联合糖基化抑制剂与CAR细胞疗法用于治疗癌症

摘要

本发明涉及与CAR细胞疗法联用的至少一种糖基化抑制剂，优选所述至少一种糖基化抑制剂改善所述CAR细胞疗法的治疗潜力。本发明还涉及药物组合物和已经与至少一种糖基化抑制剂接触的CAR细胞群或亚群。

说明书

技术领域

本发明涉及与免疫疗法联用的至少一种糖基化抑制剂，优选所述至少一种糖基化抑制剂改善所述免疫疗法的治疗潜力。免疫疗法可以是基于细胞的免疫疗法，优选CAR细胞疗法，优选CAR-T细胞疗法。本发明还涉及药物组合物和已经与至少一种糖基化抑制剂接触的免疫细胞群或亚群。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)是合成的生物学分子，其通常通过将源自肿瘤反应性单克隆抗体的抗原结合部分与源自T淋巴细胞的胞内信号传导结构域融合而构建。近年来，不同的研究机构通过向患有难治性B细胞恶性肿瘤的患者输注CD19 CAR-T细胞展示了令人印象深刻且持久的临床反应(Lee DW,Lancet.Feb 7；385(9967):517-528；Turtle CJ等,J ClinInvest.2016年6月1日；126(6):2123-38；Turtle CJ等,Science Transl Med.2016年9月7日；8(355):355ra116；Schuster SJ等,N Engl J Med.2017年12月28日；377(26):2545-2554；Maude SL等,N Engl J Med.2018年2月1日；378(5):439-448；Park JH等,N Engl JMed.2018年2月1日；378(5):449-459)，其最终结果是近期首次批准了两种CAR-T细胞疗法，以治疗儿科和年轻成人复发性/难治性B细胞ALL(Kymriah，诺华公司)和成人复发/难治性大B细胞淋巴瘤(Yescarta，风筝制药公司-吉利德科技公司(Kite Pharma-GileadScience))。

尽管存在广泛而合理的兴奋，CAR-T细胞在其他血液系统恶性肿瘤以及最重要的是实体瘤上的成功应用仍有待证明。为了扩大CAR-T细胞在其他疾病适应症中的应用，详细分析决定其功效和毒性概况的因素变得至关重要。众所周知的是，肿瘤细胞对通过CAR-T细胞进行的杀伤的敏感性取决于多种因素，包括靶抗原的表达水平，辅助分子的可用性，CAR亲和力和CAR胞外间隔子的设计。

糖基化是酶促过程，其产生糖类与其他糖、蛋白质或脂质的糖苷键。特别地，糖蛋白携带通常通过氮或氧键共价连接多肽骨架的一种或多种聚糖，在这种情况下，它们分别被称为N-聚糖或O-聚糖。糖基化是蛋白质最复杂的翻译后修饰，并且参与许多生理事件，诸如宿主-病原体相互作用，细胞分化和运输，以及胞内和胞间信号传导。通常，糖基化蛋白具有不同类型的抗原表位，包括寡糖表位、糖肽表位和肽表位(Lisowska E等,Cell Mol LifeSci.2002年3月；59(3):445-55)。有趣的是，特别是在糖基化程度较高的蛋白质中，肽表位可以被聚糖掩盖，如针对流感病毒血凝素(Munk K等,Glycobiology.1992年6月；2(3):233-40)和人MUC1蛋白(Spencer DI等,Cancer Letters.1996年2月27日；100(1-2):11-5)所报道的。相较于未转化的对应物，肿瘤细胞显示出广泛的糖基化改变。这些变化包括N-聚糖支化增加，更高的O-聚糖密度，生成正常对应物的截短形式以及生成唾液酸和岩藻糖末端结构的不寻常形式。糖蛋白寡糖结构的变化通过细胞周期失调，诱导细胞增殖，促进肿瘤扩散和血管生成，以及促进免疫逃逸参与癌症进展(Pinho SS等,Nat Rev Cancer.2015年9月；15(9):540-55)。

发明概述

本公开的特征(至少部分)在于使用免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)治疗病症如癌症(例如，实体瘤或血液肿瘤或者与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤)的组合物和方法，所述免疫效应细胞表达嵌合抗原受体(CAR)分子，例如，与肿瘤抗原(例如，实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤表面表达的抗原)结合的CAR。所述组合物包括并且所述方法包括，给予表达靶向肿瘤的CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，联合糖基化抑制剂。在一些实施方式中，相较于任一单一治疗，该组合维持或具有更好的临床效果，例如，针对与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤或实体瘤或血液肿瘤。在不受理论的束缚，本文显示了使用糖基化抑制剂(例如，如本文所述)减少N-聚糖支化，增加表达CAR的细胞(例如，表达CAR的T细胞)引起的肿瘤诱导的活化和细胞因子释放，增加表达CAR的细胞引起的肿瘤识别和杀伤，从而去除抑制表达CAR的细胞功能的来源，例如，表达CAR的细胞的抗肿瘤或增殖活性。本发明还涉及表达结合肿瘤抗原(例如，实体瘤抗原或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤细胞上的抗原)的CAR分子的工程改造的细胞(例如，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞))联合糖基化抑制剂的抑制剂在治疗与肿瘤抗原(例如，实体瘤或血液肿瘤抗原或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤(例如，癌症)上的抗原)表达相关的病症中的用途。

过继转移CAR-T细胞展现出针对B细胞恶性肿瘤令人印象深刻的结果，但对实体癌的功效仍然有限。因为实体瘤表现出广泛的糖基化改变，包括N-聚糖支化增加，所以推测抗原表位可能被CAR-T细胞靶向性所掩盖。因此，发明人观察到，相对于糖基化完全的(glycosylation-competent)肿瘤细胞，CAR-T细胞更高效地消除糖基化不全的(glycosylation-incompetent)肿瘤细胞。为了利用这一机制来增加CAR-T细胞的功效，他们试图用葡萄糖/甘露糖类似物2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)阻断胰腺癌细胞的糖基化，特别是N-糖基化，并将CD44v6作为模型抗原。与糖基化敲除细胞类似，使用2DG进行治疗导致去糖基化抗原的膜暴露，从而使CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别敏感。值得注意的是，单独使用2DG作为单一疗法被证明是无效的，这表明与CAR-T细胞的协同作用。重要的是，能够增强CAR-T细胞对肿瘤细胞识别的相同剂量的2DG无法增加对健康细胞的清除，这支持了该策略的安全性。最终，当在胰腺癌异种移植小鼠模型中受到攻击时，2DG显著增加CAR-T细胞的抗肿瘤活性，并且这种作用伴随着衰竭和衰老标志物表达降低。值得注意的是，在使用CEA-CAR T细胞和不同肿瘤类型时，这些结果得到证实，这表明联合策略可以被成功地应用于具有不同CAR特异性的多种癌症。

总之，目前的结果表明，肿瘤糖基化调节CAR-T细胞功效并支持CAR-T细胞与糖基化抑制剂诸如去糖基化试剂2DG的组合，用于针对实体瘤或血液肿瘤的成功免疫疗法。

具体地，为了研究糖链在空间上对于CAR-T细胞靶向是否是笨重的(hulking)，发明人通过使用CRISPR-Cas9技术敲除糖基转移酶Mgat5的表达产生了N-糖基化缺陷型胰腺肿瘤细胞系。作为CAR靶向的模型抗原，他们关注CD44v6和CEA，因为它们都是在包括胰腺癌在内的多种实体瘤上过度表达的高度糖基化蛋白。引人注目的是，抑制N-糖基化导致CD44v6和CEA-CAR-T细胞的肿瘤靶向性显著增加。这种作用与CAR-T细胞活化改善相关，这表明更精确的抗原结合(engagement)。使用N-糖基化抑制剂衣霉素进一步证实了这些发现。为了利用这一机制来增加CAR-T细胞对实体瘤的功效，发明人试图用葡萄糖/甘露糖类似物2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)阻断肿瘤N-糖基化。与糖基化敲除细胞类似，使用2DG进行治疗也导致CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别敏感，显著增加其清除。值得注意的是，单独使用2DG被证明是无效的，这进一步表明与CAR-T细胞的协同作用。在机理上，Mgat5敲除和2DG都减少胰腺肿瘤细胞上的PHA-L凝集素染色，这表明治疗有效地减少了N-聚糖支化。观察2DG治疗后肿瘤细胞表面上去糖基化蛋白的存在，Western印迹也证实了类似的结果。然后，发明人在胰腺癌异种移植小鼠模型中对该联合方法提出了挑战。根据体外实验数据，具有高肿瘤负荷并接受CAR-T细胞的小鼠高度受益于2DG给药(7天时肿瘤减少5倍，p<0.05)，与之相反，单独给予2DG不能介导任何抗肿瘤作用。有趣的是，抗肿瘤活性的改善伴随着共表达衰竭和衰老标志物如TIM-3、LAG-3、PD-1和CD57的CAR-T细胞频率的降低。得益于代谢失调(瓦博格效应(Warburg effect))，相较于健康组织，预期2DG将在癌细胞中选择性累积，这支持了联合方法的安全性。因此，观察到能够增强CAR-T细胞对肿瘤识别的相同剂量的2DG不能诱导蛋白质去糖基化以及增加对健康细胞(如角质形成细胞)的清除。最后，发现一些实体瘤和血液肿瘤的癌细胞系具有高度的N-糖基化，并且通过将CAR-T细胞与糖基化抑制剂2DG组合，它们的杀伤被显著改善。

目前的结果表明：i)肿瘤细胞的糖基化状态调节CAR-T细胞的功效；ii)将CAR-T细胞与优先在肿瘤肿块中积聚的糖基化抑制剂(如去糖基化试剂2DG)结合代表了针对肿瘤，特别是实体瘤的成功免疫疗法。

在本发明中，令人惊讶地发现肿瘤的糖基化状态能够影响其对免疫疗法进行的杀伤的易感性，所述免疫疗法优选基于细胞的免疫疗法，更优选CAR-T细胞疗法，并且去糖基化或糖基化抑制剂，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)可以协同地改善所述免疫疗法(例如CAR-T细胞)的抗肿瘤功效。

