刺激细胞外基质合成的葡糖胺的氨基酸衍生物和包含其的药物组合物

摘要

本专利申请涉及具有式1一般结构的葡糖胺的新型氨基酸衍生物或包含其作为单一活性成分的药物组合物或包含其与一种或多种其它活性成分联合的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，所述疾病主要涉及调节构成一般结缔组织(更具体地说是软骨组织)细胞外基质(ECM)的大分子的更新。这种葡糖胺的氨基酸衍生物刺激细胞外基质(ECM)合成。

说明书

背景技术

众所周知，人体及其组成器官由通常称为结缔组织的组织支撑和保持在一起，该术语表示其结构和支撑作用。然而，结缔组织的功能远远超出了支撑功能，其作为其他组织的纽带，参与机体的防御机制，并确保非血管化组织的营养。

所有不同类型的结缔组织由两种基本成分组成:细胞群和细胞外基质(ECM)，后者由无定形成分和纤维成分组成，其中这两种成分各自的相对比例根据所考虑的结缔组织的类型而变化。

细胞外基质(ECM)是存在于质膜附近的细胞外物质的有组织的网络，在决定细胞的形状和活性方面起着关键作用。它的组成部分受到不同生理过程正常运行所必需的持续重塑，其节奏随着年龄的增长而减慢。因此，不充分的重塑是不同疾病发病的基础，这些疾病涉及运动器官和皮肤(Naba et al,2015)。

一种具体类型的特殊结缔组织是软骨组织。软骨实际上被定义为支撑结缔组织，由单一细胞类型、软骨细胞和丰富的细胞外基质(ECM)组成。软骨细胞占所述组织的2-5％，负责细胞外基质成分的产生和后者的持续重塑。基质由胶原纤维和大分子聚集体以及蛋白聚糖组成，其中最具代表性的是聚蛋白多糖。软骨组织要进行连续重塑，该过程涉及在合成代谢和分解代谢途径之间保持微妙的平衡。

影响软骨组织的主要病理是骨关节炎(OA)，这是形成肌肉骨骼疾病的一部分的最常见类型的关节疾病，其特征是疼痛、红斑、肿胀、关节周围和关节内积液、运动障碍和关节水平的功能障碍。事实上，这种病理的特征是关节软骨基本物质的结构改变，决定了其磨损和纤维分离，并降低了其在加载和运动过程中吸收机械应力的能力；接下来，下面的骨骼，尽管会反应以增加成骨作用，但最终会变形。在缓慢演变的形式中，OA可以被认为是关节磨损的一种病理状态，一种衰老的表现，而在快速变化的形式中，它代表了一种真正的疾病。OA主要表现为退行性变，但也或多或少地表现为强烈的炎症迹象。在OA的发展过程中，合成代谢和分解代谢过程之间的失衡是造成软骨基质重塑的原因。促炎细胞因子的分泌导致新基质合成的减少，而软骨的侵蚀是金属蛋白酶过度激活的结果。骨关节炎过程的最终结果是受影响的关节完全阻塞，功能丧失。

在OA治疗中，已经知道了不同类型的方法，从预防措施到药物、物理和外科治疗。

除了与假体置换手术有关的OA的外科治疗(其通常导致疼痛症状的完全消失和关节功能的改善，但是具有进行外科手术所代表的所有限制和植入假体的非无限制持续时间)，不幸的是，所有针对OA的治疗方法的目标仅仅是通过疼痛控制、保持关节功能和减缓关节退化来改善患者的生活质量。

进入本发明的应用领域，有必要将注意力集中在OA的药理学治疗上，其药物可分为旨在对抗疼痛的对症药物和作用于关节软骨结构的称为软骨保护剂的药物。非甾体抗炎药(NSAIDs)代表治疗疼痛和疾病炎症阶段的首选疗法。尚未发现一种更有效或更适用于OA对症治疗的NSAID。NSAID类型的选择取决于耐受性、与分子相关的某些特征(如作用的持续时间和选择性)、以及临床反应。在最常用的药物中，我们可以提到:布洛芬、尼美舒利、萘普生、酮洛芬、双氯芬酸。这些药物的使用限制与它们的副作用有关，特别是对胃的危害，这使得它们不能连续使用。扑热息痛因其镇痛作用而被广泛使用，尤其是在有胃肠道风险或有其他非甾体抗炎药禁忌症的患者中。在意大利从几年前开始阿片类镇痛药可用于治疗OA，适用于不耐受NSAID或对非阿片类镇痛药反应不佳的受试者。其中最常用的是可待因和曲马多，它们也可以联合使用或组合使用。可以在特殊环境中偶尔使用的其他疗法是使用可的松制剂或基于透明质酸的关节内浸润，但其随着时间的推移仅具有有限的作用。

在另一个层面上，软骨保护药物代表了OA治疗的新的治疗前景之一，因为它们直接影响软骨代谢，抑制退化过程和/或刺激软骨细胞合成新的ECM。从对这些新物质进行的研究来看，显示出更大功效的是天然来源的葡糖胺，它应该能够抑制软骨炎症因子的产生，阻断其降解并促进新软骨的产生。虽然这一作用的其他候选物质仍在研究中，包括透明质酸本身、硫酸软骨素、双醋瑞因以及大豆和鳄梨提取物，但它们的作用机制尚未完全阐明，因此它们的有效性未被广泛接受(Cutolo et al,2015)。

