一种去除水体中ARGs的藻菌共生体系的构建方法

摘要

本发明公开了一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，包括以下步骤：S1：将普通小球藻细胞和地衣芽孢杆菌接种于已灭菌的BG11‑LB培养基中；S2：将接种了普通小球藻细胞和地衣芽孢杆菌细胞的混合培养基置于恒温、恒定光照的无菌室内培养；S3：配置含有抗生素抗性基因质粒的人工污；S4：将步骤S2中混合培养基与步骤S3的人工污水混合，形成藻菌共生体系；S5：取S4中的1‑2mL藻菌混合液，采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔，冷却后重新置于步骤S4中的藻菌共生体系中，继续在恒温、恒定光照的无菌室内培养。本发明中涉及的藻菌共生体对自然水体中的sul1、sul2、tetM、tetQ、tetW等ARGs具有良好的去除效果。

说明书

技术领域

本发明属于抗生素抗性基因污染处理技术领域，尤其涉及一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法。

背景技术

抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)污染已成为当今世界备受人们关注的水体污染问题。抗生素在医疗、畜牧、水产养殖业等领域的大量使用造成水体中ARGs污染在环境中的累积。据报道，我国众多水体中ARGs均有不同程度的检出，其中磺胺类和四环素类ARGs普遍存在且浓度较高。水体是ARGs释放和扩散的重要介质，ARGs可通过水循环进入人类食物链，对水体生态环境和人类健康构成严重威胁。因此，人们一直在积极探索水体中ARGs污染控制与修复的方法。

发明内容

为了克服现有的水体抗生素抗性基因污染物去除技术的缺陷，本发明提供了一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，本发明中涉及的藻菌共生体对自然水体中的磺胺类抗生素抗性基因(sul1、sul2)、四环素类抗生素抗性基因(tetM、tetQ、tetW)等ARGs具有良好的去除效果。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，包括以下步骤：

S1：将普通小球藻和地衣芽孢杆菌接种于已灭菌的150-200mL的BG11-LB培养基中；

S2：将接种了普通小球藻和地衣芽孢杆菌的混合培养基置于恒温、恒定光照的无菌室内培养；

S3：配制含有抗生素抗性基因质粒的人工污水；

S4：将步骤S2中混合培养基与步骤S3的人工污水混合，形成藻菌共生体系；

S5：取S4中的1-2mL藻菌混合液，采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔，冷却后重新置于步骤S4中的藻菌共生体系中，继续在恒温、恒定光照的无菌室内培养。

步骤S3中的含有抗生素抗性基因质粒的人工污水配置方法为：将构建好的目标抗生素抗性基因的质粒成品和人工污水初始抗生素抗性基因丰度按N

其中，式中N

C

M

步骤S5中采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔的具体步骤为：

S501：取S4中的1-2mL藻菌混合液置于无菌离心管，迅速置于冰面，确保冰面覆盖离心管，保持5min后，在4℃温度条件下离心后保留沉淀；

S502：向步骤S501的沉淀中加入1-2mL的cytomix缓冲液，在10000-12000g/min、0-4℃条件下离心2-5min，保留沉淀，重复此步骤3次；

S503：向5-10μL步骤S3人工污水中加入100-150μL质量分数为15-20％的蔗糖溶液作为细胞保护液，然后将细胞保护液加入到步骤S502中的沉淀中，并使用移液枪吹打；

S504：将步骤S503吹打后的溶液转移到预冷5-10min的电击杯中进行电击脉冲处理；

S505：将步骤S504中电击后的溶液冷却15-30min后，在8000-10000g/min、0-4℃条件下离心10-30s，保留沉淀，将沉淀重新置于步骤S4中的藻菌共生体系中，继续在恒温、恒定光照的无菌室内培养，培养7-10天后，可有效降低人工污水中的ARGs的相对丰度。

所述步骤S1具体为：

S101：将处于对数期的普通小球藻接种于灭菌的BG11培养基中，进行无菌培养，培养3-5代，藻细胞浓度达到1×10

S102：将处于对数生长期的地衣芽孢杆菌接种于灭菌的LB培养基中，置于无菌室进行光照培养，培养5-10代，菌细胞浓度达到1×10

S103：取1-5mL的普通小球藻和1-5mL的地衣芽孢杆菌，于无菌室内接种于150-200mL的BG11-LB培养基中，其中，BG11培养基与LB培养基按体积比1:1-1:5混合。

