CCL19/CCR7在肺癌A549细胞中通过Sp1调控乙酰肝素酶表达

摘要

前言
　　 趋化因子(chemokine)CCL19与其受体CCR7在淋巴细胞的归巢中起着重要作用。研究发现,在许多实体性肿瘤CCR7高表达,并且与肿瘤的生长,血管发生,淋巴结转移及其侵袭相关。我们课题组前期试验发现,CCR7在非小细胞肺癌中过表达,并且与肿瘤的淋巴结转移及其侵袭密切相关。但目前CCL19/CCR7促进肿瘤细胞侵袭转移的确切机制尚不清楚。我们在肺癌细胞中加入CCL19后,发现Hpa表达上调。乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)在转移性的恶性肿瘤细胞中普遍存在,能够降解细胞外基质和基底膜,促进是肿瘤的侵袭与转移。因此我们预测CCL19/CCR7通过调控Hpa的表达,促进肺癌细胞的侵袭,但是调控机制不清。Hpa基因的启动子区含有转录因子Sp1的结合位点。本研究在肺腺癌A549细胞中外源性加入CCL19激活CCR7后,研究其对Sp1和Hpa表达以及细胞侵袭力的影响。
　　 材料与方法
　　 1、抗体和试剂:多克隆乙酰肝素酶抗体、CCR7抗体、单克隆抗体Sp1抗体、Mithramycin A,CCL19购自peprotech公司。
　　 2、细胞培养:人肺腺癌A549细胞系用含有10％胎牛血清的DMEM培养基,37℃,5％CO2的培养箱内培养。
　　 3、RT-PCR:取对数生长期的细胞用TRIZOL(Invitrogen,USA)提取总RNA,逆转录,PCR扩增,1.5％琼脂糖凝胶电泳,用Image J软件进行表达强度分析。
　　 4、蛋白印迹分析:收集细胞,提取总蛋白,60～80微克总蛋白经12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,电转移至PVDF膜。检测乙酰肝素酶、Sp1水平。
　　 5、染色质免疫共沉淀(ChIP):按照ChIP试剂盒说明进行,检测Sp1与乙酰肝素酶启动子区的结合情况。
　　 6、Transwell试验:接种各组细胞于含有或者不含Matrigel微孔滤膜的小室中,分别培养24h后,4％多聚甲醇固定,苏木素染色,显微镜观察细胞体外侵袭和迁移能力变化。
　　 7、统计分析:使用SPSS17.0统计软件进行数据处理,以P<0.05为有统计学意义。
　　 结果
　　 1、CCL19/CCR7通过Sp1上调肺癌A549细胞Hpa的表达
　　 外源性加入CCL19作用不同时间后,Sp1和HpamRNA和蛋白的表达水平上调。其中Sp1抑制剂MA对Sp1与HpamRNA和蛋白抑制作用明显,分别用CCR7抗体作用24h,Sp1的抑制剂Mithramycin A(MA)作用后加入CCL19,RT-PCR和western blot显示Sp1与Hpa的表达均下调。
　　 2、CCL19促进了Sp1与Hpa启动子的结合
　　 我们首先分析了乙酰肝素酶启动子区的序列,证实了Sp1与乙酰肝素酶的连接位点(5-GGGGC-3)即GC-box。ChIP分析显示Sp1与Hpa启动子区的结合,在经过CCL19处理后增加,CCR7阻断后有所下降,未受CCL19影响。
　　 3、CCL19/CCR7通过Sp1调控Hpa促进肿瘤细胞侵袭加入CCL19的A549细胞的侵袭能力,与对照组相比,明显增加。在分别阻断CCR7,抑制Sp1后,侵袭能力下降。在CCL19作用后将Hpa阻断,发现细胞侵袭能力与对照组相比未见明显变化。
　　 结论
　　 CCL19可以激活CCR7上调转录因子Sp1的表达,促进HpamRNA的转录,进而促进肺癌细胞的侵袭。

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材料与方法

结果

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结论

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