一种犬用犬血清去蛋白眼睛凝胶及其制备方法

摘要

本发明提供一种犬用犬血清去蛋白眼睛凝胶及其制备方法，所述犬血清去蛋白提取物的提取方法，简单有效，可以克服牛血清提取物中存在很多牛源的蛋白、多糖、糖肽等成分的缺陷，同时不需要添加任何外源的化学试剂或者其他成分，因此不含有外源的蛋白或者杂质，而且可以有效的去除内毒素对患宠的影响，提高患宠的接受性，增强治疗效果。本发明提供的犬用眼用凝胶是专门针对患犬使用的眼用凝胶，由于其主要成分为犬血清去蛋白提取物，因此不会产生排斥性或者其他的过敏反应，提高治疗效果。

说明书

技术领域

本发明生物医药技术领域，具体地说，涉及一种犬用犬血清去蛋白眼睛凝胶及其制备方法。

背景技术

DECB眼用凝胶最先由瑞士Solco制药研发生产，商品名素高捷疗(solcoseryl)，于欧洲市场率先上市。素高捷疗眼膏是一种凝胶状的滴眼液，呈透明状，适用于眼干燥症及结膜、角膜溃疡或损伤。该滴眼凝胶是由小牛血提取物、凝胶基质及防腐剂组成。小牛血提取物含有小分子肽、氨基酸和无机盐。该眼药能促进眼部创伤愈合，对中轻度眼干燥症患者，能起到润湿、润滑和营养的作用。

素高捷疗眼用凝胶自80年代进入我国，在临床上广泛应用。宠物眼科疾病近年激增，临床眼用制剂销量一直占据宠物用药前几位，需求很大，我国尚无宠物厂家生产此类眼膏，并且受欧洲疯牛病的影响，此类产品进口困难，价格昂贵。现在常见的生产眼用凝胶的主要原料为小牛血去蛋白提取物。小牛血去蛋白提取物，是一种从小牛血中分离提取得到的小分子生物活性物质，具有组织细胞修复及增殖作用，可广泛用于各种原因造成的皮肤、角膜溃疡、褥疮、烧伤、皮肤移植、伤口糜烂的愈合。但是由于牛血清提取物中存在很多牛源的蛋白、多糖、糖肽等成分，在具体宠物的应用时，会造成宠物的过敏反应，严重的甚至会造成休克或者死亡，严重影响了上述药物在宠物治疗中的应用。而且由于牛可能携带疯牛病、口蹄疫等多种病毒，会给后续的宠物治疗带来临床应用的安全隐患。

此外，现有技术中利用牛或者胎牛血液制备去蛋白提取物的方法虽然很多，但是并不适宜于宠物的治疗过程中，而且现有的小牛血去蛋白提取物中间体的生产方法基本都为化学提取法，在提取过程中或多或少的都会引入外源的蛋白或者杂质，这会更加剧宠物治疗过程中的排斥和抵触。此外，在后续的纯化步骤中主要为离心、乙醇除蛋白、酸解酶解除蛋白、超滤除大分子物质等过程。但目前公知技术中很难最大程度的去除蛋白和保留活性物质，会造成产品质量不稳定，批次之间差距较大，影响产品的疗效，难以形成模范化的治疗标准。

在中国专利CN200910246717.3公开的一种小牛血去蛋白提取物组合物注射液及其制备方法，在制备过程中需要加入枸橼酸钠、胃蛋白酶酶解、枯草杆菌蛋白酶、乙醇、木糖醇和ε-聚赖氨酸。这样的方法不仅复杂，而且需要加入大量的化学物质，从而破坏了小牛血去蛋白提取物的纯净性。

在中国专利CN200410013643中使小牛血去蛋白提取物溶液中的氨基酸、小肽可聚合成大分子量的肽及高分子肽，使药品产生抗原性并降低了药品的生物活性，引起临床过敏反应增加。这种方法制备的产品并不能用在目的是降低过敏反应的宠物治疗领域，而且虽然其技术难度小，易于生产，但很难将杂质，特别是蛋白完全去除，影响了产品纯度，从而危害患者健康甚至生命。

