一种检测试剂及定量测定过氧化氢的方法

摘要

一种检测试剂以及定量测定过氧化氢的方法，其检测快速、灵敏、成本低且操作简便。利用铜离子(II)过氧化物酶的活性，催化过氧化氢氧化3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺(TMB)生成氧化态TMB(即oxTMB)，使溶液颜色由无色变为蓝色；变蓝的程度与过氧化氢的浓度成正比，从而构建线性关系，确定过氧化氢的含量。所述方法具有简便、易准备、水溶性好、稳定性好和成本低等优点，可建立一种简便、快速、成本低廉的检测食品中过氧化氢的方法，在食品分析领域具有潜在的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种检测试剂及定量测定过氧化氢的方法。

背景技术

过氧化氢(Hydrogen peroxide，H

目前过氧化氢的检测方法主要有滴定法、色谱法、化学发光法、电化学分析法、荧光光度法、紫外分光光度法等。其中，紫外分光光度法具有操作简单、快速、准确度高、选择性好、分析成本低等优点。但也存在天然酶易失活、纳米材料合成复杂、检测范围窄等不足。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种定量测定过氧化氢的方法，其检测快速、灵敏、成本低且操作简便。利用铜离子(II)过氧化物酶的活性，催化过氧化氢氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)生成氧化态TMB(即oxTMB)，使溶液颜色由无色变为蓝色；具体的，加入不同浓度的过氧化氢，溶液颜色的变化也会不同，即过氧化氢在溶液中的浓度越大，颜色变蓝的程度越大，变蓝的程度与过氧化氢的浓度成正比，构建线性关系，从而确定过氧化氢的含量。

本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种用于测定过氧化氢的检测试剂，其由铜离子(II)溶液、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液(即TMB溶液)和缓冲溶液配制而成。

第二方面，本发明提供一种用于测定过氧化氢的检测试剂的制备方法，取铜离子(II)溶液置于具塞试管中，加入TMB溶液，随后用缓冲溶液定容后摇匀。

第三方面，本发明提供一种采用所述检测试剂测定过氧化氢的用途。具体的，提供一种利用铜离子(II)的过氧化物酶活性测定过氧化氢的用途。

优选的，利用铜离子(II)的过氧化物酶的活性，催化过氧化氢氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)，使溶液颜色由无色变为蓝色，变蓝的程度与过氧化氢的浓度成正比，从而构建线性关系，确定过氧化氢的含量。

第四方面，本发明提供一种定量测定过氧化氢的方法，所述方法利用铜离子(II)的过氧化物酶活性来定量测定过氧化氢。

第五方面，本发明提供一种定量测定过氧化氢的方法，包括以下步骤：

(1)分别配制铜离子(II)溶液和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液，将两者混合均匀，再加入缓冲溶液定容后得检测试剂，测定在652nm处的紫外吸光度值A

(2)向上述检测试剂中加入过氧化氢溶液，测定在652nm处的紫外吸光度值A；

(3)计算ΔA＝A-A

第六方面，本发明提供一种定量测定过氧化氢的方法，包括以下步骤：

a)配制不同浓度的过氧化氢标准溶液；

b)配制缓冲溶液、铜离子(II)溶液、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液(即TMB溶液)；

c)配制检测试剂：取所述铜离子(II)溶液置于具塞试管中，加入TMB溶液，随后用缓冲溶液定容，摇匀后测定试剂在652nm处的紫外吸收强度值；

d)依次加入不同浓度的过氧化氢标准溶液，静置反应，将反应后的溶液倒入石英比色皿中，进行紫外分光光度计测试，采集紫外光谱，以紫外光谱中652nm处的紫外吸收强度变化值对过氧化氢的浓度建立定量分析的标准曲线，拟合得到线性方程；

e)配制待测样品溶液；

f)在检测试剂中，加入待测样品溶液，充分反应后，采集紫外光谱，读取652nm处的紫外吸收强度值，带入到线性方程，计算待测样品中过氧化氢的浓度数值，从而实现对待测样品中过氧化氢的定量检测。

优选的，所述铜离子(II)溶液为醋酸铜溶液。优选的，备用铜离子(II)溶液配制方法为：称量2.0g的醋酸铜置于烧杯中，加入去离子水使其完全溶解，将醋酸铜溶液转入100mL容量瓶，用去离子水定容，得到0.1M醋酸铜溶液。优选的，检测试剂中铜离子(II)浓度为8.0-16.0mM。更优选的，其浓度为8.0mM。

优选的，所述过氧化氢溶液的配制方法为：取30％的过氧化氢水溶液1.02mL，加入100mL棕色容量瓶中，用去离子水定容，即得0.1M过氧化氢溶液；分别稀释配制不同浓度的过氧化氢标准溶液：0μM，0.8μM，2.0μM，4.0μM，8.0μM，16.0μM，24.0μM，40.0μM，60.0μM，80.0μM。