关于未来的治疗前景，主要的希望来自于组织工程的进展：“自体软骨细胞的植入”，即移植取自同一患者的软骨细胞，正在获得良好的结果。然而，这仍然是一种有限的干预措施，似乎仅在年轻患者、某些关节和未影响下层骨骼的中度病变情况下起作用(B.L.Kidd et al,2007)。

就流行病学而言，OA影响所有脊椎动物，在人类中，这种疾病的发病率非常高，这种疾病困扰着世界上很大一部分人口(Loeser et al,2012)，特别是中老年人口。在50岁至65岁的人群中，超过80％的人可以发现OA的放射迹象，尽管在同一年龄组中，约20％的女性和15％的男性存在这种症状。在意大利，这种疾病影响着约400万人，是在普通医疗实践中寻求医疗检查的最常见原因之一。

如上所述，随着平均寿命的提高，OA已成为一个最重要的社会问题，不仅对患者的生活质量产生负面影响，而且还涉及相当大的社会经济负担，这不可避免地会给国家卫生系统带来压力。

因此，本发明的总体目标是实现一种新的药理学途径，其能够停止这种病理的进化过程，并因此避免可能由此产生的破坏性损伤，同时能够使软骨重新获得非常类似于健康软骨的结构，并因此尽可能地消除上述病理方面。

本发明的其他优点将从以下通过非限制性实施例提供的实施方案的详细描述中变得显而易见。

发明内容

已经发现本专利申请中公开的化合物具有令人惊讶和意想不到的生物学效果。具体而言，所提及的化合物或包含它们的药物组合物显示出适当刺激结缔组织，特别是软骨组织中的细胞外基质成分的能力，使其重新获得与先前存在的健康结构完全相似的结构，或者是没有退化迹象例如骨关节炎性质的软骨。

所述发明化合物通常由葡糖胺的氨基酸衍生物组成，更优选由葡糖胺的N-乙酰基-苯丙氨酸衍生物代表，随后的大部分实验测试都集中在该化合物上。

刚刚陈述的内容通常来源于发明人用体外和体内方法进行的深入研究，能够验证葡糖胺的创新氨基酸衍生物的作用机制和生物活性。

已经在兔和小鼠的OA体内模型中研究了上述类型的化合物，更具体地说是葡糖胺的N-乙酰基-苯丙氨酸衍生物，发现在兔或小鼠的OA膝盖中关节内施用所述化合物刺激了新的ECM的合成，使软骨恢复到非常类似于健康软骨、没有OA的结构，因此表明这类化合物具有重要的再生作用。

为了阐明分子机制，已使用原代培养的软骨细胞在体外研究葡糖胺衍生的N-乙酰-苯丙氨酸。用IL-1刺激软骨细胞，以研究由激活蛋白(AP)-1控制的炎症途径。具体地说，所述N-乙酰-苯丙氨酸葡糖胺衍生物首先抑制两种激酶(JNK和p38)的磷酸化出乎意料地有效，并因此影响AP-1组分之一的c-jun的活化。然后分析了干扰由转录因子核因子κB(NF-κB)控制的炎症途径的功效，所述NF-κB转而由两种IKKα和IKKβ激酶组成的IKK复合物控制。所述葡糖胺的N-乙酰-苯丙氨酸衍生物抑制IKKα激酶在细胞核中的移位(该激酶首先在该细胞区发挥其活性)，选择性地抑制IKKα的激酶活性，但不抑制IKKβ的激酶活性。

最后，为了了解哪些细胞内途径被来源于葡糖胺的所述N-乙酰基-苯丙氨酸激活以刺激ECM的合成，在人原代软骨细胞中进行了进一步的体外研究。为了模拟生理条件，对人软骨细胞进行了三维培养，将细胞培养成球形。结果出乎意料地显示，上述发明化合物刺激软骨组织特有的II型胶原的合成。此外，通过这些实验发现，如果细胞同时用葡糖胺和所述衍生自葡糖胺的N-乙酰基-苯丙氨酸处理，则获得了协同效应，产生了甚至更多的II型胶原，诱导了生长因子IGF-1(胰岛素生长因子)和转录因子SOX-9(与Sry相关的含HMG bOX的基因)的表达，它们控制着ECM的合成，从而决定了这种通过两种分子的结合而发挥的有趣的合成代谢效应。

另一个重要的和意想不到的发现是，上述葡糖胺的氨基酸衍生物，更具体地说，葡糖胺的N-乙酰基-苯丙氨酸衍生物能够刺激透明质酸合成酶(HAS-2)的表达，从而刺激透明质酸(HA)的产生。

