盐酸环丙沙星原料或片剂中有关物质的分析检测方法

摘要

本发明涉及一种盐酸环丙沙星原料或片剂中有关物质的分析检测方法，该方法具有高效性、灵敏性、专属性和准确性的特点，能够有效用于盐酸环丙沙星原料或片剂的有关物质分析检测和药品质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体地，本发明涉及盐酸环丙沙星原料或片剂中有关物质的分析检测方法。

背景技术

环丙沙星为合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，具广谱抗菌活性，杀菌效果好，几乎对所有细菌的抗菌活性均较诺氟沙星及依诺沙星强2～4倍，对肠杆菌、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌、淋球菌、链球菌、军团菌、金黄色葡萄球菌具有抗菌作用。

盐酸环丙沙星片在临床上用于敏感菌引起的：1.泌尿生殖系统感染，包括单纯性、复杂性尿路感染、细菌性前列腺炎、淋病奈瑟菌尿道炎或宫颈炎(包括产酶株所致者)。2.呼吸道感染，包括敏感革兰阴性杆菌所致支气管感染急性发作及肺部感染。3.胃肠道感染，由志贺菌属、沙门菌属、产肠毒素大肠埃希菌、亲水气单胞菌、副溶血弧菌等所致。4.伤寒。5.骨和关节感染。6.皮肤软组织感染。7.败血症等全身感染。

盐酸环丙沙星原料药质量标准在《中国药典》2015年版二部、EP9.0、BP2018、USP41、JP17中均有收载有关物质检查项。盐酸环丙沙星片质量标准在《中国药典》2015年版二部、USP41、BP2018中均有收载，均采用液相色谱法测定有关物质。

然而，盐酸环丙沙星原料或片剂中有关物质的分析方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

参考各国盐酸环丙沙星的药典标准，确定潜在的已知杂质主要有：杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I。各杂质信息见下表1所述。

表1：盐酸环丙沙星杂质信息列表

通过对比各国药典标准均采用C18柱，结合盐酸环丙沙星的结构有一个羧基官能团极性较大且苯环上氟原子具有一定极性，因此我们选择色谱柱为YMC-Pack ODS-AQ，该色谱柱特点是其反相填料提供相对亲水的表面，可提供优良的色谱峰，能给出比普通ODS柱更长的保留时间。

另外，对比各国药典标准，报道的已知杂质在磷酸三乙胺系统中的出峰先后顺序为：杂质E、杂质F、杂质B、杂质C、杂质I、杂质D、杂质A。为保证各杂质色谱峰的出峰顺序与各国药典标准保持一致，故选择磷酸三乙胺系统作为盐酸环丙沙星片有关物质分析方法的流动相。流动相的选择：对比盐酸环丙沙星原料药ChP2015、USP41、EP9.0、BP2018、JP17有关物质测定方法，各国药典标准采用的流动相缓冲体系相同均为磷酸三乙胺系统。其中EP9.0、BP2018和JP17为等度洗脱程序，杂质A不能被洗脱；而ChP2015和USP41为梯度洗脱程序，杂质A可以被洗脱。Ch.P2015和USP41的分析方法的区别主要在洗脱程序不同。在杂质混合液的色谱分析中，Ch.P2015和USP41色谱图显示均能对各已知杂质分开。区别在于杂质A在USP41的色谱条件下保留时间非常靠后，出峰时间为约18min(分析方法运行时间为20min，洗脱梯度从16min到20min为返回初始洗脱比例时间)。供试品溶液在Ch.P2015和USP41色谱条件下得到的色谱图显示：USP41供试品溶液色谱图中有杂质未分开，且杂质检出个数目明显比Ch.P2015的色谱图少。但Ch.P2015的运行时间要长很多，洗脱程序明显比USP41的洗脱程序要缓慢很多，且最后乙腈比例达到约50％。