嵌合抗原受体是合成的生物学分子，其通常通过将源自肿瘤反应性单克隆抗体的抗原结合部分与源自T淋巴细胞的胞内信号传导结构域融合而构建。实体恶性肿瘤的特征在于广泛的糖基化改变，其中聚糖有可能调节肿瘤与免疫系统的相互作用。本发明基于这样的发现，即用去糖基化试剂(或糖基化抑制剂)处理肿瘤将增加其CAR-T细胞的识别和杀伤，从而改善最终治疗结果。2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)是一种葡萄糖类似物，其能够抑制糖酵解的第一个关键步骤。此外，因为其在结构上模拟D-甘露糖，所以2DG也能够抑制N-糖基化。得益于肿瘤细胞中的代谢失调(瓦博格效应)，预期2DG将在癌细胞中选择性累积，并被推荐为抗肿瘤治疗的候选药物。最近的临床试验证实，虽然抗肿瘤活性较低，但单独给予2DG或与其他抗癌疗法(诸如化疗和放疗)联用是安全的并为患者良好耐受(Zhang D,CancerLetters 2014；Xi H,IUBMB Life 2014)。发明人发现2DG显著增加CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别和清除。值得注意的是，这种作用不是简单的累加作用，而是协同作用，因为其高于单独使用2DG(最小)和CAR-T细胞的单独活性所预期的。由于在肿瘤细胞中优先累积，2DG对正常细胞也显示出低毒性。然而，还可以施用除了2DG以外的去糖基化剂或糖基化抑制剂。此外，实现将所述试剂或抑制剂选择性地递送到肿瘤，例如通过使用针对特定细胞靶向功能化的纳米颗粒。

因为CAR-T细胞和单克隆抗体共有识别部分，预期糖基化抑制通过单克隆抗体疗法对抗原识别产生积极影响。此外，据报道，肿瘤细胞上表达的检查点分子(诸如PDL1)的糖基化状态对其通过T细胞受体结合的免疫抑制功能非常重要(Li等，Cancer Cell 33,187-201,2018)。这表明用2DG抑制肿瘤或感染细胞的糖基化通常可以释放基于T细胞的疗法。

然后，本发明提供了至少一种糖基化抑制剂和至少一种CAR细胞疗法，用于治疗和/或预防癌症。

优选地，所述至少一种糖基化抑制剂改善所述CAR细胞疗法的治疗潜力和/或改善CAR细胞活化和/或增加抗原结合和/或使肿瘤细胞对CAR细胞疗法的识别敏感和/或增加肿瘤细胞的消除。

本发明提供了至少一种糖基化抑制剂，用于增加肿瘤细胞杀伤，其中所述肿瘤细胞暴露于至少一种CAR细胞疗法或其中所述肿瘤细胞已经暴露于至少一种CAR细胞疗法。

优选地，至少一种CAR细胞疗法是CAR-T细胞疗法或CAR-NK细胞疗法，优选所述T细胞是自体同源或同种异体T细胞。

在优选的实施方式中，所述糖基化抑制剂选自下组：O-糖基化抑制剂、N-糖基化抑制剂、P-糖基化抑制剂、C-糖基化抑制剂、S-糖基化抑制剂或其组合。

优选地，所述糖基化抑制剂选自下组：甘露糖类似物、2-脱氧葡萄糖、3-脱氧-3-氟葡萄糖胺、4-脱氧-4-氟葡萄糖胺、2-脱氧-2-氟-葡萄糖、2-脱氧-2-氟-甘露糖、6-脱氧-6-氟-N-乙酰葡萄糖胺、2-脱氧-2-氟岩藻糖和3-氟唾液酸衣霉素、栗精胺、澳大林(australine)、脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin)、苦马豆素、脱氧甘露伊霉素(deoxymannojirimycin)、几夫碱(kifunensin)、制甘糖酶素(mannostatin)、神经氨酸酶抑制剂、糖基转移酶抑制剂。

优选地，如上文所定义用途的至少一种糖基化抑制剂还包含治疗剂，优选所述治疗剂是抗体，优选检查点抑制剂抗体。优选抗体如下所定义。

检查点抑制剂治疗是癌症免疫疗法的一种形式。该疗法靶向免疫检查点，其是刺激或抑制免疫系统活动的免疫系统的关键调节剂，肿瘤可以利用它来保护自己免受免疫系统的攻击。检查点疗法可以阻断抑制性检查点，恢复免疫系统功能。首个靶向免疫检查点的抗癌药物是2011年美国批准的CTLA4阻断剂伊匹单抗(ipilimumab)。

目前批准的检查点抑制剂靶向CTLA4、PD-1和PD-L1分子。PD-1是跨膜程序性细胞死亡1蛋白(也称为PDCD1和CD279)，其与PD-L1(PD-1配体1或CD274)相互作用。细胞表面上的PD-L1与免疫细胞表面的PD1结合，其抑制免疫细胞活性。在PD-L1功能中，对T细胞活性起着关键的调节作用。似乎细胞表面上PD-L1的上调(癌症介导的)可能抑制T细胞，否则可能攻击。结合PD-1或PD-L1并因此阻断相互作用的抗体可以允许T细胞攻击肿瘤。

在优选实施方式中，糖基化抑制剂为2-脱氧葡萄糖。

优选地，用于如上文所定义的用途的至少一种糖基化抑制剂用于治疗实体瘤或血液肿瘤或淋巴肿瘤。优选地，实体瘤选自下组：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、骨癌、胰腺癌，皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱发的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移性病变。

优选地，血液肿瘤或淋巴肿瘤选自下组：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或白血病前期、所述癌症的组合和所述癌症的转移性病变。

在优选实施方案中，在CAR细胞疗法之前给予至少一种糖基化抑制剂或者在CAR细胞疗法的同时给予至少一种糖基化抑制剂。

本发明还提供组合物，其包含至少一种糖基化抑制剂和CAR-T细胞疗法，用于医药用途。

优选地，所述至少一种糖基化抑制剂改善所述CAR细胞疗法的治疗潜力和/或改善CAR细胞活化和/或增加抗原结合和/或使肿瘤细胞对CAR细胞疗法的识别敏感和/或增加肿瘤细胞的消除。

本发明提供了包含至少一种糖基化抑制剂的组合物，用于增加肿瘤细胞杀伤，其中所述肿瘤细胞暴露于至少一种CAR细胞疗法或其中所述肿瘤细胞已经暴露于至少一种CAR细胞疗法。

优选地，糖基化抑制剂是2DG，并且CAR细胞疗法是CAR-T细胞疗法。

本发明还提供分离的CAR-T细胞群或亚群，或与至少一种糖基化抑制剂接触的分离的CAR-T细胞。

优选地，所述至少一种糖基化抑制剂改善所述CAR细胞疗法的治疗潜力或增加对象对所述CAR细胞疗法的敏感性。

本发明还提供了至少一种糖基化抑制剂，用于在对象中与CAR细胞疗法联用，其中所述至少一种糖基化抑制剂增加所述CAR细胞疗法的肿瘤细胞识别和/或其中所述至少一种糖基化抑制剂改善肿瘤细胞的消除。

在另一方面中，本发明提供包括细胞(例如，免疫效应细胞群)的CAR疗法，所述细胞包括(例如，表达)嵌合抗原受体(CAR)，用于与糖基化抑制剂组合用于治疗患有与肿瘤抗原的表达相关联的疾病的对象(例如，患有癌症(例如，实体瘤或血液肿瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤)的对象)。CAR包括肿瘤抗原结合域(例如，CAR的肿瘤抗原结合域结合CD19或CD123)、跨膜结构域和胞内信号传导域。

在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中，所述细胞是T细胞或NK细胞。在实施方式中，T细胞是自体同源或同种异体T细胞。

在实施方式中，依次给予CAR疗法和糖基化抑制剂。在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中，在CAR疗法之前给予糖基化抑制剂。在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中，糖基化抑制剂和CAR疗法同时或一起给予。

在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中，以(a)单次输注或(b)多次输注(例如，将单剂量分为多次输注)给予CAR疗法，并且以(a)单剂量或(b)多个剂量(例如，第一和第二剂量，任选地，一个或多个后续剂量)给予糖基化抑制剂。

在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中，在给予第一剂量的糖基化抑制剂后(例如，至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周或更多周后)并且例如在给予第二剂量的抑制剂之前给予一剂CAR疗法。

在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中，在给予第一剂量的糖基化抑制剂同时(例如，在2天内(例如，在2天、1天、24小时、12小时、6小时、4小时、2小时或更短时间内)给予一剂CAR疗法。

在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中，在第二剂量的糖基化抑制剂之后给予一个或多个后续剂量的糖基化抑制剂。

在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中，以超过一个剂量给予糖基化抑制剂，并且给予剂量为每天两次(BID)、每天一次、每周一次、每14天一次或每月一次。

在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中，给予糖基化抑制剂包括多个剂量，包括至少7天的持续时间，例如，至少7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或更多。

在实施方式中，包括在任何前述方面和实施方式中,以这样的剂量给予CAR疗法，所述剂量包含至少约5x10

在另一方面中，本发明提供一种用于刺激哺乳动物中T细胞介导的对实体瘤细胞的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物给予有效量的之前各方面所述的组合物。

在另一方面中，本发明提供一种在哺乳动物中提供抗肿瘤(例如，抗实体瘤或血液肿瘤)免疫的方法，其包括向哺乳动物给予有效量的所述组合物。

在另一方面中，本发明提供一种治疗患有与肿瘤抗原(例如，实体瘤抗原)的表达相关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括给予有效量的之前各方面所述的组合物。

在实施方式中，包括在上述任一方法实施方式中，提供了细胞(例如，免疫效应细胞群)和糖基化抑制剂，用于分开给予(例如，在两种分开的组合物中)。在其它实施方式中，包括在上述任一方法实施方式中，提供了细胞(例如，免疫效应细胞群)和糖基化抑制剂，用于同时给予(例如，在一种组合物中)。

