚合酶扩增技术

按照实施例1中筛选出的N基因、ORF1ab基因、E基因、人ACTB基因最佳引物组及各基因组探针，将N基因、ORF1ab基因和E基因分别与人ACTB基因组合，进行实时荧光检测，其中N基因的探针使用FAM荧光基团标记，ACTB基因探针使用ROX荧光基团标记，合成的假病毒作为反应体系的阳性样本。

反应体系共计50μL：29.4μL溶解缓冲液(40mM Tris缓冲液、100mM醋酸钾)、600nM正向、反向N基因/ORF1ab基因/E基因引物、180nM N基因/ORF1ab基因/E基因探针、200nMACTB基因正向、反向引物、60nM ACTB探针、2μL SARS-CoV-2假病毒提取样本、10

结果如图3所示，在反应开始后约7分钟，N基因出现了荧光值的增加，在第8分钟左右ACTB基因荧光值增加，在扩增反应后的10分钟内均可得到典型的扩增曲线，证明反应体系构建成功。

(2)实时荧光三重重组酶聚合酶扩增技术

按照实施例1中筛选出的N基因、ORF1ab基因、E基因、人ACTB基因最佳引物组及各基因组探针，构建三组三重反应体系：N基因、ORF1ab基因和ACTB基因；N基因、E基因和ACTB基因；E基因、ORF1ab基因和ACTB基因。其中N基因、ORF1ab基因的靶探针分别使用FAM、VIC荧光基团标记，ACTB基因使用ROX荧光基团标记，合成的假病毒作为反应体系的阳性样本。

反应体系共计50μL：29.4μL溶解缓冲液(40mM Tris缓冲液、100mM醋酸钾)、500nMN基因正向、反向引物、180nM N基因探针、200nM ACTB基因正向、反向引物、180nM ACTB探针、300nM ORF1ab基因正向、反向引物、180nM ORF1ab基因探针、2μL SARS-CoV-2假病毒提取样本、10

结果如图4所示，在反应开始后约6分钟N基因和ORF1ab基因均出现了荧光值的增加，在接近10分钟时，ACTB基因荧光值增加，证明反应体系构建成功。

(3)实时荧光四重重组酶聚合酶扩增技术

按照实施例1中筛选出的N基因、ORF1ab基因、E基因、人ACTB基因最佳引物组及各基因组探针，构建四重反应体系：N基因、ORF1ab基因、E基因、人ACTB基因。其中N基因、ORF1ab基因、E基因的靶探针分别使用FAM、VIC、CY5荧光报告基团标记，ACTB基因使用ROX荧光报告基团标记，合成的假病毒作为反应体系的阳性样本。

反应体系共计50μL：29.4μL溶解缓冲液(40mM Tris缓冲液、100mM醋酸钾)、400nMN基因正向、反向引物、200nM ACTB基因正向、反向引物、120nM ACTB探针、400nM ORF1ab基因正向、反向引物、120nM ORF1ab基因探针、400nM E基因正向、反向引物、120nM E基因探针、2μL SARS-CoV-2假病毒提取样本、10

结果如图5所示，在反应开始后约10分钟N基因、ORF1ab基因、E基因、ACTB基因均出现了荧光值的增加，证明反应体系构建成功。

实施例3

重组酶聚合酶扩增技术结合侧向层析试纸条多重检测SARS-CoV-2

针对实施例1确定的最佳SARS-CoV-2靶基因引物及探针进行修饰，在ACTB基因、N基因、ORF1ab基因和E基因的反向引物5’端均标记地高辛抗原标签，正向引物5’端分别标记TAMRA、生物素、CY5、FAM抗原标签。在侧向层析试纸条上标记羊抗鼠的单克隆抗体作为质控线，标记待测抗人ACTB基因抗原标签的单克隆抗体(金标记的抗TAMRA抗体)和1个或多个抗SARS-CoV-2靶基因(N基因、ORF1ab基因、E基因)抗原标签的单克隆抗体，分别为金标记的抗生物素抗体、金标记的抗CY5抗体、金标记的抗FAM抗体。涉及的引物对序列如表3所示。

表3各基因的最佳引物对

(1)双重检测

反应体系共计50μL：29.4μL溶解缓冲液(40mM Tris缓冲液、100mM醋酸钾)、600nMN基因正向、反向引物、200nM ACTB基因正向、反向引物、2μL SARS-CoV-2假病毒提取样本，10

结果如图6所示，试纸条质控线处呈现清晰的条带保证了检测结果的准确性，ACTB基因、N基因检测线处均呈现清晰的条带，证明含地高辛和TAMRA双抗原标记的扩增产物、含地高辛和生物素双抗原标记的扩增产物分别与侧向层析试纸条上金标记的抗TAMRA抗体、金标记的抗生物素抗体发生了结合。

采用上述方法建立E基因和ACTB基因，ORF1ab基因和ACTB基因双重反应体系，结果表明试纸条质控线、内参基因检测线、SARS-CoV-2靶标基因检测线处均呈清晰条带。

