靶向CCL19/CCR7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途

摘要

本发明公开了靶向CCL19/CCR7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途，属于生物医药技术领域。本发明提供了具有免疫增强作用的CCL19蛋白及敲减其受体CCR7表达的调节剂AAV‑shRNA‑CCR7(shCCR7)在促进提升CD8+T细胞的比例及HBV抗原特异性T细胞活化及凋亡，加速HBV清除方面的应用。可用于加速HBV慢性感染的哺乳动物体内HBV的清除，对制备HBV预防性药物或者治疗性疫苗提供了理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及靶向CCL19/CCR7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途，属于生物医药技术领域，具体涉及免疫调节剂及其用途。

背景技术

全世界大约有2.5亿人长期感染乙型肝炎病毒(HBV)，极有可能发展为肝脂肪变性，肝硬化，终末期肝衰竭或肝细胞癌

在我们之前关于先天免疫的研究中，诸如样受体(Toll Like Receptor，TLR)等因子通过启动细胞内信号通路来产生干扰素(IFN)和其他细胞因子，从而被确定为HBV去除的第一条防线，从而诱导HBV反应的免疫反应

趋化因子19(CCL19)是一种维持免疫平衡的药物，它协调CCR7表达的炎症性T淋巴细胞和树突细胞的招募和沿化学梯度的转运

肝脏是免疫耐受的器官，肝脏的实质细胞及非实质细胞有抑制免疫细胞活化的作用，如果有细胞因子可以打破这种免疫耐受，将有助于预防HBV等肝脏病原体的感染或加速感染病原体的清除。细胞因子作为免疫调节剂在抗病毒治疗中是广泛使用的，比如IFN-α在抗HBV治疗及抗新型冠状病毒治疗中都在《治疗指南》中被推荐

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发明内容

本发明通过研究CCL19在体外和体内对HBV慢性感染的作用，提供了免疫调节剂CCL19和shCCR7在HBV预防性药物或者治疗性疫苗中的新用途。

本发明的第一个目的是提供(a)或(b)在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用；其中：

(a)趋化因子CCL19和/或趋化因子受体CCR7；

(b)靶向CCL19和/或CCR7的免疫调节剂。

在一种实施方式中，所述免疫调节剂包括但不限于靶向CCL19的免疫激活剂。

在一种实施方式中，所述免疫调节剂包括但不限于靶向CCR7的抑制剂。

在一种实施方式中，所述靶向CCL19的物质为携带CCL19基因的表达载体；编码所述CCL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在一种实施方式中，所述携带CCL19基因的表达载体为pcDNA3.1(+)-CCL19。

在一种实施方式中，所述靶向CCR7的物质为携带靶向CCR7的shRNA的表达载体。

在一种实施方式中，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

含有CCL19免疫激活剂和/或CCR7抑制剂的注射制剂。

有益效果：本发明提供了免疫调节剂CCL19和shCCR7在HBV预防性药物或者治疗性疫苗中的新用途。本发明通过体外细胞实验和动物实验证明了CCL19具备如下作用：

(1)促进临床乙肝病毒(HBV)感染者体内的CD8+T细胞产生HBc特异性干扰素(IFN-γ)；

(2)使肝内产生高水平的CD8

(3)介导血液及脾脏的PD-1

(4)调节抗原响应性CD8+T细胞凋亡，调节性T细胞(Treg)和分泌细胞因子；

可作为HBV预防性药物或治疗性疫苗的有效成分，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1A图为HBV感染者的淋巴细胞经体外CCL19蛋白刺激后产生CCR7

图2A图为CCL19使HBV慢性感染的小鼠体内产生了更高水平的枯否细胞(KCs)细胞(CD11c

图3A图为建模后2周和4周血液和脾脏CD4+及CD8+淋巴细胞表面PD-1及CCR7表达的分析；B图为各组小鼠淋巴细胞CCR7的表达情况。C图为外周血淋巴细胞PD-1

图4为CCL19蛋白体外刺激肝脏实质细胞和非实质细胞而介导T细胞活化的情况；肝脏非实质细胞包括血管内皮细胞(LSECs)和枯否细胞(KCs)。

图5A图为CCL19蛋白促进抗原响应性CD8+T细胞的凋亡；B图为CCL19蛋白促进CD8+Treg细胞下调；C为CCL19蛋白促进CCL19过表达小鼠的脾细胞分泌更多的抗病毒细胞因子(TNF-a和IFN-γ)。

图6为CCL19分子表达及CCR7分子敲减均对CHB小鼠抗原的清除作用；包括HBV病毒的表面抗原(HbsAg)、E抗原(HBeAg)，HbsAg抗原阳性小鼠的比例和HBV病毒的DNA拷贝数。

图7为表达CCL19的重组质粒pcDNA3.1(+)-CCL19图谱。

具体实施方式

实施例1免疫调节剂CCL19和shCCR7用于HBV慢性感染的病人外周血淋巴细胞

慢性乙肝病人肝脏中的病毒之所以不能被清除，主要是肝脏是个免疫耐受器官，同时乙肝病人体内存在CD8+T淋巴细胞耗竭，将免疫调节剂CCL19和免疫调节剂shCCR7在HBV慢性感染的病人外周血淋巴细胞(PBMC)上进行功能验证。具体步骤为：

(1)提取外周血淋巴细胞，加入到24孔板内，每孔1×10

实施例2小鼠模型的建立

用慢性HBV感染的C57/BJ小鼠构建HBV感染小鼠模型，经高压尾静脉注射HBV1.2质粒，10ng/只，HBV1.2质粒为台湾大学陈培哲教授惠赠，感染小鼠的具体操作参考文献LinYJ,Huang LR,Yang HC,Tzeng HT,Hsu PN,Wu HL,et al.Hepatitis B virus coreantigen determines viral persistence in a C57BL/6mouse model.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America(2010)107(20):9340-5.doi:10.1073/pnas.1004762107。