糖基化抑制剂的下述方面可以与前述方面和实施方式中的任何一个一起利用。

抑制糖基化的化学工具包括各种类型的抑制剂，包括天然产物、基于底物的紧密结合抑制剂、糖苷引物、通过筛选化学文库发现的抑制剂和基于酶的三维结构合理设计的抑制剂。

然后，本发明的糖基化抑制剂包含不同类型的抑制剂(参见下表)：代谢抑制剂，长醇(dolichol)-PP-GlcNAc组装体的抑制剂，植物生物碱，作为糖苷酶天然抑制剂，粘蛋白型聚糖的O-GalNac启动的抑制剂，O-GlcNAc修饰抑制剂，底物类似物，糖苷引物，GPI锚定和糖脂抑制剂，神经氨酸酶(唾液酸酶)抑制剂，磺基转移酶抑制剂。这些抑制剂述于“抑制糖基化的化学工具-糖生物学要点-NCBI书架(Chemical Tools for InhibitingGlycosylation-Essentials of Glycobiology-NCBI Bookshelf)”,Varki A,CummingsRD,Esko JD等编著.糖生物学要点(Essentials of Glycobiology)[网络].第3版.冷泉港(纽约):冷泉港实验室出版社；2015-2017.doi:10.1101/glycobiology.3e.055,特别是第55章，抑制糖基化的化学工具,Jeffrey D.Esko,Carolyn Bertozzi,和Ronald L.Schnaar，通过引用其全部内容纳入本文。

已经描述了通过干扰常见前体的代谢或细胞内转运活动来阻断糖基化的许多抑制剂。其中一些化合物通过阻碍内质网(ER)、高尔基体和跨高尔基体网络之间的蛋白质转运间接地起作用。例如，真菌代谢物布雷菲德菌素(brefeldin)A导致位于跨高尔基体网络附近的高尔基体组分逆行运输回ER。因此，用布雷菲德菌素A处理细胞将位于反式高尔基体网络中的酶与ER和高尔基体中的酶分离，并将一些聚糖的核心结构的组装与后期反应如唾液酸化或硫酸化分离。该药物可以用来检查两条途径是否位于同一个隔室(compartment)或共享相同的酶。因为酶的定位和排列在不同的细胞类型中有很大的不同，所以从一个系统推断布雷菲德菌素A对另一个系统的作用通常是困难的。

一些抑制剂在形成涉及糖基化的前体的中间代谢的关键步骤起作用。例如，谷氨酰胺类似物6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸(DON)阻断谷氨酰胺：果糖-6-磷酸氨基转移酶，这是由果糖和谷氨酰胺形成葡萄糖胺的己糖生物合成途径的酶。以这种方式抑制葡萄糖胺的产生对聚糖组装体具有多效性作用，因为所有的主要家族都包含N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺。DON还影响使用酶的其他谷氨酰胺，因此，应注意限制非特异性副作用。氯酸盐是阻断硫酸化的另一类通用抑制剂。氯酸盐阴离子(ClO)是硫酸盐(SO)类似物，并且其与参与磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐(PAPS)(所有已知硫酸化反应的活性硫酸盐供体)形成的硫酰化酶形成一种失败的复合物(abortive complex)。因此，使用氯酸盐(通常为10–30mM)处理细胞抑制90％以上的硫酸化反应，但是该作用对任何特定类别的聚糖或硫酸化反应都没有特异性(例如，酪氨酸硫酸化也受到影响)。

已经制备了多种糖似物，其显示出对糖基化的选择性抑制：

糖的2-脱氧葡萄糖和氟化的类似物(3-脱氧-3-氟葡萄糖胺、4-脱氧-4-氟葡萄糖胺、6-脱氧-6-氟-N-乙酰葡萄糖胺、2-脱氧-2-氟葡萄糖、2-脱氧-2-氟甘露糖、2-脱氧-2-氟岩藻糖和3-氟唾液酸)抑制糖蛋白生物合成。2-脱氧葡萄糖的早期研究表明，类似物被转化为UDP-2-脱氧葡萄糖以及GDP-2-脱氧葡萄糖和长醇-P-2-脱氧葡萄糖。糖蛋白形成的抑制显然是由于含有2-脱氧葡萄糖的各种长醇寡糖的累积而发生的，这些寡糖不能正常地延长或转移到糖蛋白。相似地，4-脱氧-N-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-4-脱氧-N-乙酰葡萄糖胺，导致在不纳入类似物的情况下抑制硫酸乙酰肝素的形成。4-脱氧-木糖还通过与天然木糖基化底物竞争来抑制糖胺聚糖组装。

本发明的其他糖基化抑制剂包括：

O-GlcNAc特异性β-己糖胺酶(OGA)和O-GlcNAc转移酶(OGT)的抑制剂。

鞘糖脂形成抑制剂。这些类似物是启动鞘糖脂形成的葡萄糖基转移酶的有效抑制剂。

流感神经氨酸酶抑制剂的结构。Neu5Ac，NANA；2-脱氧-2,3-脱氢-N乙酰基神经氨酸，DANA；4-氨基-DANA；4-胍基-DANA(瑞乐砂(Relenza)，扎那米韦(zanamivir))；(3R,4R,5S)-4-乙酰胺基-5-氨基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烷-1-羧酸乙酯(GS4104，克流感(Tamiflu)，奥司他韦(oseltamivir))的化学结构。认为DANA类似于水解过程中的过渡态，而在瑞乐砂中添加胍基提供了与活性位点更高亲和力地结合。克流感中的乙酯增强了口服的有效性，然后在体内被非特异性酯酶迅速清除。

抑制参与N-连接的聚糖生物合成的糖苷酶的生物碱示例：

糖基转移酶的基于合成底物的抑制剂

在本发明中，癌症免疫疗法(有时称为免疫肿瘤学，缩写为IO)是使用免疫系统治疗癌症。免疫疗法可分为主动、被动或混合(主动和被动)。这些方法利用了这样的事实，即癌细胞在其表面通常具有可以通过免疫系统检测的分子，称之为肿瘤相关抗原(TAA)；它们通常是蛋白质或其他大分子(如碳水化合物)。主动免疫治疗通过靶向TAA指导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫疗法增强现有抗肿瘤反应并且包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。

其中，各个国家批准了多种抗体疗法来治疗多种癌症。抗体是通过免疫系统产生的蛋白质，其与细胞表面上的靶抗原结合。免疫系统通常使用它们来对抗病原体。各抗体对一种或几种蛋白质具有特异性。结合肿瘤抗原的那些治疗癌症。细胞表面受体是抗体疗法的共同靶标并且包括CD20、CD274和CD279。一旦与癌症抗原结合，抗体可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，激活补体系统或阻止受体与其配体相互作用，所有这些都可能导致细胞死亡。经批准的抗体包括阿仑单抗(alemtuzumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥法木单抗(ofatumumab)和利妥昔单抗(rituximab)。

主动细胞疗法通常包括由血液或由肿瘤去除免疫细胞。培养对肿瘤具有特异性的细胞并返回给患者，它们在那里攻击肿瘤；或者，免疫细胞可以经遗传工程改造以表达肿瘤特异性受体，培养并返回给患者。可以这种方式使用的细胞类型是天然杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、细胞毒性T细胞和树突细胞。

白介素-2和干扰素-α是细胞因子，调节和协调免疫系统行为的蛋白质。它们具有增强抗肿瘤活性的能力，并且因此可以作为被动癌症治疗。干扰素-α被用于治疗毛细胞白血病、AIDS相关卡波济氏肉瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性髓细胞白血病和恶性黑色素瘤。白介素-2用于治疗恶性黑色素瘤和肾细胞癌。

过继T细胞疗法

癌症特异性T细胞可以通过肿瘤浸润淋巴细胞的片段化和分离获得，或者通过遗传工程改造来自外周血的细胞获得。在输注给受体(肿瘤携带者)之前，细胞被激活和生长。

过继T细胞疗法是通过输注T细胞(过继细胞转移)进行的被动免疫形式。它们存在于血液和组织中，并且通常在发现外来病原体时激活。特别地，当T细胞的表面受体遇到在其表面抗原上显示出外源蛋白部分的细胞时，它们就会被激活。这些细胞可以是感染的细胞，或者是抗原呈递细胞(APC)。它们存在于正常组织和肿瘤组织中，它们在那里称为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。它们通过存在APC(诸如呈递肿瘤抗原的树突细胞)激活。虽然这些细胞可以攻击肿瘤，但是肿瘤内的环境具有高度免疫抑制作用，阻止免疫介导的肿瘤死亡。

已经开发了产生和获得肿瘤靶向T细胞的多种方法。对肿瘤抗原具有特异性的T细胞可以由肿瘤样品(TIL)去除或由血液过滤。随后离体进行活化和培养，并将结果再次注入。活化可以通过基因治疗或者通过将T细胞暴露于肿瘤抗原来实现。

截至2014年，多项ACT临床试验正在进行中。重要的是，2018年的一项研究显示，可以在患有对多种先前免疫疗法具有抗性的转移性黑色素瘤患者中获得临床反应。

FDA在2017批准的前2种过继T细胞疗法，替沙仑赛(tisagenlecleucel)和阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)。

另一种方法是由健康供体过继转移单倍体γδT细胞或NK细胞。该方法的主要优点是这些细胞不会引起GVHD。缺点是转移细胞的功能经常受损。

CAR-T细胞疗法

“嵌合抗原受体”或“CAR”指可以赋予细胞抗原特异性的工程改造的受体(例如T细胞)。CAR也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。优选地，本发明的CAR包含抗原特异性靶向区、胞外结构域、跨膜结构域，任选地一个或多个共刺激结构域和胞内信号传导结构域。

抗原特异性靶向结构域为CAR提供了与感兴趣的靶抗原结合的能力。优选地，抗原特异性靶向结构域靶向临床上感兴趣的抗原，对其将期望触发导致肿瘤杀伤的效应物免疫反应。

抗原特异性靶向结构域可以是具有特异性识别和结合生物分子(例如，细胞表面受体或肿瘤蛋白或其组分)能力的任何蛋白质或肽。抗原特异性靶向结构域包括任何天然产生的、合成的、半合成的或重组产生的结合伙伴，针对感兴趣的生物分子。