基于上述问题，发明人提出了一种盐酸环丙沙星原料或片剂中有关物质的分析检测方法。本发明的发明人通过不懈的努力和实验，对同一混合杂质溶液用不同的分析方法条件进行测试，意外的发现本发明所述的方法7效果最优。

一种盐酸环丙沙星原料或片剂中有关物质的分析方法，其通过液相色谱法对所述盐酸环丙沙星原料或片剂进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述盐酸环丙沙星原料或片剂中有关物质的含量。

本发明所述的一种盐酸环丙沙星原料或片剂中有关物质的分析检测方法，采用高效液相色谱法，采用线性梯度洗脱程序，

配制灵敏度溶液：含环丙沙星0.2μg/ml的溶液(环丙沙星浓度为0.02％)；

配制供试品溶液：含环丙沙星1.0mg/ml的溶液；

配制对照溶液：含环丙沙星2μg/ml的溶液(环丙沙星浓度为0.2％)；

配制系统适用性溶液：所述系统适用性溶液为氧氟沙星、环丙沙星和杂质I的混合液，基于每毫升所述系统适用性溶液，所述含氧氟沙星的量为10μg、含环丙沙星的量为1mg、含杂质I的量为20μg；

测定法：分别取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

根据本发明的实施例，本发明所述的分析方法，其通过液相色谱法对盐酸环丙沙星进行分析，以便获得色谱图。

色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ，4.6mm×250mm，5μm；检测波长：262nm、278nm；柱温：40℃；进样体积：10μl；流动相A：0.025mol/L磷酸溶液(用三乙氨调pH＝3.0±0.1)；流动相B：乙腈；流速：0.8ml/min；稀释剂：乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(用三乙氨调pH＝3.0±0.1)(15:85)；洗脱程序为：

灵敏度溶液：含环丙沙星0.2μg/ml的溶液。(0.02％)

供试品溶液：含环丙沙星1.0mg/ml的溶液。

对照溶液：含环丙沙星2μg/ml的溶液。(0.2％)

系统适用性溶液：取氧氟沙星对照品、环丙沙星对照品和杂质I对照品各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含氧氟沙星10μg、环丙沙星1mg和杂质I 20μg的混合溶液。

测定法：分别取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液色谱图中，氧氟沙星峰与环丙沙星峰和环丙沙星峰与杂质I峰间的分离度均应符合要求。灵敏度溶液色谱图中，以278nm为检测波长，主成分色谱峰峰高的信噪比应大于10。供试品溶液色谱图中，如有杂质峰，杂质A(262nm检测)按外标法以峰面积计算，不得过0.3％。杂质C(278nm检测)按校正后的峰面积计算(乘以校正因子0.6)，不得大于对照溶液主峰面积的2.5倍(0.5％)；杂质B、D和E(278nm检测)按校正后的峰面积计算(分别乘以校正因子0.7，1.4和6.7)，均不得大于对照溶液主峰面积(0.2％)；其他单个杂质(278mn检测)峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.2％)；各杂质(278mn检测)校正后峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的3.5倍(0.7％)。

本发明所述的盐酸环丙沙星原料或片剂中有关物质的分析方法，其有益效果表现在：①环丙沙星峰与氧氟沙星峰、环丙沙星峰与杂质I峰、各杂质峰分离度均符合要求(大于1.5)；②环丙沙星峰与各杂质峰的响应峰高最大，各杂质峰拖尾因子均小于1.5，且未出现环丙沙星峰基线抬高现象；③主峰拖尾因子较小、液相系统压力最小；④本发明提出的方法流动相稳定，有关物质峰与主峰分离良好不干扰主成分检测，而且本发明所述环丙沙星的有关物质分析方法并未改变各杂质峰的出峰顺序。实验结果强有力地证明了上述环丙沙星原料或片剂中有关物质的分析方法，具有高效性、灵敏性、专属性和准确性的特点，能够有效用于盐酸环丙沙星原料或片剂的有关物质分析检测和药品质量控制。