用按上述方法构建的HBV感染小鼠模型构建CCL19高表达及其受体CCR7减低表达的模型。

(1)CCL19分子高表达慢性HBV感染小鼠模型：将本实验室构建的pcDNA3.1(+)上重组表达鼠CCL19的质粒(质粒图谱如图7所示，编码CCL19的核苷酸序列为：ATGGCCCCCCGTGTGACCCCACTCCTGGCCTTCAGCCTGCTGGTTCTCTGGACCTTCCCAGCCCCAACTCTGGGGGGTGCTAATGATGCGGAAGACTGCTGCCTGTCTGTGACCCAGCGCCCCATCCCTGGGAACATCGTGAAAGCCTTCCGCTACCTTCTTAATGAAGATGGCTGCAGGGTGCCTGCTGTTGTGTTCACCACACTAAGGGGCTATCAGCTCTGTGCACCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGATCGCATCATCCGAAGACTGAAGAAGTCTTCTGCCAAGAACAAAGGCAACAGCACCAGAAGGAGCCCTGTGTCTTGA)通过高压尾静脉注射到小鼠体内(10ug/只)，在注射前及注射7天后采血，通过ELISA法及RT-PCR法，检测CCL19的表达情况，证明CCL19在体内表达增高。RT-PCR法相对定量所用的引物为：CCL19,5’-CTG CCT GTC TGT GAC CCA GCG CCC C-3’(sense)和5’-ACTTCT TCA GTC TTC GGA TGA TGC G-3’(antisense)，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；及β-actin,5’-GCG AGC ACA GAG CCT CGC CTT TG-3’(sense)和5’-GAT GCCGTG CTC GAT GGG GTA C-3’(antisense)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

(2)CCR7受体敲减的小鼠模型：为将CCR7的部分序列设计成shRNA，并装载到腺相关病毒AAV病毒载体上，CCR7 shRNA序列合成引物为：5’-GCG UCA ACC CUU UCU UGU ATT-3’(sense)和5’-GAC GCA GUU GGG AAA GAA CAU-3’(antisense)，核苷酸序列分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。将shCCR7扩增的双链连接到AAV载体上，通过高压尾静脉给HBV慢性感染小鼠模型C57BL/6小鼠注射(2×10

以等量的PBS注射HBV慢性感染小鼠为对照组小鼠模型。

实施例3免疫调节剂CCL19和shCCR7用于HBV慢性感染的小鼠

将免疫调节剂CCL19和免疫调节剂shCCR7在HBV慢性感染的小鼠上进行功能验证，分别检测实施例2构建的对照组小鼠模型、CCR7敲减的HBV慢性感染小鼠模型和CCL19分子高表达慢性HBV感染小鼠模型作用一段时间后的肝非实质细胞的构成比例、免疫调剂及对细胞的作用。

(1)免疫调节剂作用后2周时肝非实质细胞的构成比例变化：CCL19高表达小鼠的KCs细胞(F4/80+，CD11c-)比例显著提高(约70％)，CCR7分子敲减导致KCs细胞的比例下降(约60％)，在CHB小鼠各组中的比例差异不明显(约50％)(图2A-2B)。然而，与PBS+HBV和CCL19+HBV组相比，shCCR7+HBV小鼠在肝脏中单细胞、T细胞、B细胞和粒细胞水平明显下降，CCL19表达增加提升了T细胞的比例，更重要的是，CD8

(2)免疫调节剂对小鼠体内PD-1

(3)免疫调节剂对小鼠肝脏APC中的CD8+T细胞的作用：体内肝脏的APC(包括肝脏实质细胞和非实质细胞)是主要抑制免疫细胞发挥功能的主要细胞，通过体外实验验证，体外纯化的肝实质细胞、KCs细胞及LSECs细胞经CCL19蛋白(外加CD3/CD28单克隆抗体激活)刺激24小时后，与淋巴细胞(脾脏来源)共孵育，48小时后比较加CCL19和未加CCL19蛋白各组小鼠淋巴细胞分泌抗病毒细胞因子的量，结果显示：与阴性对照组NC相比，CCL19+HBc可以促进肝实质细胞(Hepatocytes)和非实质细胞(LSECs+KCs)介导淋巴细胞产生抗病毒细胞因子增多(图4)，简言之，CCL19分子可促进肝脏APC中的CD8+T细胞激活。

(4)免疫调节剂对CHB小鼠CD4+及CD8+T细胞抗原特异性细胞凋亡的作用：细胞凋亡是免疫活化后的一种程序性死亡，还有助于清除损伤和不必要的细胞。与PBS+HBV组小鼠比较(60％)，CCL19分子高表达(CCL19+HBV)及CCR7分子敲减(shCCR7+HBV)小鼠的脾细胞经体外培养及乙肝病毒核心蛋白肽(HBc)刺激均产生了显著的CD8

(5)免疫调节剂对小鼠HBV感染后的病毒清除作用：检测实施例2构建的CCL19分子高表达小鼠模型体内CCL19蛋白含量，及CCR7受体敲减的小鼠模型体内CCR7受体分子含量，结果显示，CCL19蛋白的增加和CCR7的减少可以维持1个月以上。按周观察小鼠体内的HBV特异性表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)、HBsAg阳性鼠及肝脏HBV DNA的阳性情况，结果显示，预先注射免疫激活剂及免疫调节剂的小鼠体内HBV出现了加速清除(图6)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 无锡市第五人民医院

<120> 靶向CCL19/CCR7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

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