在中国专利CN200610080520中公开了另一种小牛血去蛋白提取技术，利用真空旋转蒸发仪减压除乙醇、酶水解、离心、葡聚糖G15凝胶层析脱盐和DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，最后膜滤除并紫外线灭菌。该方法所用酶水解除蛋白条件剧烈，破坏了更多的活性物质，使得产品生物活性降低，难以实现较好的治疗效果。

因此，本领域亟需一种利用简单、便捷的方法利用宠物动物的血液制备宠物动物来源的血清去蛋白提取物来代替昂贵的、含有外源杂质的牛血清，从而获得适合中国国情的宠物眼用凝胶，使之广泛的应用在宠物的治疗过程中。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取犬血清去蛋白提取物的方法。

所述方法具体为：

①原料处理：将犬血清在-20℃-40℃冻融2次后，纱布进行初过滤。

②离心：将初滤后的犬血清8000rpm离心20min，收集上清液。

③预过滤：离心后的上清液用500KD超滤柱过滤加压过滤，得澄清滤液。

④亲和过滤：利用ConA亲和柱纯化去除内毒素。

⑤超滤、分装：将滤液用截留分子量为10KD的中空纤维柱超滤收集活性多肽精制液，取样测定含量和呼吸活性。

⑥经检验合格，用注射用水配成所需浓度除菌过滤、分装，即为注射用犬血清去蛋白提取物。

进一步的，本发明提供一种犬用眼睛凝胶，所述凝胶按重量计，包括：犬血清去蛋白提取物15-30％，羧甲基纤维素钠0.5％-1％，透明质酸0.1％-7％，甘油0.1％-8％，尼泊金甲酯0.1-3％、尼泊金乙酯0.1-3％、冷结胶0.1-1％、黄原胶0.1～1％，注射用水，调pH值为6.4-7.4。

进一步的，本发明提供一种犬用眼睛凝胶的制备方法，其具体制作步骤如下：

1.取1L容器，加入甘油、羧甲基纤维素钠搅拌分散均匀；

2.注射用水加热后溶解尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、透明质酸、冷结胶、黄原胶；

3.将步骤②与步骤①混合搅拌，待羧甲基纤维素钠完全溶解后，过滤不溶物，置密封容器内，100℃30min流通蒸汽灭菌，完成后放至室温备用；

4.取犬血清去蛋白提取物，0.22um微孔过滤器除菌过滤，无菌条件下与步骤③所得溶液混合，均质搅拌均匀，无菌分装，既得。

本发明所获得的凝胶有机溶剂残留量低(经检测，乙醇残留量≤30ppm或更低)、且凝胶强度大于或等于1000g/cm

本发明的凝胶中，羧甲基纤维素钠表面活性高，制成凝胶滴入眼后形成一层保护膜，并且与透明质酸联用可增大表面粘性，能使所含修复成分犬血清去蛋白提取物更好的附着在眼球上，修复伤口和溃疡面。而且羟丙基甲基纤维素溶于冷水中形成一定粘度的溶液，性质与泪液的粘弹性物质(粘蛋白)接近，可作为人工泪液使用。羟丙基甲基纤维素在滴眼剂中使用，能降低滴眼剂的表面张力，增加对角膜的通透性，增加药物的吸收，提高生物利用度。

甘油有润滑保湿作用，可减轻眼睑闭合摩擦患处带来的疼痛，改善眼部炎症带来的干燥，从而防止眼部继发性损伤。

透明质酸钠通过促进表皮细胞的增殖和分化，以及清除氧自由基的作用，可促进受伤部位皮肤的再生，协助修复角膜问题。

尼泊金甲酯、乙酯作为抑菌剂使用，其中尼泊金甲酯对各类霉菌、酵母菌、细菌有效；尼泊金乙酯对于真菌抑制作用较强，少量使用可用于治疗真菌性角膜溃疡；两者混合使用，有良好的协同和加成。

本发明的眼用凝胶加速6个月内能持久稳定，未见新增杂质产生，安全有效、质量可控。

进一步的，本发明提供上述凝胶在宠物治疗中的应用，所述应用为犬眼部各种病因引起的角膜、结膜的创伤、炎症及溃疡。

有益效果

本发明提供的犬血清去蛋白提取物的提取方法，简单有效，可以克服牛血清提取物中存在很多牛源的蛋白、多糖、糖肽等成分的缺陷，同时不需要添加任何外源的化学试剂或者其他成分，因此不含有外源的蛋白或者杂质，而且可以有效的去除内毒素对患宠的影响，提高患宠的接受性，增强治疗效果。