步骤S2和步骤S5中的恒温、恒定光照的温度设置为26-30℃，光照强度设置为120μmol/m

所述抗生素抗性基因选自磺胺类抗生素抗性基因(sul1、sul2)或四环素类抗生素抗性基因(tetM、tetQ、tetW)中任意一种或任意组合。

本发明由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：

(1)普通小球藻不易被外源ARGs侵染，地衣芽孢杆菌自身不易被抗生素诱导产生ARGs，即使有外源ARGs进入藻菌共生体细胞内，也较难实现遗传物质的复制与表达。因此，普通小球藻-地衣芽孢杆菌共生体可以安全高效地去除水体中的ARGs。

(2)本发明提出的使用细胞电穿孔法将ARGs导入小球藻细胞与地衣芽孢杆菌体细胞中的方法，成本低廉、操作快捷简单、且穿孔后，小球藻细胞和地衣芽孢杆菌体细胞的成活率高达80％-90％，且成活的小球藻细胞和地衣芽孢杆菌体细胞可正常生长、繁殖(但进入小球藻细胞与地衣芽孢杆菌体细胞的ARGs不在藻细胞与菌体细胞内表达)。

(3)小球藻细胞和地衣芽孢杆菌体细胞在穿孔前后均具有较高的活性，因此，可在待处理ARGs污染水体外加电场，实现脉冲细胞穿孔，促使ARGs高效进入藻细胞与菌体细胞，实现普通小球藻细胞和地衣芽孢杆菌对水体中ARGs的“生物遗传封锁”，进而结合物理和生物方法实现对水体中ARGs的去除。

附图说明

图1为本发明的细胞电击穿孔后，藻菌共生体系去除水体ARGs的机理图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。

一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，包括以下步骤：

S1：将普通小球藻和地衣芽孢杆菌接种于已灭菌的150-200mL的BG11-LB培养基中；

S2：将接种了普通小球藻和地衣芽孢杆菌的混合培养基置于恒温、恒定光照的无菌室内培养，温度设置为26-30℃，光照强度设置为120μmol/m

S3：配制含有抗生素抗性基因质粒的人工污水；

S4：将步骤S2中混合培养基与步骤S3的人工污水混合，形成藻菌共生体系；

S5：取S4中的1-2ml藻菌混合液，采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔，冷却后重新置于步骤S4中的藻菌共生体系中，继续在恒温、恒定光照的无菌室内培养，温度设置为26-30℃，光照强度设置为120μmol/m

步骤S3中的含有抗生素抗性基因质粒的人工污水配置方法为：将构建好的目标抗生素抗性基因的质粒成品和人工污水中初始抗生素抗性基因丰度按N

其中，式中N

C

M

步骤S5中采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔的具体步骤为：

S501：取S4中的1-2mL藻菌混合液置于无菌离心管，迅速置于冰面，确保冰面覆盖离心管，保持5min后，在4℃温度条件下离心后保留沉淀；

S502：向步骤S501的沉淀中加入1-2mL的cytomix缓冲液，在10000-12000g/min、0-4℃条件下离心2-5min，保留沉淀，重复此步骤3次；

S503：向5-10μL步骤S3人工污水中加入100-150μL质量分数为15-20％的蔗糖溶液作为细胞保护液，然后将细胞保护液加入到步骤S502中的沉淀中，并使用移液枪吹打；

S504：将步骤S503吹打后的溶液转移到预冷5-10min的电击杯中进行电击脉冲处理，电击脉冲的电压、电流、脉冲频率等是多少；

S505：将步骤S504中电击后的溶液冷却15-30min后，在8000-10000g/min、0-4℃条件下离心10-30s，保留沉淀，将沉淀重新置于步骤S4中的藻菌共生体系中，继续在恒温、恒定光照的无菌室内培养，培养7-10天后，可有效降低人工污水中的ARGs的相对丰度。

所述步骤S1具体为：

S101：将处于对数期的普通小球藻接种于灭菌的BG11培养基中，进行无菌培养，培养3-5代，藻细胞浓度达到1×10

S102：将处于对数生长期的地衣芽孢杆菌接种于灭菌的LB培养基中，置于无菌室进行光照培养，培养5-10代，菌细胞浓度达到1×10

S103：取1-5mL的普通小球藻和1-5mL的地衣芽孢杆菌，于无菌室内接种于150-200mL的BG11-LB培养基中，其中，BG11培养基与LB培养基按体积比1:1-1:5混合。

BG11培养基配方如下：

LB培养基的配方如下：

本发明中，普通小球藻能够耐受水环境中抗生素的毒性诱导并能去除抗生素与ARGs，特别是对水体中sul1、sul2、tetM、tetQ等典型优势ARGs具有较好的去除效果。进入普通小球藻细胞内的外源ARGs整合位点多位于异染色质区域，从而可能导致外源ARGs在细胞内不表达，这是普通小球藻阻断外源ARGs传播的可能方式之一。普通小球藻用于去除水体中ARGs的安全性较高，不易受到水体中抗生素的诱导及外来ARGs的侵染。地衣芽孢杆菌作为一种水体中广泛存在的有益菌，能够一定程度上阻滞ARGs的水平转移，常被应用于水体中ARGs的去除。藻菌共生体实现了藻细胞和菌体去除ARGs的双重优势，可有效实现水体中sul1、sul2、tetM、tetQ、tetW等ARGs的去除。

