蛋白质组合物及其应用与ST段抬高型心肌梗死早期筛查诊断试剂盒

摘要

本发明提供了一种蛋白质组合物及其应用与ST段抬高型心肌梗死早期筛查诊断试剂盒，组合物由前列腺素H2D‑异构酶、H‑钙粘着蛋白/H‑钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2组成，利用现代生物学技术和生物信息学分析对前列腺素H2D‑异构酶、H‑钙粘着蛋白/H‑钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2的检测及功能进行了初步研究，高浓度的前列腺素H2D‑异构酶、H‑钙粘着蛋白/H‑钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2具有早期预测ST段抬高型心肌梗死发生的用途，可应用于制备检测制剂或医疗器械来早期干预，对早期ST段抬高型心肌梗死有着较好的临床诊断效能和潜在的巨大应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及蛋白质组合物及其应用与ST段抬高型心肌梗死早期筛查诊断试剂盒。

背景技术

急性冠脉综合征是指冠状动脉内不稳定的粥样硬化斑块破裂或糜烂继发新鲜血栓形成所导致的心脏急性缺血综合征，分为ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不稳定性心绞痛。引起急性冠脉综合征的冠状动脉疾病仍然是全球范围内主要的死亡原因之一。其中ST段抬高型心肌梗死是指急性心肌缺血性坏死，冠脉血流急剧减少或中断，使相应的心肌严重而持久的急性缺血所致。ST段抬高型心肌梗死发病凶险预后不良，占急性冠脉综合征总死亡率的29％-47％。尽管ST段抬高型心肌梗死患者药物和介入治疗取得了很大的进步，但全球范围内ST段抬高型心肌梗死致残率仍居高不下，给人类生命健康带来了严重的威胁，再加上高额的医疗支出，已成为当前公共卫生领域的一大难题。

目前临床ST段抬高型心肌梗死诊疗过程中的一个困境是如何对患者的危险性进行正确评价以及如何早期诊断ST段抬高型心肌梗死。ST段抬高型心肌梗死的早期诊断需借助于心电图的数据、生物标志物以及临床专业人员的经验。然而，心电图对ST段抬高型心肌梗死早期诊断的敏感性低于50％，临床医生的评估也不能准确诊断ST段抬高型心肌梗死，加之，部分患者没有胸痛的症状或心电图没有ST段抬高的表现，因此，心脏的生物标志物成为诊断ST段抬高型心肌梗死的金标准。反映心肌损伤和坏死的生物标志物包括心肌肌钙蛋白(cTn)T和I、肌酐磷酸激酶B和肌红蛋白，以及C-反应蛋白、脑钠肽及氨基末端脑钠肽前体等为代表的一系列新生物标志物。但是这些传统或新的生物标志物并不能全面的反映ST段抬高型心肌梗死疾病的进展及预后状态，在临床敏感性和特异性上存在局限性。比如cTn T在心脏具有高度特异性，但是要使其浓度上升高于测定的第99个百分位数参考上限(URL)可能需要花费数小时，而且其仅在心肌梗死期间升高，因此对疾病的早期诊断及预后价值很小。因此，急需寻求新型的、可充分反映心肌功能、心肌损伤后程度或发病时间的更高敏感度和特异性的生物标志物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种蛋白质组合物。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述蛋白质组合物的应用。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种ST段抬高型心肌梗死早期筛查诊断试剂盒。

本发明采用的技术方案是：

一种蛋白质组合物，由前列腺素H2 D-异构酶抗体、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白抗体和Rho GDP解离抑制因子2抗体组成。

上述蛋白质组合物在制备ST段抬高型心肌梗死检测制剂或医疗器械方面的应用。

优选的，上述蛋白质组合物的应用，所述医疗器械为ST段抬高型心肌梗死早期筛查诊断试剂盒。

一种应用上述蛋白质组合物的ST段抬高型心肌梗死筛查试剂盒，包含3种蛋白检测组：

所述前列腺素H2 D-异构酶标准品浓度为0，0.78，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗前列腺素H2 D-异构酶抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH 7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为86％氯化钠、4.5％磷酸氢二钠、3.5％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；

所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/L硫酸；

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:100倍稀释后进行检测；

2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入250μl样本稀释液，吸取250μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取250μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；

b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；

4)数据处理：

使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值。

所述H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白标准品浓度为0，1.25，2.5，5，10，20，40，80ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；

