外泌体miRNA作为诊断冠心病的分子标志物及其应用

摘要

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及外泌体miRNA作为诊断冠心病的分子标志物及其应用。所述miRNA为miR‑15a‑3p、miR‑18a‑5p、miR‑155‑5p、miR‑92a‑2‑5p、miR‑181a‑5p以及miR‑210‑3p中任一种或两种以上的分子标志物组合，所述外泌体miRNA的具体核酸序列如SEQ NO.4、8、2、13、5、1所示。本发明证明上述六种血浆外泌体miRNA可以作为冠心病的分子诊断标志物；将其制成诊断冠心病的试剂盒、微阵列或生物芯片，通过检测受试者血浆外泌体miRNA的表达量，可以对冠心病进行快速诊断和判定。

说明书

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及外泌体miRNA作为诊断冠心病的分子标志物及其应用。

背景技术

心血管疾病在全世界范围内具有较高发病率和死亡率。《中国心血管病报告2017》显示，我国心血管疾病患者人数高达2.9亿，其中冠心病患者1100万。但目前冠心病的临床诊断仍然存在较大不足，对疑似冠心病患者的诊断不规范，不全面而导致冠心病误诊率和漏诊率均较高，而冠心病患者早发现、早诊断、早治疗至关重要，关系着疾病的发展和预后。目前临床上冠心病诊断的金标准是冠状动脉造影，但因其有费用高、有创性、有检查风险的特点存在缺陷，因此研发一种无创、快速灵敏且低成本的分子诊断方法势在必行。

外泌体是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200nm，具有双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞(免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放外泌体。外泌体可以携带脂质体、蛋白质、mRNA和miRNA到达靶组织，并且可以参与细胞交流，免疫反应以及肿瘤的生长和迁移。

最新研究显示，在疾病状态下外泌体内部的miRNA会发生含量、大小、类型等的变化，与血液中游离的miRNA相比，测量外泌体miRNA作为生物标记具有许多优势。外泌体膜可以有效地保护内含物免受核酸酶降解，从而保持循环血液中外泌体miRNA的完整性和功能性，因此这些特征使得外泌体miRNA可以用于检测冠心病的疾病发展，并且作为诊断冠心病的有效指标。

发明内容

本发明的目的是提供一种外泌体miRNA作为诊断冠心病的分子标志物及其应，为冠心病诊断提供一种有效的诊断工具。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

外泌体miRNA作为诊断冠心病的分子标志物，所述miRNA为miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-155-5p、miR-92a-2-5p、miR-181a-5p以及miR-210-3p中任一种或两种以上的分子标志物组合，所述外泌体miRNA的具体核酸序列如SEQ NO.4、8、2、13、5、1所示。

优选的，所述miRNA为miR-15a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p。

优选的，所述外泌体为血浆外泌体。

上述外泌体miRNA在制备用于诊断冠心病的试剂盒、微阵列或生物芯片中的应用。

检测上述外泌体miRNA表达量的物质在制备诊断冠心病的产品中的应用。

优选的，所述检测上述外泌体miRNA表达量的物质为引物或探针。

一种荧光定量检测所述外泌体miRNA的引物组合，所述的引物组合如下所示：

(1)miR-15a-3p的引物：5’-AACACGCCAGGCCATATTGTG-3’

(1)miR-155-5p的引物：5’-AAGCGACCTTAATGCTAATCGTGA-3’

(2)miR-210-3p的引物：5’-AACAAGCTGTGCGTGTGACA-3’

本发明公开了基于血浆外泌体miRNA的诊断冠心病的分子标志物及其应用。qRT-PCR结果表明，miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-155-5p、miR-92a-2-5p、miR-181a-5p以及miR-210-3p等六种人血浆外泌体miRNA在冠心病患者与健康对照组间差异性表达。利用ROC曲线分析六种血浆外泌体miRNA诊断冠心病患者的效能，结果显示上述六种外泌体miRNA的AUC值分别为0.897、0.885、0.952、0.813、0.774和0.976。将AUC值较高的外泌体miR-15a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p作为分子标志物组合进行考察，效能分析结果显示分子标志物组合的AUC值达到0.992，P<0.001，高于单个指标；灵敏度和特异度分别为100％和92.9％。

