一种基于拉曼光谱实时监测中药配方颗粒提取过程的方法

摘要

本发明提供了一种基于拉曼光谱实时监测中药配方颗粒提取过程的方法，以甘草配方颗粒为例，涉及以拉曼光谱技术进行甘草配方颗粒提取过程中甘草苷和甘草酸含量预测方法，实施步骤包括甘草配方颗粒提取过程的取样、拉曼光谱采集过程、液相分析过程和含量预测模型的建立；本发明通过一种拉曼光谱技术实时采集中药配方颗粒在提取过程中的拉曼谱图信息，对拉曼光谱进行多种预处理方法和特征变量提取方法的优选，通过大数据拟合拉曼光谱图信息与指标成分(甘草苷和甘草酸)含量之间的数学模型，为实现中药配方颗粒提取过程快速实时监测提供了分析方法，有利于提高中药配方颗粒产品质量，促进中药配方颗粒生产的自动化和智能化。

说明书

技术领域

本发明属于中药分析和智能制造领域，涉及一种基于拉曼光谱实时监测中药配方颗粒提取过程的方法。

背景技术

中药配方颗粒是以优质的中药饮片为原料，采用先进工艺，经过提取、浓缩、干燥、制粒等工序精制而成的供医生临床配方使用的单味中药浓缩颗粒。中药配方颗粒在医院应用率飞速增长，与中药饮片、中成药共同服务于中医临床，其经济效益、社会效益均具有极大潜力。同时也对其质量提出了更高的要求，通过跟踪配方颗粒生产过程中有效成分含量的变化，全面加强配方颗粒生产过程中每一道中间体的质量控制势在必行。

提取过程是中药配方颗粒生产的首要环节，提取液的质量直接影响后续生产环节和最终产品质量的均一性和稳定性。目前，提取过程中的质量控制主要依靠人工经验和传统的质量分析方法，前者需要检测人员拥有丰富的经验，可靠性难以保证，后者分析方法费时费力成本高且滞后于生产过程，无法及时反馈生产现状。因此，急需一种快速、经济、非破坏性的实时分析技术推广应用到中药提取生产过程。

拉曼光谱技术是基于拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息。拉曼光谱集光谱分析技术、化学计量学方法和计算机技术为一体，是一种极具发展前景的高新技术，分析方法具备快速、经济和无损等特点。与近红外光谱相比，由于水在近红外光谱和中红外光谱中吸收较强，提取液中成分的信息易被水吸收峰掩盖，而水引起的拉曼信号较弱，因此拉曼光谱更适合于中药配方颗粒提取过程中的分析。但目前尚未发现拉曼光谱应用于中药配方颗粒提取过程控制的相关研究。

本研究针对拉曼光谱分析过程中仪器噪声和大量关联性较差的信息干扰，通过对多种预处理方法和特征变量提取方法的优选，建立了甘草苷和甘草酸含量预测模型，为实现中药提取过程快速实时监测提供了分析方法。

发明内容

针对现阶段中药配方颗粒提取过程中缺乏有效的指标性成分含量实时监测手段，本发明提供了一种便携式拉曼光谱实时采集的方法，通过大数据拟合拉曼光谱图信息与指标成分含量之间的数学模型，从而实现中药配方颗粒提取过程的实时监测。以甘草为例，通过优化分别构建甘草配方颗粒提取过程中指标成分甘草苷和甘草酸的含量预测模型，实现对提取过程的实时监测。

本发明的技术方案如下：

一种基于拉曼光谱实时监测中药配方颗粒提取过程的方法，所述中药为甘草，所述方法包括如下步骤：

(1)甘草配方颗粒提取过程的取样

将甘草饮片加水浸泡，浸泡完成后收集第一个样本，接着升温至沸腾进行提取，在提取过程中每隔10min收集一次样本；

具体的操作为：将甘草饮片加7倍量水浸泡30min，浸泡完成后收集第一个样本，接着升温至沸腾进行第一次提取，在沸腾初始收集第二个样本，之后每隔10min收集一次样本，第一次提取的时间为90min，第一次提取完成后分离提取液，剩余物加水升温至沸腾进行第二次提取，第二次提取的加水量为甘草饮片的6倍，第二次提取的时间为30min，在第二次提取过程中同样每隔10min收集一次样本，第二次提取完成后分离提取液，最后对第一次、第二次提取分离所得提取液的混合液收集一次样本；