附图说明

图1是根据本发明实施例1所述的USP41盐酸环丙沙星有关物质色谱图；

图2是根据本发明实施例1所述的Ch.P2015盐酸环丙沙星有关物质色谱图；

图3是根据本发明实施例2所述的按照表4的方法1条件进行测试的色谱图及结果；

图4是根据本发明实施例2所述的按照表4的方法2条件进行测试的色谱图及结果；

图5是根据本发明实施例2所述的按照表4的方法3条件进行测试的色谱图及结果；

图6是根据本发明实施例2所述的按照表4的方法4条件进行测试的色谱图及结果；

图7是根据本发明实施例2所述的按照表4的方法5条件进行测试的色谱图及结果；

图8是根据本发明实施例2所述的按照表4的方法6条件进行测试的色谱图及结果；

图9是根据本发明实施例2所述的按照表4的方法7条件进行测试的色谱图及结果；

图10是根据本发明实施例2所述的方法优化后，在278nm波长条件下的盐酸环丙沙星杂质典型分离图；

图11是根据本发明实施例2所述的方法优化后，在262nm波长条件下的盐酸环丙沙星杂质典型分离图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1、Ch.P2015和USP40的有关物质分析方法重现与对比

Ch.P2015和USP41的分析方法的区别主要在洗脱程序不同，具体见表2。我们将采用色谱柱YMC-Pack ODS-AQ，对Ch.P2015和USP41中的盐酸环丙沙星有关物质方法进行比对研究。

表2:Ch.P2015和USP40的有关物质分析方法对比

(1)溶液的配制

空白溶液/稀释剂：0.025mol/L磷酸溶液-乙腈(87:13)(用三乙胺调节pH值至3.0±0.1)。

供试品溶液：取盐酸环丙沙星粉末适量，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释制成约0.5mg/ml的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

杂质混合溶液：取杂质A、B、C、D、E、I对照品适量，精密称定，分别加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含杂质A、B、C、D、E、I各5μg的溶液，作为杂质混合溶液。

(2)药典有关物质分析方法重现

照USP41版盐酸环丙沙星有关物质分析方法，采用YMC-Pack ODS-AQ色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)对供试品溶液和杂质混合溶液检测，结果如附图1。照Ch.P2015版盐酸环丙沙星有关物质分析方法，采用YMC-Pack ODS-AQ色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)对同一供试品溶液和杂质混合溶液检测进行检测，结果如附图2。

(3)比对分析

在杂质混合液的色谱分析中，Ch.P2015和USP41色谱图显示均能对各已知杂质分开。区别在于杂质A在USP41的色谱条件下保留时间非常靠后，出峰时间为约18min(分析方法运行时间为20min，洗脱梯度从16min到20min为返回初始洗脱比例时间)。供试品溶液在Ch.P2015和USP41色谱条件下得到的色谱图显示：USP41供试品溶液色谱图中有杂质未分开，且杂质检出个数目明显比Ch.P2015的色谱图少。但是Ch.P2015的运行时间要长很多，洗脱程序明显比USP41的洗脱程序要缓慢很多，且最后乙腈比例达到约50％。

实施例2、盐酸环丙沙星有关物质的分析方法及条件摸索优化

(1)波长的确定

我们对环丙沙星、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E进行了吸收波长测定，使用二极管阵列检测器，在190nm～400nm范围内的测定吸收度。各杂质的最大吸收波长见表3，由表可知各物质(氧氟沙星除外)波长分布在255nm～280nm，但各有差异，参考Ch.P2015版和USP41版的盐酸环丙沙星原料药有关物质检查标准，选择278nm作为本品的有关物质分析方法的检查波长，单独选择262nm作为杂质A检测波长，并使用校正因子对杂质B，C，D，E峰进行校正。