本发明证明上述六种血浆外泌体miRNA可以作为冠心病的分子诊断标志物。将其制成诊断冠心病的试剂盒、微阵列或生物芯片，通过检测受试者血浆外泌体miRNA的表达量，对冠心病进行快速诊断和判定：当外泌体miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-155-5p、miR-92a-2-5p、miR-181a-5p以及miR-210-3p中至少一种miRNA表达量下调，或miR-15a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p表达量均下调，则提示该受试者患有冠心病，具有重要的临床应用价值。

附图说明

图1健康对照组与冠心病患者的血浆外泌体TEM图像(比例尺，100nm)；

图2健康对照组与冠心病患者的血浆外泌体粒径分析曲线；

图3三种代表性外泌体特异性标志物的蛋白质印迹；图中CTR，健康对照组；IHD，缺血性冠心病组；

图4差异具有统计学意义的六种血浆外泌体miRNA在健康对照组与冠心病患者的相对表达情况示意图；图中CTR，健康对照组；IHD，缺血性冠心病组；

图5六种血浆外泌体miRNA表达水平的ROC曲线分析；

图6血浆外泌体miR-15a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p组合模型的ROC曲线分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

1)试验试剂

本发明健康对照组和冠心病患者的血浆样本来自于郑州大学第一附属医院。其他所用试剂或耗材为普通市售或本领域技术人员通过公开途径可以获得的。

2)试验方法

使用EDTA抗凝采血管采集人外周血，以2500g离心15min，取上层血浆至2ml无菌管中，置于-80℃冰箱中冻存。从冰箱取出血浆后于25℃水浴中进行解冻，然后转移至离心管中于4℃以3000g离心10min，去除样品中的细胞碎片；去除细胞碎片的离心上清液转移至新的离心管后，于4℃以10000g离心20min，去除样品中杂质。取1.6ml上清液，加入0.4mlExoquick试剂(System Biosciences公司)4℃静置30分钟。离心(3000g×30分钟)后弃上清，再次离心(3000g×5分钟)后弃上清，所得沉淀物即为外泌体。

使用Exoquick试剂盒(System Biosciences公司)提取外泌体。将所得的5μl外泌体悬液加到Formvar-carbon载样铜网上，使用PBS液清洗铜网后放在50μl 1％戊二醛液滴上5min，然后放在100μl ddH

3)分析方法

采用Graphpad Prism 8软件进行统计分析以及作图，符合正态分布的连续变量以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间数据比较采用独立样本t检验；

采用SPSS 22.0软件计算曲线下的面积并作图，评估外泌体miRNA的诊断效能。P<0.05为差异具有统计学意义。

实施例

收集来自14例健康对照和18例冠心病患者的血浆，并在-80℃下及时保存。采集者的基本临床特征见表1；

表1基本临床特征

注：连续变量为均数±标准差(mean±SE)，分类变量用百分比表示。CTR，健康对照；IHD，缺血性冠心病。

使用Exoquick试剂盒(System Biosciences公司)从上述血浆样品中提取外泌体，并将所得外泌体固定于载样铜网上，染色、干燥后，使用JEOL-1230透射电子显微镜对所得外泌体形态进行鉴定；并采用ZetaView PMX 110粒子追踪器和蛋白质印迹对所得外泌体粒径和特异性标志物进行分析和鉴定。其中，TEM图像见图1；纳米粒子追踪分析(NTA)结果见图2；蛋白质印迹结果见图3(Alix，CD 63和Hsp 70)。图1至图3结果表明所提取的囊泡在形态、粒径分布以及特异性标志物标记方面符合外泌体特征。