优选的，所述3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液(即TMB溶液)的配制方法为：称量0.12g的TMB粉末置于烧杯中，加入40mL乙醇和1mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌使其完全溶解后转入100mL棕色容量瓶，加去离子水定容，得到5mM TMB溶液。优选的，检测试剂中TMB浓度为0.6-1.0mM。优选的，其浓度为0.6mM。

优选的，所述缓冲溶液的pH值分别为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0。优选的，所述缓冲溶液的pH为3.0。优选的，所述缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液。优选的，所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的配制方法为：称量醋酸钠(CH

优选的，取浓度为0.1M的铜离子(II)溶液200-400μL于5mL具塞试管中，加入浓度为5.0mMTMB溶液300-500μL，随后用缓冲溶液定容至2.5mL，摇匀。优选的，取0.1M铜离子(II)溶液200μL于5mL具塞试管中，加入5.0mMTMB溶液300μL。

优选的，配制待测样品溶液时，所述待测样品为银耳。优选的，将银耳粉碎，溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，超声震荡20分钟，经过离心和滤膜过滤，除去不溶物，向样品溶液中分别添加不同浓度的过氧化氢，定容，得到处理后过氧化氢的待测样品溶液。优选的，银耳质量为5.0g；缓冲溶液体积为5.0mL；待测样品溶液浓度是0.20g/mL；滤膜为0.45μM孔径滤膜；向处理好的1.0mL样品溶液中分别加入10μM、20μM、30μM的过氧化氢；定容至2.5mL，得到处理后的添加10μM、20μM、30μM过氧化氢的待测样品溶液。所述银耳样品购买于当地超市。

优选的，根据紫外吸收变化值与过氧化氢浓度的线性关系图，线性方程为ΔA＝A-A

优选的，检测过氧化氢的范围0.8-80μM，检测限为0.148μM。

优选的，在上述检测试剂中，分别加入处理后过氧化氢的待测样品溶液各250μL，20分钟后测量，采集紫外光谱，读取652nm处的紫外吸收强度值，带入到线性方程，计算待测样品中过氧化氢的浓度数值。优选的，向样品溶液中分别加入10μM、20μM、40μM过氧化氢后定容，得到处理后的添加10μM、20μM、40μM过氧化氢的待测样品溶液。优选的，每个样品重复测样3次，求平均值，从而得到更加精确的浓度数值。

本发明具有的优势在于：

所述测定过氧化氢的方法，不需要纳米粒子的制备及表面修饰，没有复杂的有机合成。所述铜离子(II)溶液，相对于天然酶和纳米材料，不仅具有高灵敏的特性，检测限为0.148μM，而且具有简便、易准备、水溶性好、稳定性好和成本低等优点。与传统显色剂邻联甲苯胺(DMB)相比，TMB具有灵敏度高，显色稳定，准确性好等优点，而且使用安全。该检测方法具有良好的选择性。可建立一种简便、快速、低廉的检测食品中过氧化氢的方法，在食品分析领域具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明检测过氧化氢的原理示意图。

图2为加入不同浓度的过氧化氢在652nm处的紫外吸收光谱图，a-j为过氧化氢溶液浓度分别为0μM、0.8μM，2.0μM，4.0μM，8.0μM，16.0μM，24.0μM，40.0μM，60.0μM，80.0μM的紫外可见吸收光谱。

图3为铜离子(II)模拟酶比色法检测过氧化氢标准曲线图。

图4为可行性试验的紫外可见光谱图，其中a为TMB-H

图5为反应体系pH对铜离子(II)过氧化物模拟酶的活性影响图。

图6为检测试剂中TMB浓度对铜离子(II)过氧化物模拟酶的活性影响图。

图7为检测试剂中铜离子(Ⅱ)浓度对铜离子(II)过氧化物模拟酶的活性影响图。

图8为反应体系温度对铜离子(II)过氧化物模拟酶的活性影响图。

图9为反应时间对铜离子(II)过氧化物模拟酶的活性影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步描述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件。

下列实施例中试剂来源为：醋酸钠(CH

实施例1

一种定量测定过氧化氢的方法，包括以下步骤：

a)配制不同浓度的过氧化氢标准溶液：取30％的过氧化氢水溶液1.02mL，加入100mL棕色容量瓶中，用去离子水定容，即得0.1M过氧化氢溶液；然后取0.1M过氧化氢溶液100μL于100mL棕色容量瓶，用去离子水定容，得到100μM过氧化氢溶液；分别稀释配制不同浓度的过氧化氢标准溶液：0μM，0.8μM，2.0μM，4.0μM，8.0μM，16.0μM，24.0μM，40.0μM，60.0μM，80.0μM。

b)配制醋酸-醋酸钠缓冲溶液、铜离子(II)溶液、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液(即TMB溶液)；具体的：