本发明提供的犬用眼用凝胶是专门针对患犬使用的眼用凝胶，由于其主要成分为犬血清去蛋白提取物，因此不会产生排斥性或者其他的过敏反应，提高治疗效果。眼用凝胶的疗效与进口产品类似，可以替代进口，能够解决患宠痛苦、减轻宠主经济压力，同时提高研制能力和公司形象，影响深远。

附图说明

图1患犬使用犬血清去蛋白凝胶前的临床图片

图2患犬使用犬血清去蛋白凝胶后的临床图片

具体实施方式

实施例1犬血清去蛋白提取物的制备

所述方法具体为：

①原料处理：在无菌条件下采3-5个月龄的清洁级Beagle犬的静脉血，用搅拌器进行搅拌，搅拌速度15～100转/分钟，搅拌时间1～5分钟，尽量消除纤维蛋白原对血液凝固和后续操作中的影响，放于4℃冰箱中过夜，使其自然分离出血清I；剩余部分在无菌条件下，1000rpm，4℃离心10-30分钟，分离出血清II。将血清I和血清II混合后利用-20℃-40℃反复冻融2次后，利用纱布粗滤，收集滤过液；

②离心：将初滤后的犬血清以8000rpm离心20min，收集上清液，初步去除血清中残留的脂类、免疫球蛋白、内毒素、血红蛋白等杂质。

③预过滤：离心后的上清液用500KD超滤柱过滤加压过滤，得澄清滤液。用北京旭邦膜设备有限责任公司CLW-003型中空纤维超滤膜组件，美国Spectrum公司截留分子量500kd超滤柱，充分透析。血清粘度很大，超滤柱过滤面积应不小于50m

④亲和过滤：利用ConA亲和柱纯化去除内毒素。ConA填料采用ConA Sepharose 4B(GE Healthcare公司生产)。平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 7.4。洗脱缓冲液：硼酸-硼砂缓冲液，0.1M，pH 6.5。具体方法：将步骤③的样品上样到平衡好的ConA填料柱上，样品流速1ml/min，收集流穿液。按照上面缓冲液进行冲洗和洗脱，与ConA填料结合的是多糖和内毒素，洗脱下来，弃掉。ConA填料的清洗和恢复(CIP)按照生产厂家说明书进行。

⑤超滤、分装：将滤液用截留分子量为10KD的北京旭邦膜设备有限责任公司005W型中空纤维超滤膜组件中空纤维柱超滤收集活性多肽精制液，取样测定含量和呼吸活性。

⑥经检验合格，用注射用水配成所需浓度除菌过滤、分装，即为注射用犬血清去蛋白提取物。

实施例2犬血清去蛋白提取物的质量检测

(1)犬血清去蛋白提取物与牛血清去蛋白提取物的成分比较

由于现有技术中并没有犬血清去蛋白提取物的制备，因此需要对犬血清去蛋白提取物和本领域常见的牛血清去蛋白提取物中的活性成分进行比较。动物血清生化分析采用全自动血液生化分析仪(AU27200型)检测。牛血清FBS购自杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：060912。测定指标包括:尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酸转肽酶(GGT)、胆碱酯酶(CHE)、肌酸磷酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、羟丁酸脱氢酶(HBDH)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、钾(K

采用SPSS10.0统计软件对实验结果进行统计分析。数据以均数±标准差表示，组间数据分析采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。FBS中GGT、CK、CK-MB、LDH、HBDH水平明显高于Beagle-S(P<0.05)；CHE水平却明显低于犬血清，两者之间比较，具有显著统计学意义。血清中的BUN、CRE、GLU、TP、ALB、ALT、ALP、TBIL、DBIL、TG、K

通过上述结果分析，由于胎牛血清和犬血清中成分的差异，犬血清提取物的制备方法和牛血清提取物的制备方法并不能简单地相互替换，需要有与之相对应的特定制备方法，尤其是涉及到过滤、超滤步骤中的具体孔径、压力等具体参数，会影响到制备获得的犬血清提取物的成分变化。