示例性的抗原特异性靶向结构域包括抗体或抗体片段或衍生物，受体的胞外结构域，细胞表面分子/受体的配体，或其受体结合结构域，和肿瘤结合蛋白。

在优选的实施方式中，抗原特异性靶向结构域是或衍生自抗体。抗体衍生的靶向结构域可以是抗体的片段或抗体的一个或多个片段的遗传工程改造的产物，该片段参与与抗原的结合。示例包括可变区(Fv)、互补决定区(CDR)、Fab、单链抗体(scFv)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和骆驼抗体(VHH)。

在优选的实施方式中，结合结构域是单链抗体(scFv)。scFv可以是小鼠、人或人源化scFv。

关于抗体或其抗原结合片段的“互补决定区”或“CDR”指抗体重链或轻链可变区中的高度可变环。CDR可以与抗原构象相互作用并在很大程度上决定与抗原的结合(尽管已知一些框架区参与结合)。重链可变区和轻链可变区各自包含3个CDR。

“重链可变区”或“VH”指抗体重链的片段，其包含插入侧翼延伸之间的3个CDR，称之为框架区，它们比CDR更为保守并且形成支架以支持CDR。

“轻链可变区”或“VL”指抗体轻链的片段，其包含插入框架区之间的3个CDR。

“Fv”指带有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由与单条重链的可变区结合单条轻链的可变区构成。

“单链Fv抗体”或“scFv”指这样的工程改造的抗体，其由彼此之间直接或通过肽接头序列连接的轻链可变区和重链可变区构成。

可以使用本领域众所周知的方法制备特异性结合肿瘤细胞表面分子的抗体。这类方法包括噬菌体展示、产生人或人源化抗体的方法，或使用经工程改造以产生人抗体的转基因动物或植物的方法。能够获得部分或完全合成抗体的噬菌体展示文库，并且可以针对可以结合靶分子的抗体或其片段进行筛选。也能够获得人抗体的噬菌体展示文库。一旦鉴定，就可以分离和/或确定编码抗体的氨基酸序列或多核苷酸序列。

可以通过本发明的CAR靶向的抗原的示例包括但不限于在癌细胞上表达的抗原和在与各种血液疾病、自身免疫疾病、炎症性疾病和传染病相关的细胞上表达的抗原。

对于靶向肿瘤抗原的靶向结构域，靶向结构域的选择将取决于待治疗的癌症的类型，并且可以靶向肿瘤抗原。来自对象的肿瘤样品可被表征为存在某些生物标志物或细胞表面标志物。例如，来自对象的乳腺癌细胞对于Her2Neu、雌激素受体和/或孕酮受体中的任一项可以是阳性的或阴性的。选择在个体对象的肿瘤细胞上发现的肿瘤抗原或细胞表面分子。优选地，抗原特异性靶向结构域靶向这样的细胞表面分子，其存在于肿瘤细胞上并且基本上不存在于正常组织上，或被限制其在非重要正常组织中的表达。

CAR可以靶向的其他癌症特异性抗原包括但不限于下述一种或多种：间皮素、EGFRvIII、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、白介素-11受体a(IL-l lRa)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、MUCl、表皮生长因子受体(EGFR)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2,Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、生存素和端粒酶、PCTA-l/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和GLL1，

本发明的CAR可以靶向的炎症性疾病特异性抗原包括但不限于下述一种或多种：AOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(嗜酸性粒细胞激活趋化因子-1)、CD125、CD147(基础免疫球蛋白)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的链)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受体、整合素α4、整合素α4β7、羊驼(Lama glama)、LFA-1(CD11a)、MEDI-528、肌肉生长抑制素、OX-40、rhuMAbβ7、硬化素(scleroscin)、SOST、TGFβ1、TNF-a或VEGF-A.

本发明的CAR可以靶向的神经元疾病特异性抗原包括但不限于：β淀粉样蛋白或MABT5102A中的任一种或多种。

本发明的CAR可以靶向的糖尿病特异性抗原包括但不限于：L-1β或CD3中的任一种或多种。对本领域技术人员来说，对糖尿病或其它代谢紊乱具有特异性的抗原是显而易见的。

本发明的CAR可以靶向的心血管疾病特异性抗原包括但不限于：C5、心肌肌球蛋白、CD41(整合素αIIb)、纤维蛋白II、β链、ITGB2(CD18)和鞘氨醇-1-磷酸中的任何一种或多种。

优选地，抗原特异性结合结构域特异性地结合肿瘤抗原。在特定实施方式中，多核苷酸编码特异性结合CD44v6或CEA的单链Fv。

CAR还包括一个或多个共刺激结构域。该结构域可以促进细胞增殖、细胞存活和记忆细胞的发育。

各个共刺激结构域包括例如下述任一或多个共刺激结构域：MHC I类分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整合素，信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)，活化NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体OX40，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CDS，ICAM-1，LFA-1(CDl la/CD18)，4-1BB(CD137)，B7-H3，CDS，ICAM-1，ICOS(CD278)，GITR，BAFFR，LIGHT，HVEM(LIGHTR)，KIRDS2，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，NKp44，NKp30，NKp46，CD 19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CDl ld，ITGAE，CD103，ITGAL，CDl la，LFA-1，ITGAM，CDl lb，ITGAX，CDllc，ITGB 1，CD29，ITGB2，CD 18，LFA-1，ITGB7，NKG2D，NKG2C，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A、Lyl08)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，CD 19a，与CD83特异性结合的配体。对于本领域技术人员而言，其它共刺激结构域是显而易见的。

该CAR还包含胞内信号传导结构域。这个结构域可能是胞质的，并且可以传递效应功能信号并指导细胞进行其特殊功能。胞内信号传导结构域的示例包括但不限于：T细胞受体的ζ链或其任何同系物(例如，η链、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等)、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)以及T细胞转导中涉及的其他分子，如CD2、CD5和CD28。胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、具有胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其组合。

优选地，胞内信号传导结构域包含人CD3ζ链的胞内信号传导结构域。

该CAR还包含跨膜结构域。跨膜结构域可以包含来自具有跨膜结构域的任何蛋白质的跨膜序列，包括I型、II型或III型跨膜蛋白质中的任何一种。本发明的CAR的跨膜结构域还可以包含人工疏水序列。可以选择本发明的CAR的跨膜结构域为不进行二聚化。对于本领域技术人员而言，其它跨膜结构域是显而易见的。用于CAR构建体的跨膜(TM)区的示例是：1)CD28 TM区(Pule等,Mol Ther,2005年11月；12(5):933-41；Brentjens等,CCR,2007年9月15日；13(18Pt 1):5426-35；Casucci等,Blood,2013,Nov 14；122(20):3461-72.)2)OX40 TM区(Pule等,Mol Ther,2005年11月；12(5):933-41)3)41BB TM区(Brentjens等,CCR,2007年9月15日；13(18Pt 1):5426-35)；4)CD3ζTM区(Pule等,Mol Ther,2005年11月；12(5):933-41；Savoldo B,Blood,2009年6月18日；113(25):6392-402.)；5)CD8a TM区(Maher等,Nat Biotechnol,2002年1月；20(1):70-5.；Imai C,Leukemia,2004年4月；18(4):676-84；Brentjens等,CCR,2007年9月15日；13(18Pt 1):5426-35；Milone等,MolTher,2009年8月；17(8):1453-64.)。

替沙仑赛(Kymriah)是一种嵌合抗原受体(CAR-T)疗法，其于2017年被FDA批准用于治疗急性淋巴母细胞白血病。该治疗去除体内CD19阳性细胞(B细胞)(包括患病细胞，但也包括产生正常抗体的细胞)。阿基仑赛(叶斯卡塔)是另一种CAR-T疗法，其于2017年被批准用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤。

抗体疗法

抗体是适应性免疫反应的关键组成部分，其在识别外来抗原和刺激免疫反应中起着核心作用。抗体是由一些B细胞产生的Y形蛋白质，并且包括两个区域：抗原结合片段(Fab)，其与抗原结合；和可结晶片段(Fc)区，其与不同免疫细胞(包括巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞)表面上表达的所谓Fc受体相互作用。许多免疫治疗方案涉及抗体。单克隆抗体技术工程改造并产生针对特定抗原(如肿瘤表面上的抗原)的抗体。

偶联

癌症治疗中使用两种类型：

裸单克隆抗体是不添加任何元素的抗体。大多数抗体疗法使用这种抗体类型。

将偶联的单克隆抗体与另一分子(具有细胞毒性或放射性)连接。毒性化学物质通常用作化疗药物，但是可以使用其他毒素。抗体与癌细胞表面上的特异性抗原结合，将疗法导向肿瘤。放射性化合物连接的抗体被称为放射性标记的。化学标记或免疫毒素抗体分别用化学治疗性分子或毒素标记。

Fc区

Fc结合Fc受体的能力十分重要，因为它允许抗体激活免疫系统。Fc区是多种多样的：它们存在于许多亚型中，并且可以被进一步修饰，例如，在称为糖基化的过程中添加糖。Fc区中的变化可以改变抗体与Fc受体结合的能力，并且通过延伸，将决定抗体触发的免疫反应的类型。许多癌症免疫治疗药物(包括PD-1和PD-L1抑制剂)都是抗体。例如，靶向PD-1的免疫检查点阻断剂是设计成结合T细胞表达的PD-1并重新激活这些细胞以消除肿瘤的抗体。抗PD-1药物不仅含有结合PD-1的Fab区，而且还含有Fc区。实验研究表明，癌症免疫疗法药物的Fc部分可以影响治疗效果。例如，具有结合抑制性Fc受体的Fc区域的抗PD-1药物可以降低治疗效果。影像学研究进一步表明，抗PD-1药物的Fc区可以结合肿瘤相关巨噬细胞表达的Fc受体。该过程将药物由其预期靶标(即T细胞表面表达的PD-1分子)去除并限制治疗效果。此外，靶向共刺激蛋白CD40的抗体需要与选择性Fc受体结合用于获得最佳治疗效果。总之，这些研究强调了Fc状态在基于抗体的免疫检查点靶向策略中的重要性。