为了实现本发明目的的另一个有希望的发现是，上述类型的本发明化合物已被证明对原代人成纤维细胞也特别有效，当所述原代人成纤维细胞在三维空间中生长时(如球体)，相对于在没有所述创新化合物的情况下生长的球体，产生了相当高量的I型胶原。此外，葡糖胺的N-乙酰-苯丙氨酸衍生物也被添加到用UVB刺激的成纤维细胞的培养基中，以在某种程度上模拟太阳UVB的照射，发现该分子能够抵消由UVB刺激的炎症途径，并且还能够恢复I型胶原的合成(I型胶原的合成被UVB处理阻断)。这一发现立即引起了发明人对这类产品干预皮肤ECM重塑的能力的兴趣，皮肤ECM中更新的相对改变导致皮肤萎缩，从而导致皮肤老化，并且在某些情况下甚至发生皮肤癌过程。

因此，从上述体内和体外研究中描述的有希望的结果开始，以下发明的发明人开发了上述葡糖胺的创新氨基酸衍生物的用途，其通常包括治疗或预防主要涉及调节构成结缔组织(特别是软骨组织)的细胞外基质的大分子的更新的病理，其将为了说明性和非限制性的目的在下面的详细描述中描述。

受多个所附权利要求保护的本发明的其他特征在以下对其一个或多个具体实施方案的详细描述中描述。

具体实施方式

应当注意的是，在下文中，将通过非限制性实施例的方式仅示出本发明的一些可能的实施方案，基于所确定的具体技术方案，可以描述其许多其他实施例。

本专利申请涉及葡糖胺的创新氨基酸衍生物或包含其作为单一活性成分的药物组合物或包含其与一种或多种其它活性成分联合的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，所述疾病主要涉及调节构成结缔组织(更具体地说是软骨组织)的ECM的大分子的更新。

因此，本发明的总体目标是提供一种新的药理学方法，该方法能够阻止骨关节炎的演化途径，从而防止由此可能导致的破坏性损伤。

根据本发明的另一个目的是提供一种能够刺激新细胞外基质的内源性合成的药物。

更具体的目的是使软骨重新获得与健康软骨非常相似的结构，也就是说，消除由于骨关节炎过程引起的退化，或者消除由于其他原因(包括由于剧烈运动活动的高压力)引起的任何退化，适当刺激细胞以产生基质成分以及胶原蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和聚集蛋白聚糖。

另一个目的涉及这类产品的前述能力，由于成纤维细胞的活性而恢复合成I型和II型胶原，干预皮肤ECM的重塑，并因此通过对抗皮肤萎缩而被适当地用于皮肤老化的治疗，并且在某些情况下预防皮肤癌和提出治疗皮肤癌的新治疗策略。

所述本发明的化合物通常由葡糖胺的氨基酸衍生物组成，其具有如下通式1的结构:

(1)

其中所述基团R代表氨基酸、氨基酸的N-酰基衍生物或肽的N-酰基衍生物，并且其中所述葡糖胺的胺基通过脲键结合到所述氨基酸的羧基侧链。

本发明的一个特别优选的实施方案提供了所述本发明化合物优选由衍生自葡糖胺的N-乙酰基-苯丙氨酸表示，其具有如下式2的结构:

(2)

根据本发明的具有式1的化合物或具有式2的化合物可以作为药物组合物存在，所述药物组合物单独含有所述化合物或与一种或多种活性成分以及一种或多种赋形剂或载体结合，所述赋形剂或载体适合于根据良好制造技术的众所周知的标准和药物法规而选择和制备的施用途径。

根据上述实验证据，本发明的一个优选实施方案旨在提供一种适用于胃肠外施用途径，更具体地说，适用于关节内或经皮施用途径的药物组合物，通过实施关节内或经皮使用的注射溶液，该注射溶液由浓度为0.5重量％至4.5重量％、更优选1重量％至3重量％的具有式1的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或立体异构体以及适用于所述施用途径的合适且已知的载体组成。

进一步优选的实施方案提供了上述药物组合物由活性成分组合和葡糖胺和/或透明质酸组成，所述活性成分由具有式1的本发明葡糖胺的氨基酸衍生物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或立体异构体组成，其浓度为0.5重量％至4.5重量％，更优选1重量％至3重量％，甚至更优选2.5重量％，所述葡糖胺和/或透明质酸各自的浓度范围为0.1重量％至0.4重量％，更优选等于0.25重量％。特别地，上述药理学组合源于实验证据，该实验证据证明加入葡糖胺对药物的药理学活性具有协同作用，并且透明质酸的添加正是由这种分子的性质提出的，这种分子能够为制剂提供更大的粘度，当在关节中施用时具有随之而来的润滑效果。特别地，应该注意的是，尽管所有人的骨骼关节都可以接受并因此受益于上述施用，但优选地膝盖是优选的骨骼关节。

为了达到上述治疗和预防效果的目的，本发明的另一个实施方案的目的是通过制备乳膏提供一种适合于局部施用途径的药物组合物，所述乳膏由在基础乳膏中的浓度为0.1重量％至2重量％、更优选等于1重量％的具有式1的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或立体异构体组成。

根据本发明的一些优选实施方案，已经出于说明性但非限制性的目的描述了本发明，但是应当理解，本领域技术人员可以进行任何变化和/或修改，而不脱离由以下所附权利要求限定的相对保护范围。