1)醋酸-醋酸钠缓冲溶液的配制：称量醋酸钠(CH

2)铜离子(II)溶液的配制：称量2.0g的醋酸铜置于烧杯中，加入去离子水使其完全溶解，将醋酸铜溶液转入100mL容量瓶，用去离子水定容，得到0.1M醋酸铜溶液。

3)显色底物TMB溶液的制备：称量0.12g的TMB粉末置于烧杯中，加入40mL乙醇和1.0mL二甲基甲酰胺，磁力搅拌使其完全溶解后转入100mL棕色容量瓶，加去离子水定容，得到5mM TMB溶液。

c)配制检测试剂：先取200μL步骤2)中的0.1M醋酸铜溶液于5mL具塞试管中，再加入步骤3)中5.0mMTMB溶液300μL，然后用步骤1)醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝3.0)定容至2.5mL，摇匀，此时溶液为无色；测定在652nm处的紫外吸光度值A

d)绘制标准曲线：在上述检测试剂中依次加入0μM，0.8μM，2.0μM，4.0μM，8.0μM，16.0μM，24.0μM，40.0μM，60.0μM，80.0μM的过氧化氢标准溶液各250μL，此时溶液由无色变为蓝色。如图1所示，利用铜离子(II)过氧化物酶的活性，催化过氧化氢氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)生成氧化态TMB(oxTMB)，使溶液由无色变蓝色。静置20分钟后测量。将反应后的溶液倒入石英比色皿中，进行紫外分光光度计测试，采集紫外光谱(如图2所示)，以紫外光谱中652nm处的紫外吸收强度变化值ΔA(A-A

e)配制待测样品溶液：称取样品，粉碎后溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，超声震荡20分钟，经过离心和滤膜过滤，除去不溶物，向样品溶液中分别添加不同浓度的过氧化氢，定容，得到处理后过氧化氢的待测样品溶液。

f)在检测试剂中，加入待测样品溶液，充分反应后，采集紫外光谱，读取652nm处的紫外吸收强度值，带入到线性方程，计算待测样品中过氧化氢的浓度数值，从而实现对待测样品中过氧化氢的定量检测。

实施例2——可行性实验

根据实施例1，采用比色法对体系进行可行性实验，如图4所示，a为在5mL具塞试管中，加入5.0mMTMB溶液300μL和100μMH

实施例3——检测条件优化

体系最佳pH值选择：在5mL的带塞试管中，分别加入0.1M醋酸铜溶液200μL、5mMTMB溶液300μL和100μM H

检测试剂中3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)的最佳浓度选择：在5mL的带塞试管中，分别加入0.1M醋酸铜溶液200μL、100μM H

检测试剂中铜离子(Ⅱ)浓度选择：在5ml的带塞试管中，分别加入一定浓度的醋酸铜、100μM H

体系温度的选择：在5ml的带塞试管中，分别加入0.1M醋酸铜溶液200μL、100μMH

体系反应时间的选择：如图9所示，a为在5mL具塞试管中，加入5.0mMTMB溶液300μL和100μMH

实施例4——实际样品检测

配制待测样品溶液：待测样品为银耳，银耳样品购买于当地超市，称取银耳5.0g，将银耳粉碎，溶于5.0mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，超声震荡20分钟，经过离心和0.45μM孔径滤膜过滤，除去不溶物。向处理好的1.0mL样品溶液中分别加入10μM、20μM、40μM的过氧化氢溶液，定容至2.5mL，得到处理后的添加三种浓度过氧化氢的待测样品溶液。

对银耳中的过氧化氢进行检测分析。在3支5mL具塞试管中，先分别加入0.1M醋酸铜溶液200μL，然后分别加入浓度5mM TMB溶液250μL，再用pH＝3.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容2.5mL，摇匀。最后依次分别加入上述处理后的添加三种浓度过氧化氢的待测样品溶液250μL，置于40℃水浴锅中，20分钟后测量。采集紫外光谱，读取652nm处的紫外吸光强度值，带入到实施例1中得到的线性方程，每个样品重复测样3次，求平均值，计算得到银耳中过氧化氢的含量为12.24μg/g)(如表1)。

通过加标实验得到样品的加标回收率在97.10-102.22％之间，相对标准偏差(RSD)小于5％(请核实数据准确性)，说明该检测方法准确度高，具有良好的选择性。同时，所述检测试剂以及定量测定过氧化氢的方法，不需要纳米粒子的制备及表面修饰，没有复杂的有机合成。本发明的检测方法在实际样品分析中具有潜在的应用价值。

表1银耳中过氧化氢的测定结果

上述内容虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。