取样重复5个批次，每批可以收集得到15个样品，共得到75份样品；

(2)拉曼光谱采集过程

利用便携式拉曼光谱仪实时采集步骤(1)所得样本的拉曼光谱；

便携式拉曼光谱仪采集样本光谱具体参数为：拉曼光谱光源的激发波长为785nm，激光强度为100％，激光功率为300mW，积分时间为10s，采集3次取平均，总采集时间30s，拉曼位移的光谱范围为201.33～3100cm

(3)液相分析过程

利用高效液相色谱测定步骤(1)所得样本中甘草苷和甘草酸含量实际值；

高效液相色谱条件为：色谱柱为Agilent ZorBax SB C

高效液相色谱测定法为：对甘草苷和甘草酸进行线性范围考察，计算甘草苷和甘草酸线性回归方程及范围；精密移取样本1mL，以13000r/min速度离心5min，上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液液相分析，记录色谱图峰面积，代入线性回归方程算得样本中甘草苷和甘草酸含量实际值；

(4)含量预测模型的建立

将步骤(2)采集得到的拉曼光谱与步骤(3)液相色谱结果对应，通过考察不同光谱预处理方法对模型的影响，选出最优光谱变量筛选方法，评估定量模型的性能参数，分别建立甘草苷和甘草酸含量预测模型；

样本通过Kennard-Stone算法以7：3的比例划分校正集与预测集，其中：校正集52个样本，预测集23个样本；

光谱预处理方法包括：SG(Savitzky-Golay)平滑、一阶导数、二阶导数、MSC(多元散射校正)、SNV(标准正态变换)；

光谱变量筛选方法包括：CARS(竞争性自适应重加权算法)、SPA(连续投影算法)、MC-UVE(蒙特卡罗无信息变量消除)、siPLS(联合区间偏最小二乘法)；

建立的定量模型包括PLSR(偏最小二乘回归)模型、BRR(贝叶斯岭回归)模型；

评估模型性能是通过使用四个评价指标考察模型性能，包括：R

(5)实际提取过程中的实时监测

实时采集待测甘草配方颗粒提取过程中样品的拉曼光谱，将采集得到的拉曼光谱信息代入步骤(4)所建立的模型中，即可获得待测样品中甘草苷和甘草酸的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明与人工经验判断相比准确性更高，与传统的液相分析方法相比，无需样品预处理，不需要消耗化学试剂，操作简易；

(2)本发明方法测定时间较短，单个样品检测时间在30s左右；

(3)本发明针对提取过程中质量控制，可实现中药配方颗粒提取过程中的在线实时质量监控，推动中药配方颗粒提取生产过程的数字化、智能化和绿色化，促进了制药行业装备制造水平的提高；

(4)本发明所使用的便携式拉曼光谱仪，仪器使用方便灵活，可直接安装于生产车间，避免大量的资源和成本的浪费。

附图说明

图1为拉曼光谱测定中药配方颗粒提取过程中指标成分含量技术路线图；

图2为甘草配方颗粒提取过程中原始拉曼光谱图；

图3为甘草配方颗粒提取过程中SNV预处理拉曼光谱图；

图4为甘草苷含量预测模型CARS运行结果；

图5为甘草苷含量预测模型SPA运行结果；

图6为甘草苷含量预测模型MC-UVE运行结果；

图7为甘草苷含量预测模型siPLS运行结果；

图8为甘草苷CARS-BRR模型含量预测值与真实值的散点图；

图9为甘草配方颗粒提取过程中SG-13点平滑预处理拉曼光谱图；

图10为甘草酸含量预测模型CARS运行结果；

图11为甘草酸含量预测模型SPA运行结果；

图12为甘草酸含量预测模型MC-UVE运行结果；

图13为甘草酸含量预测模型siPLS运行结果；

图14为甘草酸CARS-BRR模型含量预测值与真实值的散点图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