之前的研究提示有13种外泌体miRNA与冠心病具有关联性，其分别为：miR-301a-5p、miR-19a-3p、miR-133a-3p、miR-155-5p、miR-26a-5p、miR-20a-5p、miR-181b-5p、miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-30e-5p、miR-92a-2-5p、miR-181a-5p以及miR-210-3p；具体核酸序列如SEQ NO.1～13所示；利用qRT-PCR对其进行验证，具体过程如下：

1.提取血浆外泌体总RNA

取适量外泌体于1.5ml EP管中，加入800ul Trizol试剂(Invitrogen公司)，充分混合，裂解10min，12000rpm离心10min取上清。震荡混匀后，4℃放置10min，然后加入200ul氯仿，振荡混匀后，4℃放置10min后进行12000rpm离心(10min)；取上清，加入与上清等体积的异丙醇，加入一定体积的糖原，-20℃过夜，再次以12000rpm于4℃离心10min，弃上清；加入1ml 70％乙醇，于4℃以12000rpm再次离心；待RNA刚变透明时，加入适量Nuclease-freewater，55℃水浴5min，使RNA完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。

2.RNA逆转录cDNA

采用PrimeScript

表2消除RNA中的基因组

逆转录反应体系及反应条件如表3和4所示；

表3逆转录反应体系

表4逆转录反应条件

3.qRT-PCR检测

使用Stepone plus荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)对外泌体miRNA进行分析，每个样品进行三次重复分析。表5为13种miRNA以及cel-miR-39的核酸序列以及其正向引物序列，通用反向引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-3’。引物对均由Umibio公司设计以及合成，并采用NCBI blast比对分析探索引物的灵敏度和特异度。表6和表7分别为qRT-PCR反应体系和反应条件，其中

表5外泌体miRNA核酸序列以及其正向引物序列

表6 qRT-PCR检测反应体系

表7 qRT-PCR检测反应条件

4.结果与分析：

qRT-PCR检测结果显示，miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-155-5p、miR-92a-2-5p、miR-181a-5p以及miR-210-3p在冠心病患者与健康对照组中差异性表达：与健康对照组相比，冠心病患者的六种miRNA中至少一种表达量下调，两组间差异具有统计学意义。六种miRNA在冠心病患者与健康对照组中的具体表达结果见图4。

用Graphpad Prism 8软件进行统计分析以及作图，并利用SPSS 22.0软件计算曲线下的面积，评估外泌体miRNA的诊断效能。六种血浆外泌体miRNA表达水平的ROC曲线分析见图5。

结果显示，miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-155-5p、miR-92a-2-5p、miR-181a-5p以及miR-210-3p对冠心病的诊断效能，即ROC曲线下面积(AUC)分别为0.897、0.885、0.952、0.813、0.774和0.976，P值均<0.05。其中，miR-15a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p三种外泌体miRNA的AUC值最大。

将上述三种外泌体miRNA作为组合模型诊断冠心病。选取上述14例健康对照和18例冠心病，利用SPSS 22.0软件计算曲线下的面积，评估以上3种外泌体miRNA组合对冠心病的诊断效能，结果见图6。

结果显示三种标志物组合的AUC值为0.992(0.971，1)，P<0.001，高于单个指标；检测特异度和灵敏度分别为92.9％和100％。证明该外泌体miRNA组合可作为诊断冠心病的分子标志物：若受试者血浆外泌体中miR-15a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p表达量均下调，则提示该受试者患有冠心病。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 外泌体miRNA作为诊断冠心病的分子标志物及其应用

<130> NONE

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> RNA

<213> 人工合成

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cugugcgugu gacagcggcu ga 22

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<212> RNA

<213> 人工合成

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uuaaugcuaa ucgugauagg gguu 24

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<212> RNA

<213> 人工合成

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uuuggucccc uucaaccagc ug 22

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<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

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caggccauau ugugcugccu ca 22

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<212> RNA

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aacauucaac gcugucggug agu 23

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aacauucauu gcugucggug ggu 23

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uaaggugcau cuagugcaga uag 23

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uucaaguaau ccaggauagg cu 22

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uaaagugcuu auagugcagg uag 23

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