(2)三重检测

建立三重反应体系，反应体系共计50μL，体系包括：29.4μL溶解缓冲液(40mM Tris缓冲液、100mM醋酸钾)、500nM N基因正向、反向引物、200nM ACTB基因正向、反向引物、300nM ORF1ab基因正向、反向引物、2μL SARS-CoV-2假病毒提取样本、10

结果如图7所示，试纸条质控线处呈现清晰的条带保证了结果的准确性，ACTB基因、SARS-CoV-2 N基因、ORF1ab基因检测线处均呈现清晰的条带，证明含地高辛和TAMRA双抗原标记的扩增产物、含地高辛和生物素双抗原标记的扩增产物、含地高辛和CY5双抗原标记的扩增产物分别与侧向层析试纸条上金标记的抗TAMRA抗体、抗生物素抗体、抗CY5抗体发生了结合。

采用上述方法建立N基因、E基因和ACTB基因，ORF1ab基因、E基因和ACTB基因三重反应体系，结果表明试纸条质控线、内参基因检测线、SARS-CoV-2靶标基因检测线处均呈清晰条带。

(3)四重检测

建立四重反应体系，反应体系共计50μL：包括29.4μL溶解缓冲液(40mM Tris缓冲液、100mM醋酸钾)、400nM N基因正向、反向引物、200nM ACTB基因正向、反向引物、400nMORF1ab基因正向、反向引物、400nM E基因正向、反向引物、2μl SARS-CoV-2假病毒提取样本、10

结果如图8所示，试纸条质控线处呈现清晰的条带保证了结果的准确性，ACTB基因、SARS-CoV-2 N基因、ORF1ab基因、E基因检测线处均呈现清晰的条带，证明含地高辛和TAMRA双抗原标记的扩增产物、含地高辛和生物素双抗原标记的扩增产物、含地高辛和CY5双抗原标记的扩增产物以及含地高辛和FAM双抗原标记的扩增产物分别与侧向层析试纸条上金标记的抗TAMRA抗体、抗生物素抗体、抗CY5抗体以及抗FAM抗体发生了结合。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军特色医学中心

<120> 一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组及其试剂盒

<160> 45

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 1

gtgctaatga ccctgtgggt tttacactta a 31

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

cttaaaaggt aagtatgtac aaatacctac 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 3

cttgtgctaa tgaccctgtg ggttttacac ttaa 34

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

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cctacaactt gtgctaatga ccctgtgggt tttac 35

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<213> 人工序列(Artificial sequence )

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tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt 30

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<212> DNA

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cttgtgctaa tgaccctgtg ggttttacac tt 32

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cctacaactt gtgctaatga ccctgtgggt tttacactt 39

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catcagtact agtgcctgtg ccgcacggtg 30

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caccgcaaac ccgtttaaaa acgattgtgc 30

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ccgcaaaccc gtttaaaaac gattgtgcat 30

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agctgactga agcatgggtt cgcggagttg 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 17

cagcagtagg ggaacttctc ctgctagaat 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 18

tcgcaacagt tcaagaaatt caactccagg 30

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 19

ggcctttacc agacattttg ctctcaagct g 31

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 20

ttcttagtga cagtttggcc ttgttgttgt tg 32

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 21

ctggcaatgg cggtgatgct gctcttgctt ggctgcttga cagattg 47

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 22

ctccatcctg gcctcgctgt ccaccttcca g 31

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 23

ccaccttcca gcagatgtgg atcagcaagc a 31

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 24

caagcaggag tatgacgagt ccggcccctc c 31

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 25

tatgacgagt ccggcccctc catcgtccac c 31

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 26

aatctcatct tgttttctgc gcaagttagg 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 27

aacaaataaa gccatgccaa tctcatcttg 30

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 28

tccagttttt aaatcctgag tcaagccaaa 30

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 29

gctgtcacct tcaccgttcc agttttt 27

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 30

gtcaagaaag ggtgtaacgc aactaagtca gccgcctaga agcat 45

<210> 31

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 31

ctagttacac tagccatcct tactgcgctt cg 32

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 32

cactagccat ccttactgcg cttcgattgt gtgcg 35

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 33

ccttactgcg cttcgattgt gtgcgtactg c 31

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 34

ccatccttac tgcgcttcga ttgtgtgcgt actgc 35

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 35

ccttactgcg cttcgattgt gtgcgtactg 30

<210> 36

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 36

ccatccttac tgcgcttcga ttgtgtgcgt actg 34

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 37

ccagaagatc aggaactcta gaagaattca gatt 34

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 38

ccagaagatc aggaactcta gaagaattca gattt 35

<210> 39

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 39

gaccagaaga tcaggaactc tagaagaatt cagatt 36

<210> 40

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 40

gaccagaaga tcaggaactc tagaagaatt cagattt 37

<210> 41

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 41

agaccagaag atcaggaact ctagaagaat tcag 34

<210> 42

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 42

cgtttagacc agaagatcag gaactctaga agaattc 37

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 43

gttcgtttag accagaagat caggaactct agaag 35

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 44

tatttagttc gtttagacca gaagatcagg aactc 35

<210> 45

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 45

gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac ctttttacgt ttactctcgt g 51