(2)内毒素含量的检测

将鲎试剂用无内毒素蒸馏水100μL溶解，然后分别加入稀释40倍的原料血清留样100μL与鲎试剂混合，同时设有阴性对照和阳性对照，37℃孵育1h后通过观察凝集情况判断标本中的内毒素含量范围。

通过三次平行试验发现，增加了步骤④去除内毒素操作的血清提取物样品均未发生凝集，表明血清中的细菌内毒素低于0.1EU/mL(试剂盒检测限量为0.1EU/mL)，符合中国药典2010版中关于内毒素含量的要求≤10EU/mL，而未经过步骤④处理的样品，内毒素的浓度为55-69EU/ml(见表1)。

表1内毒素含量检测结果

实施例3犬用眼用凝胶的制备

首先，按照具体需要准备原料，包括：犬血清去蛋白提取物20％，羧甲基纤维素钠0.5％，透明质酸5％，甘油5％，注射用水，尼泊金甲酯1％、尼泊金乙酯1％，冷结胶0.5％、黄原胶0.5％。

取1L容器，加入甘油、羧甲基纤维素钠搅拌分散均匀；

将注射用水加热到40-60℃后溶解尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、透明质酸、冷结胶、黄原胶；

上述获得的两种液体混合搅拌，使上述两种溶液充分互溶，过滤不溶物，置密封容器内，100℃30min流通蒸汽灭菌，完成后放至室温备用；

再取犬血清去蛋白提取物，0.22um微孔过滤器除菌过滤，无菌条件下与上述溶液混合，均质搅拌均匀，无菌分装，既得。

实施例4犬用眼用凝胶的抑菌效果检测：

菌种选择：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌

将大肠杆菌、金色葡萄球菌分别接种肉汤培养液中，37℃培养18h；白色念珠菌、绿脓杆菌接种沙氏葡萄糖液体培养基，将大肠杆菌、金色葡萄球菌、绿脓杆菌调整至10

将配制好的菌悬液各取0.1ml分别加入4份，每份10g重量无抑菌剂的凝胶中，混合均匀，在6h，24h、72h、7d涂布平板，计数。结果如表2所示。

表2微生物在不含抑菌剂的凝胶中生长情况(10

将配制好的菌悬液各取0.1ml分别加入4份，每份10g重量仅添加尼泊金甲酯的无菌凝胶中，混合均匀，在6h、24h、72h、7d涂布平板，计数。结果如表3所示。

表3微生物在含尼泊金甲酯的凝胶中生长情况(10

将配制好的菌悬液各取0.1ml分别加入4份，每份10g重量仅添加尼泊金乙酯的无菌凝胶中，混合均匀，在6h、24h、72h、7d涂布平板，计数。结果如表4所示。

表4微生物在含尼泊金甲酯的凝胶中生长情况(10

将配制好的菌悬液各取0.1ml分别加入4份，每份10g重量添加尼泊金甲酯、乙酯的无菌凝胶中，混合均匀，在6h、24h、72h、7d涂布平板，计数。结果如表5所示。

表5微生物在含尼泊金甲酯乙酯的凝胶中生长情况(10

由上面的数据可以看出，尼泊金甲酯、乙酯作为抑菌剂使用，其中尼泊金甲酯对各类霉菌、酵母菌、细菌有效；尼泊金乙酯对于真菌抑制作用较强，少量使用可用于治疗真菌性角膜溃疡；两者混合使用，有良好的协同和加成，具有1+1远大于2的效果，两者在抑菌效果上缺一不可。

实施例5犬用眼用凝胶的质量检测

(1)生物活性测定：

测定去蛋白提取物的有效方法就是计算其呼吸活力(QO

5.1仪器

SKW-3微量呼吸检压仪(上海大学)；电子天平；加样器；秒表；手术器械5.2试剂

氢氧化钠溶液(10％),Soerensen缓冲液:(pH7.4 0.0667mol·L-1):称取磷酸氢二钠(Na

5.3肝匀浆制备

体重250-350g雄性豚鼠一只，禁食24h以上，引颈处死，在冰浴上快速取出肝脏，称重，用冷磷酸盐缓冲液冲洗去掉血液后移置玻璃匀浆器内，按1：9(w/v)加入磷酸盐缓冲液，在冰浴中研磨，制成肝匀浆液。