所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/L硫酸；

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min后进行检测；

2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入250μl样本稀释液，吸取250μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取250μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；

b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；

4)数据处理：

使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值。

所述Rho GDP解离抑制因子2标准品浓度为0，25，50，100，200，400，800，1600ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗Rho GDP解离抑制因子2抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；

所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/L硫酸；

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min后进行检测；

2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入250μl样本稀释液，吸取250μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取250μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；

b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；

4)数据处理：

使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值。

本发明的有益效果是：

本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对前列腺素H2 D-异构酶、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2的检测及功能进行了初步研究，高浓度的前列腺素H2 D-异构酶、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2具有早期预测ST段抬高型心肌梗死的用途，可应用于制备检测制剂来早期干预；同时，依赖三种蛋白浓度分层分析还可应用于制备ST段抬高型心肌梗死筛查诊断试剂盒，对早期ST段抬高型心肌梗死有着较好的评价效能和潜在的巨大应用价值。

附图说明

图1是蛋白质组学检测到的含有前列腺素H2 D-异构酶、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2的网络互作图；

图2是ELISA检测的前列腺素H2 D-异构酶、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2在正常对照，不稳定性心绞痛及ST段抬高型心肌梗死患者中的含量，其中，PTGDS：前列腺素H2 D-异构酶；CDH13：H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白；ARHGDIB：Rho GDP解离抑制因子2；对照组：Control；不稳定心绞痛组：unstable angina(UA)；ST段抬高型心肌梗死：ST-segment elevation myocardial infarction(STEMI)；

图3是DIA固定采集窗口。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

1.人体血浆样本的收集

ST段抬高型心肌梗死组及不稳定性心绞痛组为于急诊就诊的ST段抬高型心肌梗死及不稳定心绞痛患者，冠脉造影阴性患者为对照组。每位患者自周围静脉采全血2ml，立即于2500rpm离心15分钟，分离上层血浆。再将分离的血浆分为数等份，置于血浆收集管中，置于-80℃冰箱冻存待检。