抗体也被称为鼠、嵌合、人源化和人。鼠抗体来自不同的物种并且具有免疫反应的风险。嵌合抗体试图通过将部分抗体替换为相应的人对应物(称为恒定区)来减少鼠抗体的免疫原性。人源化抗体几乎完全是人的；只有可变区的互补决定区源自鼠来源。人抗体是使用未经修饰的人DNA产生的。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。当天然杀伤(NK)细胞上的Fc受体与癌细胞结合的抗体的Fc区相互作用时，NK细胞释放穿孔素和颗粒酶，导致癌细胞凋亡。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)需要抗体与靶细胞表面结合。抗体由结合区(Fab)和Fc区组成，免疫系统细胞可以通过其Fc表面受体检测到该区。Fc受体存在于许多免疫系统细胞中，包括天然杀伤细胞。当天然杀伤细胞遇到抗体包被的细胞时，后者的Fc区与其Fc受体相互作用，释放穿孔素和颗粒酶B以杀伤肿瘤细胞。示例包括利妥昔单抗、奥法木单抗和阿仑单抗。正在开发的抗体改变Fc区，以对特定类型的Fc受体FcγRIIIA具有更高亲和力，这可以显著提高疗效。

补体系统包括血液蛋白质，其在抗体与细胞表面结合后可导致细胞死亡(补体激活途径中的经典补体途径)。通常，该系统处理外来病原体，但在癌症可以被治疗性抗体激活。如果抗体是嵌合的、人源化的或人的，只要其包含IgG1 Fc区，该系统就可以被触发。补体可以通过激活膜攻击复合物来导致细胞死亡，称为补体依赖性细胞毒性；增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；和CR3依赖性细胞毒性。当抗体结合癌细胞表面，C1复合物结合这些抗体，随后在癌细胞膜中形成蛋白质孔时，补体依赖性细胞毒性发生。

FDA批准的抗体

阿仑单抗(Campeth-1H)是抗CD52人源化IgG1单克隆抗体，其用于治疗氟达拉滨难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)、皮肤T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤和T细胞前淋巴细胞白血病。CD52存在于95％以上的外周血淋巴细胞(包括T细胞和B细胞)和单核细胞中，但其在淋巴细胞中的功能尚不清楚。其与CD52结合并通过补体固定和ADCC机制启动其细胞毒性作用。由于抗体靶标(免疫系统的细胞)，阿仑单抗的常见并发症是感染、毒性和骨髓抑制。

阿特珠单抗

德瓦鲁单抗(Imfinzi)是人免疫球蛋白G1κ(IgG1κ)单克隆抗体，其阻断程序性细胞死亡配体1(PD-L1)与PD-1和CD80(B7.1)分子的相互作用。德瓦鲁单抗被批准用于治疗局部晚期或转移性泌尿道上皮癌患者，这些患者在含铂化疗期间或之后出现疾病进展和/或在含铂化疗的新辅助治疗或辅助治疗的12个月内出现疾病进展。

伊匹单抗(Yervoy)是结合表面蛋白CTLA4的人IgG1抗体。在正常生理中，T细胞被两种信号激活：与抗原MHC复合物结合的T细胞受体和与CD80或CD86蛋白结合的T细胞表面受体CD28。CTLA4结合CD80或CD86，阻止CD28与这些表面蛋白的结合，并因此对T细胞的活化起负调节作用。

免疫系统攻击黑素瘤细胞需要活性细胞毒性T细胞。正常抑制活性黑素瘤特异性细胞毒性T细胞可以产生有效的抗肿瘤反应。伊匹单抗可以导致调节性T细胞与细胞毒性T细胞的比率改变，以增加抗肿瘤反应。调节性T细胞抑制其他T细胞，这可能有益于肿瘤。

奥法木单抗是结合CD20的第二代人IgG1抗体。由于慢性淋巴细胞白血病(CLL)的癌细胞通常是表达CD20的B细胞，因此将其用于治疗CLL。不同于结合CD20蛋白大环的利妥昔单抗，奥法木单抗结合一个单独的小环。这可以解释它们的不同特点。相较于利妥昔单抗，奥法木单抗以较低的剂量诱导补体依赖性细胞毒性，并且免疫原性较低。

派姆单抗被批准用于转移性非小细胞肺癌患者的一线治疗，所述患者的癌症根据FDA批准的试验具有高PD-L1表达。

利妥昔单抗是对CD20具有特异性的嵌合单克隆IgG1抗体，开发自其亲本抗体替伊莫单抗(Ibritumomab)。与替伊莫单一样，利妥昔单抗靶向CD20，使其能有效治疗某些B细胞恶性肿瘤。这些包括侵袭性和惰性淋巴瘤，如弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤，以及白血病，如B细胞慢性淋巴细胞白血病。虽然CD20的功能还不清楚，但是CD20可能是参与B细胞活化的钙通道。抗体的作用方式主要是通过诱导ADCC和补体介导的细胞毒性。其他机制包括细胞凋亡和细胞生长停滞。利妥昔单抗还增加癌性B细胞对化疗的敏感性。

细胞因子疗法

细胞因子是通过肿瘤内存在的多种细胞产生的蛋白质。它们可以调节免疫反应。肿瘤常常利用它们使其生长并降低免疫反应。这些免疫调节作用使它们可以被用作激发免疫反应的药物。两种常用的细胞因子是干扰素和白介素。

干扰素是由免疫系统产生的。它们通常参与抗病毒反应，但也有用于癌症。它们分为三组：Ⅰ型(IFNα和IFNβ)、Ⅱ型(IFNγ)和Ⅲ型(IFNλ)。IFNα已被批准用于毛细胞白血病、AIDS相关卡波西肉瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性髓细胞白血病和黑素瘤。I型和II型IFN干扰素已被广泛研究，并且虽然这两种类型都促进抗肿瘤免疫系统的作用，但是只有I型IFN已被证明是临床上有效的。IFNλ在动物模型中显示出良好的抗肿瘤作用。

与I型IFN不同，干扰素γ还未被批准用于任何癌症的治疗。然而，当将干扰素γ给予膀胱癌和黑素瘤患者时，观察到改善存活。在2期和3期卵巢癌患者中出现最有希望的结果。癌细胞中IFN-γ的体外研究更为广泛并且结果表明IFN-γ的抗增殖活性导致生长抑制或细胞死亡，通常由细胞凋亡引起，有时由自噬引起。

白介素对免疫系统有一系列影响。白介素-2用于治疗恶性黑色素瘤和肾细胞癌。在正常生理学中，其促进效应T细胞和调节性T细胞，但是其确切的作用机制尚不清楚。

联合免疫疗法

联合各种免疫疗法如PD1和CTLA4抑制剂可以增强抗肿瘤反应，从而导致持久的反应。

联合肿瘤消融疗法与免疫疗法将增强免疫刺激反应，并且对根治性转移癌治疗具有协同作用。

联合检查点免疫疗法与药物制剂将有可能改善反应，并且这类联合疗法是临床研究高度研究的领域。免疫刺激药物如CSF-1R抑制剂和TLR激动剂在这种情况下尤其有效。

多糖-K

日本厚生劳动省在上世纪80年代批准使用从蘑菇——采绒革盖菌(Coriolusversicolor)中提取的多糖-K来刺激接受化疗的患者的免疫系统。其在美国和其他国家是一种膳食补充剂。

抗CD47疗法

许多肿瘤细胞过表达CD47，以逃避宿主免疫系统的免疫监视。CD47与其受体信号调节蛋白α(SIRPα)结合，并下调肿瘤细胞的吞噬功能。因此，抗CD47疗法旨在恢复肿瘤细胞的清除。此外，越来越多的证据支持肿瘤抗原特异性T细胞反应在抗CD47疗法中的应用。许多疗法正在开发中，包括抗CD47抗体、工程改造的诱饵受体、抗SIRPα抗体和双特异性试剂。截至2017年，多种实体和血液恶性肿瘤正在进行临床测试。

抗GD2抗体

GD2神经节苷脂

细胞表面上的糖类抗原可以用作免疫疗法的靶标。GD2是神经节苷脂，其存在于多种类型的癌细胞表面，包括神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑素瘤、小细胞肺癌、脑肿瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤因氏肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤和其他软组织肉瘤。其通常不在正常组织的表面表达，使其成为免疫治疗的良好靶标。截至2014年，临床试验正在进行中。

免疫检查点

免疫检查点影响免疫系统功能。免疫检查点可以是刺激性的或抑制性的。肿瘤可以使用这些检查点以保护其自身免于免疫系统攻击。目前批准的检查点疗法阻断抑制性检查点受体。因此，阻断对免疫细胞的负反馈信号传导导致对肿瘤的免疫反应增强。

正在进行研究的一种配体-受体相互作用是跨膜程序性细胞死亡1蛋白(PDCD1，PD-1；也称为CD279)与其配体PD-1配体1(PD-L1，CD274)之间的相互作用。细胞表面上的PD-L1与免疫细胞表面的PD1结合，其抑制免疫细胞活性。在PD-L1功能中，对T细胞活性起着关键的调节作用。似乎细胞表面上PD-L1的上调(癌症介导的)可能抑制T细胞，否则可能攻击。癌细胞上的PD-L1还抑制FAS依赖性和干扰素依赖性凋亡，保护细胞免于T细胞产生的细胞毒分子的伤害。结合PD-1或PD-L1并因此阻断相互作用的抗体可以允许T细胞攻击肿瘤。

CTLA-4阻断

FDA批准的第一个检查点抗体是伊匹单抗，在2011年批准用于治疗黑素瘤。其阻断免疫检查点分子CTLA-4。临床试验也已经证明了抗CTLA-4疗法对肺癌或胰腺癌的一些益处，特别是与其他药物联用。正在进行的试验中，在不同类型的癌症上测试CTLA-4阻断与PD-1或PD-L1抑制剂的组合。

然而，使用检查点阻断(特别是CTLA-4阻断抗体)或检查点阻断抗体的组合治疗的患者处于经历免疫相关不良事件的高风险中，诸如皮肤病、胃肠道疾病、内分泌疾病或肝脏自身免疫反应。这很可能是由于抗CTLA-4抗体通过注射给予血流时诱导的T细胞活化的广度所致。

使用小鼠膀胱癌模型，研究人员发现在肿瘤区域中局部注射低剂量的抗CTLA-4具有与递送抗体到血液中时相同的肿瘤抑制能力。与此同时，循环抗体的水平较低，这表示局部给予抗CTLA-4疗法可能导致较少的不良事件。