本实施例提供的是甘草配方颗粒提取过程中甘草苷含量拉曼光谱检测方法，具体按照以下步骤进行：

(1)甘草提取过程的取样

取甘草饮片1kg加入中试提取装置中，加水7L浸泡30min，浸泡完成后收集第一个样本，加热至沸腾开始收集第二个样本，之后每隔10min收集一次样本，第一次提取时间为90min，提取完成后放出提取液，加水6L进行第二次提取，提取时间为30min，每隔10min收集一次样本，最后对两次提取液的混合液收集一次样品。重复5个批次，每批可以收集得到15个样品，共得到75份样品。

(2)拉曼光谱的采集

利用便携式拉曼光谱仪实时采集(1)中提取液样品的拉曼光谱，拉曼光谱仪具体参数为：光源的激发波长为785nm，激光强度为100％(激光功率为300mW)，积分时间为10s，采集3次取平均，总采集时间30s，拉曼位移的光谱范围为201.33～3100cm

(3)液相色谱的分析

供试品溶液的制备：精密移取(1)得到的甘草提取液1mL，以13000r/min速度离心5min，上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

线性与范围：对甘草苷和甘草酸进行线性范围考察，根据下述液相色谱条件，按浓度从低到高分别重复进样3次，以峰面积值为纵坐标，甘草苷及甘草酸浓度(mg/mL)为横坐标，计算线性回归方程及范围。结果显示甘草苷在0.005-0.1592mg/mL线性关系良好，y＝17747x-12.268，R

液相色谱条件为：色谱柱为Agilent ZorBax SB C

液相色谱测定法：吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图峰面积，依据线性回归方程得到提取液指标成分甘草苷和甘草酸含量实际值。

(4)拉曼光谱的预处理

将甘草配方颗粒提取过程拉曼光谱与甘草苷含量液相色谱结果相对应，通过Kennard-Stone算法以7：3的比例划分校正集与预测集，其中校正集52个样本，预测集23个样本。通过比较经SG(Savitzky-Golay)平滑，一阶导数，二阶导数，MSC(多元散射校正)和SNV(标准正态变换)等预处理方法的拉曼光谱数据和原始光谱数据的PLSR定量模型参数，筛选出最适合甘草苷定量模型的预处理方法，不同预处理方法对甘草苷PLSR模型的影响结果见表1，从表中可知在甘草苷模型中，SNV预处理方法如图3所示对模型性能参数提升幅度最大。

表1不同预处理方法对甘草苷PLSR定量模型性能的影响

(5)光谱变量的筛选

通过采用多种光谱变量筛选方法：CARS(竞争性自适应重加权算法)、SPA(连续投影算法)、MC-UVE(蒙特卡罗无信息变量消除)和siPLS(联合区间偏最小二乘法)，排除与指标成分的含量关联性较差的信息，降低数据维度以实现模型快速、精准定量。

5.1 CARS法

在甘草苷预测模型中设置主成分个数为14，算法进化次数为50次。CARS运行结果如图4所示，图4-a为筛选过程中变量个数的变化趋势，变量个数随采样次数的增加而减少；图4-b为交叉验证均方根误差的变化趋势，26次采样之前随着运行次数的增加而减少，26次采样之后随着运行次数的增加而升高，表明可能剔除了与水提取液中甘草酸含量相关的变量；图4-c为回归系数的变化路径，图中“*”表示最小RMSECV所对应的采样次数，图中各线表示不同采样次数回归系数变化路径。根据交叉验证均方差值最小原则，由图4-a可知特征波段变量个数为54。

5.2 SPA法

在甘草苷预测模型中SPA算法运行结果如图5所示，设定选定波长数在1到30之间，当模型的变量数为4时，RMSE处于较低水平，表明此时可得到较为高效的模型，选定的特征波段在全光谱中的分布见图5-b。

5.3 MC-UVE法

在甘草苷预测模型中设置MC-UVE运行次数为500次，主成分数15，以RI(变量可靠度指数)值作为筛选依据，将RI值按降序排列，运行结果如图6所示，确定最佳变量数为18。

5.4 siPLS法

在甘草苷预测模型中通过siPLS算法运行结果如图7所示，将整个光谱平均分为13个间隔，并对子间隔组合计算，联合其中4个子区间[1,2,5,7]，当主成分数为4时模型性能最佳，RMSECV为0.0297。