2.蛋白质组学检测

1)血浆蛋白质组检测

采用数据非依赖采集(Data independent acquisition，DIA)技术检测三组各混合样本中的蛋白质。

2)蛋白提取

a)每个样品取40μl血浆，以结合缓冲液(试剂盒：Binding Buffer)十倍稀释。

b)除去柱子上的盖子，以纸吸去贮存缓冲液。

c)除去柱底部的尖咀，放入大小适合的收集管。

d)加入结合缓冲液，让其靠重力流过柱体。

e)将柱子放入一个新的大小适合的收集管中。

f)加入稀释后的样本，让其靠重力流过柱体。

g)以600μl结合缓冲液清洗柱体。

h)再次以600μl结合缓冲液清洗柱体收集上三步的洗脱组份，即为去除白蛋白/IgG后的样本真空冷冻干燥后备用。

i)将冻干的样品加入300μl SDS裂解进行复溶。

j)将溶液在室温下12000×g离心10min，取上清，并再次离心取上清。

k)上清即为样品的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用。

3)样品定量

样品按定量原理：BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu

按照BCA方法定量样品中蛋白质。实验步骤如下：

a)按照BCA试剂盒说明书，根据buffer A:Buffer B＝50:1(v/v)配置所需体积的显色液。

b)取出部分待测蛋白溶液，加超纯水进行稀释(防止浓度过高，超出标准曲线工作范围)。

c)准备一个干净的96孔板，加入如下梯度的BSA标准蛋白溶液：0，1，2，4，8，12，16，20μl，然后每个孔加入相应体积的超纯水补充体积至20μl。

d)将2μl待测蛋白溶液加入96孔板，每个样品设置三个复孔，同样补充体积至20μl。

e)各孔内加入200μl预配置的显色液(显色液必须现用现配)，37℃反应30min。

f)使用酶标仪进行吸光度值测定(波长562nm)。

g)根据标准蛋白溶液的已知浓度和吸光度值计算标准曲线，代入待测样品的吸光度值，即可算得蛋白浓度值。

4)SDS-PAGE电泳样品检测实验

a)每个样品取10μg，采用12％SDS-PAGE进行分离。

b)分离后的凝胶采用考马斯亮兰染色法进行染色。具体操作如下：固定2小时；染色12小时；水洗至背景清晰。

c)染色后的凝胶应用ImageScanner扫描仪进行扫描，扫描模式为灰度模式，光密度值为300dpi。

5)胰蛋白酶酶解

具体步骤如下：

a)根据测定的蛋白浓度，每个样品取50μg的蛋白，并用裂解液将不同组样品稀释调整到相同的浓度和体积。

b)在以上蛋白溶液中加入DTT，使得DTT的终浓度为4.5mM，混匀，在55℃孵育30min。

c)在冰上进行冷却直到达到室温(用手感觉时溶液不能太冷也不能太热)。

d)加入相应体积的碘乙酰胺，使得终浓度为9mM，充分混匀，室温避光放置15min。

e)在以上溶液中加入6倍体积的丙酮沉淀蛋白，-20℃放置4小时以上或者过夜。

f)4℃,8000×g离心10分钟收集沉淀，挥发丙酮2-3min。

g)加入100μl TEAB2复溶沉淀，加入1/50样品质量的1mg/ml胰酶Trypsin-TPCK，并于37℃消化过夜。

h)加磷酸调PH值为3左右终止酶解反应。

6)肽段除盐

酶解后的肽段采用RP-C18固相萃取柱脱盐。

a)平衡：甲醇1ml(含0.1％TFA)冲洗1次，90％乙腈-水1ml含0.1％TFA)冲洗1次，水(含0.1％TFA)冲洗1次；

b)样品：样品加1ml(含0.1％TFA)充分溶解，上样，靠重力自然吸附3次；

c)冲洗：0.1％三氟乙酸-水冲洗3次；

d)洗脱：用90％乙腈-水(含0.1％TFA)靠重力自然洗脱3次。

e)复溶：真空抽干，60μL 0.1％甲酸-水复溶。

7)LC-MS/MS高分辨质谱检测

质谱进样前，每个样品按照体积比iRT:待测样品＝1:10的体积比混合，作为内标。iRT标准品(Biognosys,ThermoFisher)是包含11条合成的自然界中不存在的肽段的混合试剂盒，其稳定性、灵敏性以及保留时间都经过优化，相对比较稳定，而且不会对待测样品产生影响，因此，被广泛用做色谱系统的校正以及定量质控。本实验中，我们将iRT标准肽段溶解为浓度为10×的溶液，2-8℃保存(保质期12周)。

i)高pH液相分离

a)样品：所有酶解后的样本取等量肽段混合，使用Agilent 1100HPLC系统，在pH＝10的流动相中进行组分分离。

b)分离条件

色谱柱：Agilent Zorbax Extend–C18窄径柱，2.1×150mm，5μm。

检测波长：紫外210nm和280nm。

流动相A相：ACN-H2O(2：98，v/v)，流动相B相：ACN-H2O(90：10，v/v)(两个流动相均用氨水调节pH至10)，流速：250μl/min。

梯度洗脱条件：0-10min,2％B；10-10.01min,2-5％B；10.01-37min,5-20％B；37-48min,20-40％B；48-48.01min,40-90％B；48.01-58min,90％B；58-58.01min,90-2％B；58.01-63min,2％B。

组份收集：第10分钟开始，依次每隔一分钟收集洗脱液到1-10号离心管中，按照1→10的顺序循环收取馏分。共收集10个组份，真空冷冻干燥抽干，样品冷冻保存待上质谱。

ii)液质联用条件

a)质谱扫描参数见表1。

表1 DDA质谱条件

b)液相洗脱梯度见表2。

流速300nl/min，buffer A为0.1％FA水溶液，buffer B为0.1％FA/80％ACN/20％水。

表2 DDA色谱条件

每个样品酶解后的肽段单独上机采集，扫描范围设置为350-1250m/z，isolationwindow为26m/z，窗口分隔见下图3。

DIA质谱扫描参数见表3。

表3 DIA质谱条件

DIA液相洗脱梯度见表4。

流速300nl/min，buffer A为0.1％FA水溶液，buffer B为0.1％FA/80％ACN/20％水。

表4DIA色谱条件

8)数据解析

此操作的目的是将质谱输出的谱图与fasta库产生的理论谱图进行匹配，将机器信号转变为肽段和蛋白序列信息，然后结合序列信息、肽段保留时间、碎片离子信息等进行谱图库的建立，便于后续的DIA分析。