5.4试验准备

用瓦氏微量呼吸检压仪测定豚鼠肝匀浆的呼吸活力，测得耗氧量，计算出呼吸活力QO

①先将测压液装到橡胶管中，再将测压管插入橡胶管中，确保没有任何细小气泡，最后将测压管固定到架子上，调节测压管的液面至150mm。

②加10％氢氧化钾溶液0.2mL于反应瓶小杯中(为了增加氢氧化钠对二氧化碳的吸收面积，在氢氧化钾溶液中插入一小片滤纸)。

③反应瓶中先加入磷酸盐缓冲液1.1mL，肝匀浆液1.0mL，然后加供试品0.2mL于反应瓶中。

④空白瓶中先加入磷酸盐缓冲液1.1mL，肝匀浆液1.0mL，然后加磷酸缓冲液0.2mL于反应瓶中。(因为肝匀浆本身具有耗氧作用)。

⑤校正瓶中先加入磷酸盐缓冲液1.1mL，磷酸缓冲液1.0mL，然后再加磷酸缓冲液0.2mL于反应瓶中。稳压测试管使其在与试验管完全相同的条件下，观察压力的变化(△C)，以消除由于温度及大气压影响而引起的误差。

⑥将反应瓶按标号与检压管一一对应连接相连(注意密闭，勿使漏气)，置于37℃恒温水浴的振荡器中。

⑦开动振荡器振摇10min(120次/分)，目的使反应瓶内外温度一致，震荡时保证检压管的三通活塞是开放状态，10min后，将检压管右侧液面调至150mm，记下左侧液面读数(A)，关闭三向活塞，计时反应30min后，将测压计右侧液面调至150mm，记下左侧液面读数(B)。重复二次，记下读数(C)和(D)。

⑧精确量取1.0mL肝匀浆，置恒重的装有海砂的称量瓶中，105℃干燥至恒重，计算两次的重量差ΔW(mg)

5.5计算方法：

QO

表6本品与素高捷疗眼用凝胶生物活性及质量对比

(2)稳定性检测

取制备好的犬眼用凝胶，在温度35℃±2℃，湿度75％±5％条件下放置6个月。试验期内分别于0月、1个月、2个月、3个月、6个月各取样一次进行测定。结果如表7所示。结果证实本申请所制备的眼用凝胶加速6个月内能持久稳定。

表7眼用凝胶加速稳定性检测

(3)临床效果检测

实验选用健康犬15只，2-3月龄，体重0.8-1.2kg。分为3组，对照组、素高捷疗组、犬血眼用凝胶组。实验前一日，双眼用0.5％的普鲁卡因局部麻醉，用手术刀均匀刮除角膜上皮，滴加硫酸新霉素滴眼液。滴加2％荧光素钠着色，观察损伤面积，待损伤达到100％后，开始给药。每日给药三次，连用5日，同时双眼滴加硫酸新霉素滴眼液防止细菌感染。每日滴2％荧光素钠着色，观察角膜愈合情况。

按照角膜损伤范围的如下标准进行打分，结果如表8所示：

无损伤：0

损伤在25％以内：1

损伤在26-50％之间：2

损伤在51-75％之间：3

损伤大于75％：4

表8临床效果检测打分表

结果显示，给药第一天，对照组角膜损伤面积在75％以上，素高捷疗组和犬血眼用凝胶组损伤面积多在51-75％；给药第二天，对照组角膜损伤面积在51-75％之间，素高捷疗组和犬血眼用凝胶组损伤面积多在26-50％；给药第三天，对照组角膜损伤面积在51-75％之间，素高捷疗组和犬血眼用凝胶组损伤面积半数在26-50％之间，半数在25％以内；给药第四天，对照组角膜损伤面积在26-50％之间，素高捷疗组损伤面积多数在25％以内，个别已愈合，犬血眼用凝胶组少数损伤面积在25％以内，多数已愈合；给药第五天，对照组角膜损伤面积多数在26-50％之间，少数恢复到25％以内，素高捷疗组角膜损伤多数愈合，少数损伤面积在25％以内，犬血眼用凝胶组角膜损伤基本已愈合。

以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。