表3:有关物质测定检测波长的确认试验结果

(2)优化流动相比例、柱温、流速和pH

按照下表4的7种不同方法条件进行测试，测试结果分别见附图3-附图9。

表4:方法条件

由上述方法摸索测试结果可知，对同一混合杂质溶液用各分析方法条件进行测试，上述方法7最优，表现为①环丙沙星峰与氧氟沙星峰、环丙沙星峰与杂质I峰、各杂质峰分离度均符合要求(大于1.5)；②环丙沙星峰与各杂质峰的响应峰高最大，各杂质峰拖尾因子均小于1.5，且未出现环丙沙星峰基线抬高现象；③主峰拖尾因子较小，④液相系统压力最小；杂质典型分离图见附图10、附图11。

(3)各杂质相对保留时间确认，见表5

表5：各杂质相对保留时间对比表

注

由表5可知，应用本发明所述的盐酸环丙沙星原料或片剂有关物质的分析方法，进行样品分析得到的各杂质的相对保留时间与EP药典公布的相对保留时间完全一致。本发明所述的盐酸环丙沙星原料或片剂有关物质的分析方法未改变各杂质峰的出峰顺序。

(4)校正因子确认

第一次试验：采用混合杂质溶液标准曲线法

溶液制备：配制7份主成分环丙沙星和杂质B、杂质C、杂质D、杂质E混合溶液，浓度为供试品浓度的0.02％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.30％、0.45％。在我公司开发的有关物质分析方法下进行确认。

仪器和试剂：岛津LC-AD高效液相色谱仪，安捷伦1260高效液相色谱仪，磷酸(色谱级，阿拉丁)，三乙胺(色谱级，阿拉丁)，乙腈(色谱级，TEDIA)，分析天平(Mettler ToledoXSE205)

试验结果如表6：

表6：混合杂质溶液标准曲线法校正因子测定结果表

由表6可知，分别采用不同高效液相色谱仪岛津和安捷伦测得的各杂质校正因子几乎一致说明本方法精密度好。但采用我公司开发的方法测得的校正因子与药典公布的各杂质校正因子不一致；需进一步确认不一致的原因。

第二次试验：采用单个杂质溶液标准曲线法

溶液制备：配制7份单个主成分环丙沙星溶液和单个杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的溶液，浓度为供试品浓度的0.02％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.30％、0.45％。在我公司开发的有关物质分析方法下进行确认。

仪器和试剂：安捷伦1260高效液相色谱仪，磷酸(色谱级，阿拉丁)，三乙胺(色谱级，阿拉丁)，乙腈(色谱级，TEDIA)，分析天平(Mettler Toledo XSE205)。

试验结果如表7：

表7：单个杂质溶液标准曲线法校正因子测定结果表

由表7可知，采用单个杂质溶液标准曲线法测得的各杂质校正因子与第一次试验的结果(见表6)一致；仍与药典公布的各杂质校正因子不一致。继续确认不一致的原因。

第三次试验：采用盐酸环丙沙星对照品(EDQM)进行测定

溶液制备：配制7份单个主成分盐酸环丙沙星溶液和单个杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的溶液，浓度为供试品浓度的0.02％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.30％、0.45％。在我公司开发的有关物质分析方法下进行确认。

仪器和试剂：安捷伦1260高效液相色谱仪，磷酸(色谱级，阿拉丁)，三乙胺(色谱级，阿拉丁)，乙腈(色谱级，TEDIA)，分析天平(Mettler Toledo XSE205)

试验结果如表8：

表8：校正因子测定结果表

由表8可知，采用盐酸环丙沙星对照品测得的各杂质校正因子与第一次试验的结果(见表6)一致；仍与药典公布的各杂质校正因子不一致。继续确认不一致的原因。

第四次试验：采用EP9.0药典盐酸环丙沙星有关物质分析方法进行测定

溶液制备：配制7份单个主成分盐酸环丙沙星溶液和单个杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的溶液，浓度为供试品浓度的0.02％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.30％、0.45％。在我公司开发的有关物质分析方法下进行确认。