LC-MS/MS原始文件导入Spectronaut Pulsar软件进行搜库建库。主要参数见表5。

表5 DDA建库参数

DIA原始数据的处理使用Spectronaut Pulsar软件完成，关键步骤如下(详细说明参见软件用户手册)。

a)打开Spectronaut Pulsar软件的Analysis模块，选择“+”新建分析；

b)根据软件提示逐步完成参数设置，开始分析；

c)分析完成，进入“Report”模块导出定量数据。

蛋白质组学检测到的含有前列腺素H2 D-异构酶、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2的网络互作图见图1。

实施例2

酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

采用ELISA法在新收取的血浆样本中对前列腺素H2 D-异构酶、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2进行了验证。实验原理：待测蛋白的抗体预埋于96孔板底部，标准品和样品加入后，其中的待测蛋白会与抗体结合。在去除未结合的基他底物后，加入待测蛋白的生物素共轭抗体。冲洗，加入抗生物素共扼辣根过氧化物酶标记抗体(HRP)，通过冲洗去除未结合的HRP。加入显色剂，终止反应后，测量液体的吸光度。

包被有前列腺素H2 D-异构酶抗体的多孔板

前列腺素H2 D-异构酶纯品作为标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

生物素标记抗体稀释液

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中

所述前列腺素H2 D-异构酶标准品浓度为0，0.78，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗前列腺素H2 D-异构酶抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH 7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为86％氯化钠、4.5％磷酸氢二钠、3.5％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；

所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/L硫酸。

具体操作方法为：

1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:100倍稀释后进行检测；

2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入250μl样本稀释液，吸取250μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取250μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；

b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；

4)数据处理：

使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值。结果见附图2。

包被有H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白抗体的多孔板

H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白纯品作为标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

生物素标记抗体稀释液

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白标准品浓度为0，1.25，2.5，5，10，20，40，80ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；

所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/L硫酸。

具体操作方法为：

1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min后进行检测；

2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入250μl样本稀释液，吸取250μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取250μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；

b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；

4)数据处理：

使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值。结果见附图2。

包被有Rho GDP解离抑制因子2抗体的多孔板

Rho GDP解离抑制因子2纯品作为标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述Rho GDP解离抑制因子2标准品浓度为0，25，50，100，200，400，800，1600ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗Rho GDP解离抑制因子2抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；

所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/L硫酸；

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min后进行检测；

2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入250μl样本稀释液，吸取250μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取250μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；

b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；

4)数据处理：

使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值。结果见附图2。

综上通过实施例1，发现ST段抬高性心肌梗死患者血浆中前列腺素H2 D-异构酶、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白较对照组和不稳定性心绞痛组上调；Rho GDP解离抑制因子2较对照组和不稳定性心绞痛组下调。前列腺素H2 D-异构酶可作为PGD2的催化酶，催化PGH2转化为PGD2，还可作为亲脂配体结合蛋白分泌到细胞膜外。前列腺素H2 D-异构酶存在于人的心血管系统，包括平滑肌细胞和内皮细胞以及冠状动脉粥样硬化斑块，从而分泌到冠状动脉循环中。已经证明稳定性心绞痛、原发性高血压和肾功能不全患者中前列腺素H2 D-异构酶水平升高。研究表明，尿和血清中前列腺素H2 D-异构酶的水平可作为糖尿病和高血压肾脏损伤的敏感指标。冠脉循环中前列腺素H2 D-异构酶水平升高可能与心绞痛有关。H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白是一种独特的钙粘蛋白分子，研究表明H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白在血管生成中具有重要的作用。研究表明H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白是血管平滑肌细胞膜中的一种非典型脂蛋白结合蛋白。在肿瘤血管中过度表达，可促进血管新生。H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白在动脉粥样硬化区受损的血管内皮细胞、平滑肌细胞及主动脉和冠状动脉中大量表达，与主动脉及冠状动脉粥样硬化的进展有关。Rho GDP解离抑制因子2通过抑制GDP以及随后GTP的结合来调节GDP/GTP的交换反应。Rho GDP解离抑制因子2可存在于造血细胞，白细胞及内皮细胞中，其敲除或靶向降解可作为血管重塑和心肌肥大的治疗干预靶点。

针对实施例1中蛋白质组学对于ST段抬高性心肌梗死患者筛查诊断的结果，实施例2采用ELSIA方法再次证实了与对照组和不稳定性心绞痛组相比，ST段抬高型心肌梗死患者血浆中前列腺素H2 D-异构酶、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白的浓度较高，Rho GDP解离抑制因子2浓度较低。结果与实施例1一致，见图2。

以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。