(6)甘草苷含量预测模型的建立

通过建立甘草配方颗粒提取过程中甘草苷含量与筛选后拉曼光谱之间PLSR和BRR的甘草苷含量预测模型，比较两个模型的性能参数结果见表2。从表中看出，通过特征波段的筛选能够在确保模型性能的基础上大幅减少对光谱变量的使用，其中，CARS变量筛选方法是甘草苷含量预测的最佳方法。CARS-BRR甘草苷含量预测模型具有最优性能，如图8为CARS-BRR模型甘草苷含量预测值与参考真实值的散点图，甘草苷含量液相参考值与拉曼光谱的预测值相关性较高，甘草苷模型预测集相关系数(R

表2不同变量筛选方法甘草苷模型结果比较

实施例2

本实施例提供的是甘草配方颗粒提取过程中甘草酸含量拉曼光谱检测方法，甘草配方颗粒提取过程拉曼光谱采集和液相检测方法由实施例1中步骤(1)-(3)得到，将提取过程中提取液甘草酸液相数据与采集得到的拉曼光谱对应建立甘草酸含量预测模型，具体按照以下步骤进行：

(1)拉曼光谱的预处理

将甘草配方颗粒提取过程拉曼光谱与甘草酸含量液相色谱结果相对应，通过Kennard-Stone算法以7：3的比例划分校正集与预测集，其中校正集52个样本，预测集23个样本。通过比较经SG(Savitzky-Golay)平滑，一阶导数，二阶导数，MSC(多元散射校正)和SNV(标准正态变换)等预处理方法的拉曼光谱数据和原始光谱数据的PLSR定量模型参数，筛选出最适合甘草酸定量模型的预处理方法，不同预处理方法对甘草酸PLSR模型的影响结果见表3，从表中可知在甘草酸模型中，SG-13点平滑预处理方法如图9所示对模型性能参数提升幅度最大。

表3不同预处理方法对甘草酸PLSR定量模型性能的影响

(2)光谱变量的筛选

通过采用多种光谱变量筛选方法：CARS(竞争性自适应重加权算法)、SPA(连续投影算法)、MC-UVE(蒙特卡罗无信息变量消除)和siPLS(联合区间偏最小二乘法)，排除与指标成分的含量关联性较差的信息，降低数据维度以实现模型快速、精准定量。

2.1 CARS法

在甘草酸预测模型中设置主成分个数为7，算法进化次数为50次。CARS运行结果如图10所示，29次采样之前随着运行次数的增加而减少，29次采样之后随着运行次数的增加而升高；根据交叉验证均方差值最小原则，由图10-a可知特征波段变量个数为36。

2.2 SPA法

在甘草酸预测模型中SPA算法运行结果如图11所示，设定选定波长数在1到25之间，当模型的变量数为3时，RMSE最小，表明此时筛选得到最高效模型，选定的特征波段在全光谱中的分布见图11-b。

2.3 MC-UVE法

在甘草酸预测模型中设置MC-UVE运行次数为1000次，主成分数15，以RI(变量可靠度指数)值作为筛选依据，将RI值按降序排列，运行结果如图12所示，确定最佳变量数为50。

2.4 siPLS法

在甘草酸预测模型中通过siPLS算法运行结果如图13所示，将整个光谱平均分为10个间隔，并对子间隔组合计算，联合其中4个子区间[1,4,5,8]，当主成分数为12时模型性能最佳，RMSECV为0.0413。

(3)甘草酸含量预测模型的建立

通过建立甘草配方颗粒提取过程中甘草酸含量与筛选后拉曼光谱之间PLSR和BRR的甘草酸含量预测模型，比较两个模型的性能参数结果见表4。从表中看出，CARS变量筛选方法是甘草酸含量预测的最佳方法。CARS-BRR甘草酸含量预测模型具有最优性能，如图14为CARS-BRR模型甘草酸含量预测值与参考真实值的散点图，甘草酸含量液相参考值与拉曼光谱的预测值相关性较高，甘草酸模型预测集相关系数(R

表4不同变量筛选方法甘草酸模型结果比较

以上实施例并非仅限于本发明的保护范围，所有基于本发明的基本思想而进行的修改或变动都属于本发明的保护范围。