参看图1，本发明提出的使用细胞电穿孔法将ARGs质粒导入小球藻细胞与地衣芽孢杆菌体细胞中的方法，成本低廉、操作快捷简单、且穿孔后，小球藻细胞和地衣芽孢杆菌体细胞的成活率高达80％-90％，且成活的小球藻细胞和地衣芽孢杆菌体细胞在培养基中可正常生长、繁殖，但进入藻细胞与菌体细胞的ARGs不在藻细胞与菌体细胞内表达，将穿孔后的藻细胞和菌体细胞再次置于含有藻菌混合溶液的人工污水中，更多的ARGs进入小球藻细胞和地衣芽孢杆菌体细胞内，实现普通小球藻细胞和地衣芽孢杆菌对水体中ARGs的“生物遗传封锁”，进而实现对水体中ARGs的去除。

因此，基于该机理可在待处理ARGs污染水体外加电场，实现脉冲细胞穿孔，促使ARGs高效进入藻细胞与菌体细胞，实现普通小球藻细胞和地衣芽孢杆菌对水体中ARGs的“生物遗传封锁”。

实施例1

取藻细胞浓度为1×10

向人工污水中添加0.011-65.2μg的sul1、0.010-58.6μg的sul2、0.010-58.6μg的tetM、0.011-64.2的μg的tetQ、0.010-58.6μg的tetW，配置出含有ARGs质粒浓度为2.09×10

将上述的BG11-LB培养基接种到150mL的含有ARGs质粒的人工污水中，然后在恒温、恒定光照的无菌室内设置温度为28℃，光照强度设置为120μmol/m

细胞电击穿孔处理：取2mL上述的藻菌混合液，迅速置于冰面，确保冰面覆盖离心管，保持5min后在4℃条件离心后弃去上清液并保留沉淀；在藻菌混合液中加入2mL的cytomix缓冲液，不断吹打使藻菌混合液缓冲液充分混匀，混匀后于10000g/min、0-4℃条件离心2min，弃去上清液，重复此步骤3次；加入5μL人工污水并使用移液枪吹打均匀，并在5μL人工污水中加入100-150μL质量分数为15-20％蔗糖溶液作为保护液；将上述步骤所得的溶液转移进提前预冷5min的电穿孔杯中进行电击脉冲处理(输出电压10-2000V，方波放电时间10-150ms，设置1-3次脉冲重复，每次间隔3-5s)；将电击后的藻菌混合液置于冰盒中冷却15min后，在8000g/min、4℃条件下离心30s，弃去上清液，将所得沉淀加入到藻菌共生体中继续培养5-7天。

对比例

按照实施例1中的步骤，单独接种等量的普通小球藻和地衣芽孢杆菌。

然后使用实时定量PCR检测人工污水中ARGs的相对丰度，结果如表1所示，表中数字表示单种藻细胞体系、单种菌体细胞体系、藻菌共生体系中人工污水中ARGs绝对丰度的降低率。

表1不同体系的ARGs绝对丰度降低率

由表1可知，普通小球藻单种体系、地衣芽孢杆菌单种体系、普通小球藻-地衣芽孢杆菌共生体系均可实现对水体中ARGs丰度的降低。普通小球藻细胞对磺胺类ARGs(sul1、sul2)和四环素类ARGs(tetM、tetQ、tetW)具有明显的生物去除作用，相较之下，地衣芽孢杆菌对水体中ARGs的去除作用相对较弱。但二者形成的藻菌共生体系可在电击后将水体中大部分ARGs吸收入胞内，实现对ARGs的“生物封锁”，普通小球藻-地衣芽孢杆菌共生体可有效实现水体中ARGs的去除。

实施例2

采用藻菌共生体系来降低实际河道污水中的抗生素抗性基因

采集200-500mL的河道污水，检测发现河道水体中ARGs的丰度分别为sul1：1.5×10

将150mL接种了小球藻和地衣芽孢杆菌的BG11-LB培养基与采集的河道水混合，藻菌共生体的初始投加浓度为2.5×10

细胞电击穿孔处理后，继续放置在采集的河道污水中培养，水体中的sul1、sul2、tetM、tetQ、tetW相对丰度分别为：0.3×10

上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明做出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。