仪器和试剂：安捷伦1260高效液相色谱仪，磷酸(色谱级，阿拉丁)，三乙胺(色谱级，阿拉丁)，乙腈(色谱级，TEDIA)，分析天平(Mettler Toledo XSE205)。

试验结果如表9：

表9：校正因子测定结果表

由表9可知，采用EP9.0药典标准盐酸环丙沙星有关物质分析方法进行测定得到的各杂质校正因子与第一次试验的结果(见表6)一致，说明本公司开发的有关物质方法与EP9.0药典标准有关物质分析方法对各杂质校正因子的测定结果是一致的。但仍与药典公布的各杂质校正因子不一致。

校正因子测定结果汇总表如表10：

表10：校正因子测定结果汇总表

由表10可知，五次试验测得的各杂质校正因子无显著差异。

关于盐酸环丙沙星校正因子测定值与药典公布的不一致，我公司进行了详细的原因调查：1)考察了各杂质溶液的稳定性，数据显示各杂质溶液在24小时是稳定的；2)加大了杂质称样量和溶液稀释体积，减小配制误差；3)考察了不同品牌仪器(岛津LC-AD和安捷伦1260)之间的误差，数据显示无显著差异；4)考察了环丙沙星不同国家的法定对照品之间的差异(中检院和EDQM)，数据显示无显著差异；5)考察了不同标准曲线测定方法(混合杂质溶液和单个杂质溶液)之间的误差，数据显示无明显差异；6)考察了我公司开发的方法与EP9.0药典方法对各杂质校正因子测定的差异，数据显示无显著差异。

因杂质校正因子的测定结果与其含量相关，结合天津市药品检验所发表的文章《HPLC法测定盐酸环丙沙星的有关物质》，同时咨询中国食品药品检定研究院标准品供应业务室，我公司找到原因为中国食品药品检定研究院提供的杂质B、杂质C、杂质E不能作为校正因子测定用，由于我公司开发的方法中杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的相对保留时间与EP9.0/BP2018一致(见表5)，故采用EP9.0/BP2018规定的校正因子进行校正。其他杂质采用不加校正因子的主成分自身对照法进行定量。杂质A采用对照品外标法计算含量。实施例3本发明确定后的盐酸环丙沙星原料或片剂的有关物质分析测定方法

采用高效液相色谱法，色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ，4.6mm×250mm，5μm；检测波长：262nm、278nm；柱温：40℃；进样体积：10μl；流动相A：0.025mol/L磷酸溶液(用三乙氨调pH＝3.0±0.1)；流动相B：乙腈；流速：0.8ml/min；稀释剂：乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(用三乙氨调pH＝3.0±0.1)(15:85)；洗脱程序为：

灵敏度溶液：含环丙沙星0.2μg/ml的溶液(0.02％)；

供试品溶液：含环丙沙星1.0mg/ml的溶液；

对照溶液：含环丙沙星2μg/ml的溶液(0.2％)；

系统适用性溶液：取氧氟沙星对照品、环丙沙星对照品和杂质I对照品各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含氧氟沙星10μg、环丙沙星1mg和杂质I 20μg的混合溶液；

测定法：分别取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液色谱图中，氧氟沙星峰与环丙沙星峰和环丙沙星峰与杂质I峰间的分离度均应符合要求。灵敏度溶液色谱图中，以278nm为检测波长，主成分色谱峰峰高的信噪比应大于10。供试品溶液色谱图中，如有杂质峰，杂质A(262nm检测)按外标法以峰面积计算，不得过0.3％。杂质C(278nm检测)按校正后的峰面积计算(乘以校正因子0.6)，不得大于对照溶液主峰面积的2.5倍(0.5％)；杂质B、D和E(278nm检测)按校正后的峰面积计算(分别乘以校正因子0.7，1.4和6.7)，均不得大于对照溶液主峰面积(0.2％)；其他单个杂质(278mn检测)峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.2％)；各杂质(278mn检测)校正后峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的3.5倍(0.7％)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。