PD-1抑制剂

使用IgG4 PD1抗体纳武单抗的初步临床试验结果于2010年公布。其在2014年获得批准。纳武单抗被批准用于治疗黑素瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌和霍奇金淋巴瘤。2016年针对非小细胞肺癌临床试验未能达到一线治疗的主要终点，但在随后的治疗线中获得了FDA的批准。派姆单抗是FDA在2014年批准的另一种PD1抑制剂。Keytruda(派姆单抗)被批准用于治疗黑素瘤和肺癌。

抗体BGB-A317是早期临床试验中的PD-1抑制剂(设计为不与Fcγ受体I结合)。

在2016年5月，PD-L1抑制剂阿特珠单抗被批准用于治疗膀胱癌。

目前正在开发的抗PD-L1抗体包括阿维单抗和度伐鲁单抗，以及一种固定生物疗法。

增强免疫疗法的其他模式包括靶向所谓的内在检查点阻断，例如CISH。

溶瘤病毒

溶瘤病毒是一种优先感染并杀死癌细胞的病毒。当被感染的癌细胞被溶瘤破坏时，它们释放出新的感染性病毒颗粒或病毒粒子来帮助破坏剩余的肿瘤。溶瘤病毒被认为不仅能直接破坏肿瘤细胞，而且还能刺激宿主的抗肿瘤免疫反应，用于长期免疫疗法。

病毒作为抗癌药物的潜力在20世纪初首次被认识到，虽然协调的研究工作直到20世纪60年代才开始。已经将多种病毒作为溶瘤剂在临床上测试，所述病毒包括腺病毒、呼吸道肠道病毒、麻疹、单纯疱疹病毒、新城疫病毒和痘苗。T-Vec是FDA批准的第一种用于治疗黑素瘤的溶瘤病毒。多种其他溶瘤病毒正处于II-III期。

多糖

蘑菇中发现的某些化合物(主要是多糖)可以上调免疫系统并且可能具有抗癌特性。例如，实验室研究已经证明β-葡聚糖，诸如香菇多糖将刺激巨噬细胞、NK细胞、T细胞和免疫系统细胞因子，并在临床试验中作为免疫佐剂进行了研究。

新抗原(neoantigen)

许多肿瘤表达突变。这些突变可能产生新的可靶向的抗原(新抗原)用于T细胞免疫疗法。癌症病变中CD8+T细胞的存在(使用RNA测序数据鉴定)在突变负荷高的肿瘤中更高。在许多人类肿瘤中，与天然杀伤细胞和T细胞的细胞溶解活性相关的转录本的水平与突变负荷呈正相关。在使用兰波单抗(lambrolizumab)治疗的非小细胞肺癌患者中，突变负荷与临床反应密切相关。在用伊匹单抗治疗的黑素瘤患者中，长期益处也与较高的突变负荷有关，虽然不太显著。在具有长期临床益处的患者中预测的MHC结合新抗原富集这样的一系列四肽基序，其不存在于没有临床益处或有最小临床益处的患者的肿瘤中。然而，在其他研究中鉴定的人类新抗原并没有显示对四肽特征的偏好。

如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，并且指这样的主要类型的白细胞，其在胸腺中完成成熟并在免疫系统中具有各种作用，包括鉴定体内特异性外来抗原和使其他免疫细胞激活与失活。T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如，初级T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞(例如，Jurkat、SupT1等)或获自哺乳动物的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以是任何发育阶段，包括但不限于：CD4+/CD8+双阳性T细胞，CD4+辅助T细胞(例如，Thl和Th2细胞)，CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)，外周血单核细胞(PBMC)，外周血白细胞(PBL)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，记忆T细胞，原初T细胞，调节性T细胞，γδT细胞(γδT细胞)等。其他类型的辅助T细胞包括诸如Th3、Thl 7、Th9或Tfh细胞的细胞。其他类型的记忆T细胞包括诸如中央记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tern细胞和TEMRA细胞)的细胞。T细胞还可以指经遗传工程改造的T细胞，诸如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞还可以分化自干细胞或祖细胞。

如本文所用，术语“原初T细胞”或Tn指这样的成熟T细胞，其不同于活化或记忆T细胞，其未在外周内遇到其同源抗原。原初T细胞通常这样表征：通过L-选择素(CD62L)的表面表达；不存在活化标志物CD25、CD44或CD69；和不存在记忆CD45RO同种型。它们还表达功能性IL-7受体，其包括亚基IL-7受体a、CD127和共有γ链CD132。在原始状态中，T细胞被认为是静止的和不分裂的，需要共有γ链细胞因子IL-7和IL-15来维持稳态生存机制。

如本文所用，术语“NK细胞”或“天然杀伤细胞”指通过CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺失所定义的外周血淋巴细胞子集。

如本文所用，术语“中央记忆T细胞”或Tcm指这样的T细胞亚组或亚群，相较于效应记忆T细胞或Tern，其具有较低表达或促凋亡信号传导基因(例如Bid、Bnip3和Bad)并具有与转运至次级淋巴器官相关的基因的较高表达，所述基因包括CD62L、CXCR3、CCR7。

如本文所用，术语“干记忆T细胞”或“干细胞记忆T细胞”或Tscm指这样的T细胞亚组或亚群，其能够自我更新并产生Tcm、Tern和Teff(效应T细胞)并表达CD27和淋巴归巢分子，诸如CCR7和CD62L，这是对于介导长期免疫力而言十分重要的特性。如本文所用，术语“NK细胞”或“天然杀伤细胞”指通过CD56或CD16表达和T细胞受体(CD3)的缺失所定义的外周血淋巴细胞子集。如本文所用，术语“适应性NK细胞”和“记忆NK细胞”可以互换使用并指这样的NK细胞子集，其表型为CD3-和CD56+，表达并具有CD57+、NKG2C和CD57中的至少一种，和任选地CD16，但是缺乏下述一种或多种的表达：+，低PLZF，低SYK，FceRy，和低FcsRy，低EAT-2.，低TIGIT，低PD1，低CD7，低CD161，高LILRB1，高CD45RO，和低CD45RA。在一些实施方式中，分离的CD56+NK细胞亚群包含NKG2C和CD57的表达。在一些其它实施方式中，分离的CD56+NK细胞亚群包含表达CD57，CD16，NKG2C，CD57，NKG2D，NCR配体，NKp30，NKp40，NKp46，激活性和抑制性KIR，NKG2A和/或DNAM-1。CD56+可以是暗淡(dim)或明亮(bright)表达。

如本文所用，术语“NKT细胞”或“天然杀伤T细胞”指表达T细胞受体(TCR)的CD-ld限制性T细胞。不同于检测通过常规主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞，NKT细胞识别通过CD1d(非经典MHC分子)呈递的脂质抗原。目前已鉴定出两种NKT细胞。不变或I型NKT细胞表达非常有限的TCR库——典型的a链(人类中为Va24-Jal 8)，其与β链(人类中为ΛíβΙ1)有限的谱相关。第二NKT细胞群称为非经典型或非变异型II型NKT细胞，其展示出更多异质性TCRαβ使用。目前认为I型NKT细胞适合于免疫疗法。适应性或不变(I型)NKT细胞可通过下述至少一种或多种标志物的表达来鉴定：TCR Va24 Jal 8、Vbl l、CDl d、CD3、CD4、CD8、aGalCer、CD161和CD56。

如本文所使用的，术语“分离(的)”或类似表达指已经由其原始环境分离的细胞或细胞群，即分离细胞的环境基本上不含“未分离的”参比细胞存在的环境中存在的至少一种组分。该术语包括当其处于其自然环境(例如组织、活组织检查)中时除去某些或所有组分的细胞。该术语还包括当细胞处于非自然环境(例如培养物，细胞悬浮液)中时除去至少一种、一些或全部组分的细胞。因此，分离的细胞与至少一种组分，包括天然存在或在非自然环境中生长、储存或维持时的其他物质，细胞或细胞群部分或完全分离。分离的细胞的具体示例包括：部分纯的细胞、基本上纯的细胞和在非自然存在的培养基中培养的细胞。分离的细胞可以这样获得：通过将所需细胞或其群与环境中的其他物质或细胞分离，或通过将一个或多个其他细胞群或亚群由环境中移除。如本文所用，术语“纯化”或类似表达指增加纯度。例如，纯度可增加至至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。

如本文所用，当术语“群”关于T、NK或NKT细胞使用时指分别包括两种或多种T、NK或NKT细胞的一组细胞。以T细胞为例，分离或富集的T细胞群可以仅包括一种类型的T细胞，或者可以包括两种或多种类型的T细胞的混合物。分离的T细胞群可以是一种类型T细胞的同质群，也可以是两种或多种类型T细胞的异质群。分离的T细胞群还可以是异质群，其具有T细胞和除了T细胞以外至少一种细胞，例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等。异质群可以具有0.01％到约100％的T细胞。因此，分离的T细胞群可具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的T细胞。分离的T细胞群可包括一种或多种或所有不同类型的T细胞，包括但不限于本文公开的T细胞。在包含超过一种类型的T细胞的分离的T细胞群中，各类型的T细胞的比率可以在0.01％到99.99％之间。分离的群也可以是T细胞的克隆群，其中群中所有的T细胞都是单一T细胞的克隆。

分离的T、NK或NKT细胞群可以获自自然来源，诸如人外周血或脐血。本领域已开发出将细胞从组织或细胞混合物中分离以分离各种细胞类型的多种方法。在一些情况中，这些操作产生相对均一的细胞群。可以通过如本文所述的分选或选择过程或通过本领域已知的其它方法分离T细胞。分离的群中的T细胞的比例可比自然来源中T细胞的比例高至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％或约95％。分离的T细胞群可以是一般的T细胞，也可以是一种或多种特定类型的T细胞。

如本文所用，当术语“亚群”关于T、NK或NKT细胞使用时指这样的T、NK或NKT细胞群，其包含少于存在于自然界中的所有类型的T、NK或NKT细胞。

用于改善基于细胞的过继免疫疗法功效的试剂

本发明提供一种组合物，其包含一种或多种糖基化抑制剂，所述糖基化抑制剂的量足以改善适用于基于细胞的过继疗法的免疫细胞治疗潜力。治疗潜力改善的免疫细胞表现出增殖、持久性、细胞毒性和/或细胞回忆(recall)/记忆改善。免疫细胞可以具有经特异性改善的体内增殖、体内持久性、体内细胞毒性和/或体内细胞回忆/记忆。为了改善免疫细胞治疗潜力，通常需要更高质量的免疫细胞——例如，在T细胞群中，通过维持、扩增、分化和/或去分化增加原初T细胞、干细胞记忆T细胞和/或中央记忆T细胞的数量或比例提示更高质量的T细胞，用于改善体内过继疗法潜力。例如，在NK细胞群中，通过维持、亚型偏斜(subtype skewing)、扩增、分化和/或去分化增加适应性NK细胞的数量或比率提示更高质量的NK细胞，用于改善体内过继疗法潜力。对于NKT细胞群，例如，通过维持、亚型偏斜、扩增、分化和/或去分化增加I型NKT细胞的数量或比率提示更高质量的NKT细胞，用于改善体内过继疗法潜力。

如上文所定义，用一种或多种糖基化抑制剂接触、处理或调节适用于基于细胞过继疗法的免疫细胞。使用一种或多种试剂进行的处理可以改变所述细胞或所述细胞亚群的生物学特性，包括通过调节细胞扩张、维持、分化、去分化和/或存活率，和/或增加增殖、细胞毒性、持久性和/或细胞回忆/记忆，以及因此经处理的细胞的治疗潜力。例如，该处理可以改善体外和体内治疗性免疫细胞存活率。此外，该处理可以改变经处理的细胞群的不同亚群的比率。例如，在一个实施方式中，在使用如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂及其衍生物和类似物进行处理后，分离的T细胞群中原初T细胞、干细胞记忆T细胞和/或中央记忆T细胞的数量和比例增加。在另一实施方式中，在使用如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂及其衍生物和类似物对NK细胞群进行处理后，群中适应性NK细胞的数量和百分比增加。

在不受理论限制的情况下，如上文所定义的本发明的糖基化抑制剂改善用于过继疗法的免疫细胞的治疗潜力，通过调节细胞扩增、代谢和/或细胞分化，经由调节细胞代谢、营养感应、增殖、凋亡、信号转导，与感染过程有关的特性，和/或细胞功能的其他方面。如本领域技术人员将理解的是，本发明的范围还包括类似物或衍生物，包括但不限于上文所定义的本发明所列出的糖基化抑制剂的盐、酯、醚、溶剂化物、水合物、立体异构体或前药。

如本文所用，术语“协同”或“协同性”指两个或多个实体的组合，用于增强效果，从而使两个或多个实体共同作用产生的效果大于其各自效果之和，与之相对的是“拮抗”，其在组合中的两个或多个实体抵消或中和彼此的作用时使用；并且与之相对的是“加成”，其在组合中的两个或多个实体产生几乎等于其各自作用之和的作用时使用。

本发明提供一种组合物，其包含已与如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂接触的分离的免疫细胞群或亚群。在一个实施方式中，分离的免疫细胞群或亚群已经与足以改善免疫细胞治疗潜力的量的如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂接触。在一些实施方式中，经处理的免疫细胞用于基于细胞的过继疗法。本发明还提供了免疫细胞群或亚群，和选自如上文所定义的本发明糖基化抑制剂的一种或多种糖基化抑制剂，其中，使用选自如上文所定义的本发明的糖基化抑制剂的一种或多种糖基化抑制剂对免疫细胞群或亚群进行处理改善了用于过继疗法的免疫细胞的治疗潜力。该处理可以改变免疫细胞的生物学特性，以改善细胞增殖、细胞毒性和持久性，和/或降低细胞疗法的复发率。

在一些实施方式中，免疫细胞群包括T细胞。在一些实施方式中，免疫细胞群包括NK细胞。在一些实施方式中，免疫细胞群包括NKT细胞。

在一些实施方式中，使用如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂接触的T细胞群或亚群包括增加原初T细胞(Tn)、干细胞记忆T细胞(Tscm)和/或中央记忆T细胞(Tcm)的数量或比率，和/或改善细胞增殖、细胞毒性、细胞回忆和/或持久性，相较于未经相同处理处理的T细胞。在一些实施方式中，相较于未经使用上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂的相同处理处理的细胞群中的Tn、Tscm和/或Tcm的数量，Tn、Tscm和/或Tcm的数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或增加至少5、10、15或20倍。

在一些实施方式中，使用如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂接触的NK细胞群或亚群包括增加适应性(或记忆)NK细胞的数量或比率，和/或改善细胞增殖、细胞毒性、细胞回忆和/或持久性，相较于未经相同处理处理的NK细胞。在一些实施方式中，相较于未经使用上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂的相同处理处理的细胞群中适应性NK细胞的数量，适应性NK细胞的数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或增加至少5、10、15或20倍。

在一些实施方式中，T、NK或NKT细胞群或亚群经遗传工程改造，包括插入、缺失或核酸置换。修饰的免疫细胞可表达细胞因子转基因、沉默的抑制性受体；或过表达激活受体，或CAR，用于重新靶向免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞群可以经遗传修饰，所述免疫细胞群分离自对象或供体，用于调节，或分离自或包含于对象/供体的外周血，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织、来自感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾组织，肿瘤。在一些实施方式中，分离的免疫细胞群经遗传工程改造并包括插入、缺失和/或核酸置换。在一些特定的实施方式中，免疫细胞包括编码T细胞受体(TCR)，嵌合抗原受体(CAR)和/或过表达CD16或其变体的外源核酸。

本发明提供一种调节适用于基于过继细胞的疗法的免疫细胞群或亚群的方法，并且该方法包括使免疫细胞与包含如上文所定义的本发明的至少一种试剂的组合物接触。

在一个实施方式中，调节适用于基于过继细胞的疗法的免疫细胞群或亚群的方法包括：使免疫细胞与包含如上文所定义的本发明的至少一种糖基化抑制剂的组合物接触，其中相较于未接触如上文所定义的本发明的糖基化抑制剂的免疫细胞，所述接触的免疫细胞增加细胞扩增、增加一种或多种所需细胞亚群的数量或比例，和/或改善增殖、细胞毒性、细胞回忆和/或持久性。

在一些实施方式中，调节适用于基于过继细胞的疗法的免疫细胞群或亚群的方法包括：使免疫细胞与包含如上文所定义的本发明的至少一种糖基化抑制剂的组合物接触，其中相较于未接触如上文所定义的本发明的糖基化抑制剂的免疫细胞，一种或多种所需细胞亚群的扩增和维持得到改善。

在一些实施方式中，调节适用于基于过继细胞的疗法的免疫细胞群或亚群的方法包括：使免疫细胞与包含如上文所定义的本发明的至少一种试剂的组合物接触，其中相较于未接触如上文所定义的本发明的糖基化抑制剂的免疫细胞，重编程为所需分化状态的群中的免疫细胞的数量或比例增加。

在一个实施方式中，调节适用于基于过继细胞的疗法的免疫细胞群或亚群的方法包括：使免疫细胞与这样的量的包含如上文所定义的本发明的至少一种糖基化抑制剂的组合物接触，相较于未接触如上文所定义的本发明的糖基化抑制剂的免疫细胞，所述量足以增加细胞扩增，增加一种或多种所需免疫细胞亚群的数量或比例，和/或改善免疫细胞的增殖、细胞毒性、细胞回忆和/或持久性。在一个实施方式中，用于免疫细胞处理的试剂介于约0.1nM-约50μΜ。在一个实施方式中，用于免疫细胞处理的试剂为约0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、500nM、1μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ或25μΜ，或两者之间的任何浓度。在一个实施方式中，用于免疫细胞处理的试剂介于约0.1nM-约5nM、介于约1nM-约100nM、介于约50nM-约250nM、介于约100nM-约500nM、介于约250nM-约1μΜ、介于约500nM-约5μΜ、介于约3μΜ-约10μΜ、介于约5μΜ-约15μΜ、介于约12μΜ-约20μΜ或介于约18μΜ-约25μΜ。

在一个实施方式中，调节适用于基于过继细胞的疗法的免疫细胞群或亚群的方法包括：使免疫细胞与包含如上文所定义的本发明的至少一种糖基化抑制剂的组合物接触足够长的时间，相较于未接触如上文所定义的本发明的糖基化抑制剂的免疫细胞，所述时间增加细胞扩增，增加一种或多种所需免疫细胞亚群的数量或比例，和/或改善免疫细胞的增殖、细胞毒性、细胞回忆和/或持久性。在一个实施方式中，免疫细胞与如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂接触至少10分钟、30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、16小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、15天、20天、25天、30天，或者两者之间的任何一段时间。在一个实施方式中，免疫细胞与如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂接触约0.5小时至约2小时、约1小时至约12小时、约10小时至约2天、约1天至约3天、约2天至约5天、约3天至约6天、约5天至约8天、约7天至约14天、约12天至约22天、约14天至约25天、约20天至约30天。在一些实施方式中，免疫细胞与如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂接触不少于16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时或两者之间的任何时间长度。因此，例如，所述足够长的时间不少于15、13、11、9、7、5、3或1小时。在所述方法的一些其它实施方式中，所述足够长的时间不少于24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或两者之间的任何时间长度。因此，例如，所述足够长的时间不少于30、42、54、66、78、90小时。

包括使免疫细胞与包含如上文所定义的本发明的至少一种糖基化抑制剂的组合物接触调节适用于基于过继细胞的疗法的免疫细胞群或亚群的方法还可包括在接触后由免疫细胞富集或分离一种或多种所需亚群，其中所述一种或多种所需亚群选自下组：原初T细胞、干细胞记忆T细胞、中央记忆T细胞、适应性NK细胞和I型NKT细胞。

在一些其它实施方式中，用于调节的分离的免疫细胞是经遗传修饰的(经遗传工程改造的或由重排、突变、基因印迹和/或表观遗传修饰自然衍生的)。在一些实施方式中，用于调节的分离的免疫细胞包含至少一种遗传修饰的模式。在一些实施方式中，分离的免疫细胞群经遗传工程改造并包括插入、缺失和/或核酸置换。在一些特定的实施方式中，免疫细胞包括编码T细胞受体(TCR)，嵌合抗原受体(CAR)和/或过表达CD16或其变体的外源核酸。因此，使用所公开的本发明组合物和方法分离遗传修饰的免疫细胞用于离体调节。在一些实施方式中，在调节后，可以将分离自对象的遗传修饰的免疫细胞给予相同供体或不同患者。在一些实施方式中，用于调节的供体衍生的免疫细胞包括编码T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的外源核酸。

本发明提供了包含分离的免疫细胞群或亚群的组合物，所述分离的免疫细胞群或亚群已经与这样量的如上文所定义的本发明的一种或多种糖基化抑制剂接触，所述量足以改善用于基于过继细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力。

通过将本发明的细胞引入适用于过继细胞疗法的对象，可以改善多种疾病。疾病的示例包括各种自身免疫疾病，包括但不限于：斑秃，自身免疫溶血性贫血，自身免疫肝炎，皮肌炎，糖尿病(1型)，一些形式的青少年特发性关节炎，肾小球肾炎，格雷夫斯氏病，格林-巴利综合征，特发性血小板减少性紫癜，重症肌无力，一些形式的心肌炎，多发性硬化症，天疱疮/类天疱疮，恶性贫血，结节性多动脉炎，多发性肌炎，原发性胆汁性肝硬化，银屑病，类风湿性关节炎，硬皮病/系统性硬化症，干燥综合征，系统性狼疮，红斑狼疮，一些形式的甲状腺炎，一些形式的葡萄膜炎，白癜风，肉芽肿伴多血管炎(韦格纳氏病)；血液恶性肿瘤，包括但不限于急性和慢性白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征；实体瘤，包括但不限于脑、前列腺、乳腺、肺、结肠、子宫、皮肤、肝脏、骨、胰腺、卵巢、睾丸、膀胱、肾、头、颈、胃、宫颈、直肠、喉或食道的肿瘤；和感染，包括但不限于HIV-(人类免疫缺陷病毒)、RSV-(呼吸道合胞病毒)、EBV-(EB病毒)、CMV-(巨细胞病毒)、HBV、HCV、腺病毒和BK多瘤病毒相关病症。

在本文所述的任何方法和组合物的实施方式中，所述癌症是选自下组的实体癌：结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺的非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区域的癌症，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，脊柱肿瘤，脑干胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱导的癌症，所述癌症的组合以及所述癌症的转移性病变。

在本文所述的任何方法和组合物的实施方式中，癌症是选自下述一种或多宗的血液癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或白血病前期。

通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。

图1：肿瘤细胞上的O-糖基化损害CD44v6 CAR-T细胞的识别。a：突变Jurkat样品Cosmc扩增子的DNA测序，相较于K562对照。b：左图：生成的Jurkat模型细胞系的示意图。c：CD44v6 CAR-T细胞(44v6.28z)或对照CD19 CAR-T细胞(19.28z)与糖基化完全的(44v6+/Cosmc+)或不完全的(44v6+/Cosmc-)Jurkat细胞以1:5、1:10、1:25的效应物相对靶标比例(E:T)培养。4天后，通过FACS分析靶细胞杀伤，并表示为消除指数[1-(具有44v6.28z CAR-T细胞的残余肿瘤细胞的数量/具有19.28z CAR-T细胞的残余肿瘤细胞的数量)]。左图：代表性供体的FACS图。右图：获自n＝3个供体的数据(平均值±SEM)。当具有统计学上的显著性时，显示双向ANOVA的结果(***P<0.001；*****P<0.0001)。

图2：肿瘤细胞上的N-糖基化损害CD44v6 CAR-T细胞的识别。通过敲除糖基转移酶Mgat5的表达来抑制T3M4胰腺癌细胞系中的N-糖基化，并通过PHA-L染色来评估糖表型。a：生成的T3M4型胰腺癌细胞系(PDAC)的示意图。b、c：使用结合复合N-聚糖的PHA-L和CAR的靶抗原CD44v6对wt(N-糖基化完全)或Mgat5 ko(N-糖基化缺陷)T3M4肿瘤进行染色。d、e：使用wt或Mgat5-ko或衣霉素处理的(100ng/ml，48小时)T3M4肿瘤攻击CD44v6 CAR-T细胞(44v6.28z)。4天后，以消除指数(d)表示杀伤，并以CD69上调(e)表示T细胞活化。单向ANOVA用于统计分析(*P<0.05；**P<0.01)。f：使用wt或Mgat5 ko胰腺肿瘤细胞刺激后24小时测量CD44v6 CAR T细胞(44v6.28z)的IFNγ和TNFα产生。双向ANOVA用于统计学分析(*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001)。

图3：Mgat5 ko肿瘤在效应细胞中诱导更强的NFAT和NF-kB活化。Jurkat三重报告细胞用CAR-T构建体转导并用wt(N-糖基化完全)或Mgat5 ko(N-糖基化缺陷)T3M4胰腺肿瘤细胞系刺激。a：生成的Jurkat CAR

图4：2DG抑制胰腺肿瘤细胞中的N-糖基化，并对其生存和增殖不具有直接影响。a、b：T3M4胰腺肿瘤细胞用4mM的2DG处理48小时，然后分析相较于Mgat5 ko(N-糖基化缺陷)细胞的糖基化状态。a：PHA-L染色，其显示了相较于对照Mgat5 ko细胞，2DG处理的细胞的糖表型。单向ANOVA用于统计学分析(****P<0.0001)。b：未处理(nihil)或经递增剂量的2DG(4mM或16mM)或经对照衣霉素(Tunica，100ng/ml)处理48小时的肿瘤的总细胞裂解物中β1整合素和CD44v6糖基化的分析。c、d：在处理洗除前，用4mm 2DG处理肿瘤细胞多至48小时。通过PHA-L染色评估肿瘤去糖基化(c)和糖基化(d)的动力学。单向ANOVA用于统计学分析(****P<0.0001)。e、f：用增加浓度的2DG处理48h的肿瘤细胞的剂量反应。通过PHA-L染色(e)确定N-糖基化损伤，并通过乳酸产生(f)测试糖酵解。双向ANOVA用于统计学分析(*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001)。使用4mM 2DG处理48小时后分析肿瘤存活(g)和增殖(h)，并分别表示为7AADpos细胞百分比和CFSE稀释百分比。

图5：用低剂量的2DG阻断糖基化不会损害表面抗原表达。T3M4胰腺肿瘤细胞用4mm的2DG处理48小时，然后分析抗原表达和细胞适合度。a：使用2DG或对照PNG酶(其切割N-聚糖)处理后，胞外去糖基化β1整合素和CD44v6的生物素富集试验。未处理的肿瘤细胞(nihil)作为对照。b：β1整合素和CD44v6在未处理或4mM的2DG处理48小时的肿瘤中的胞外表达。

图6：2DG增加CD44v6 CAR-T细胞的肿瘤识别和杀伤。(a、b)：将CD44v6

图7：2DG既不去糖基化也不增加对健康细胞的杀伤。a、b：将新鲜的血沉棕黄层细胞单独暴露于培养基(nihil)或于4mM 2DG 18小时，然后通过PHA-L染色分析细胞糖基化(a)，并通过7aad-膜联蛋白V染色分析活力(b)。c、d：原代角质细胞暴露于2DG 48小时，然后通过western印迹分析或与CD44v6 CAR-T细胞(44v6.28z)共培养。c：未处理(nihil)或用2DG或对照PNG酶(其切割N-糖基化位点)处理的原代角质细胞中胞外β1整合素和CD44v6的生物素富集分析。d：CD44v6 CAR T细胞(44v6.28z)体外杀伤未处理或未用2DG处理的原代角质细胞。相较于对照CD19 CAR-T细胞(19.28z)，杀伤表示为消除指数。

图8：2DG增加CD44v6 CAR-T细胞的体内胰腺肿瘤识别和杀伤。向NSG小鼠胰腺内注射表达分泌的萤光素酶的0,1x10

图9：2DG增加CEA CAR-T细胞的肿瘤识别和杀伤。a、b：CEA CAR-T细胞(CEA.28z)或对照CD19 CAR T细胞(19.28z)用wt(N-糖基化完全)或Mgat5 ko(N-糖基化缺陷)T3M4胰腺肿瘤细胞攻击。4天后，肿瘤杀伤通过FACS分析并以消除指数(a)表示，而T细胞活化用CD69上调(b)表示。t检验用于统计学分析(*P<0.05)。c：未处理的(nihil)或2DG处理的T3M4胰腺肿瘤刺激Jurkat-CAR+报道细胞的活化时间进程。通过分别测量eGFP和CFP信号的百分比来评估NFAT和NF-kB活化。双向ANOVA用于统计学分析(**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)。d-f：CEA

图10：多种上皮癌表达复杂N-聚糖。a：源自胰腺、肺、乳腺和膀胱肿瘤的细胞系上PHA-L、CD44v6和CEA表达的热图。b：PHA-L(左)或CD44v6(右)的表达和44v6.28z CAR T细胞在1:10的E:T比例下的体外肿瘤杀伤的相关性分析。c：将CD44v6+5637、H1975和PC9细胞暴露于4mM 2DG，持续48小时，然后与CD44v6.28z CAR-T细胞或对照19.28z CAR-T细胞共培养。通过FACS分析肿瘤细胞杀伤并表示为消除指数。当具有统计学显著性时，显示双向ANOVA的结果(*P<0.05)。

图11：多种血液肿瘤表达复杂N-聚糖。a，源自急性髓细胞性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性粒细胞性白血病(CML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和淋巴瘤的细胞系上PHA-L、CD44v6和CD19表达的热图。

发明具体实施方式

材料和方法

转导和培养条件

按照生产商的说明，使用抗CD3/CD28免疫偶联磁珠(bCD3/CD28)(ClinExvivoCD3/CD28；英杰公司(Invitrogen))激活健康供体的T细胞。T细胞通过2轮离心感染(spinoculation)经RV转导或通过过夜孵育经LV转导，并培养于RPMI 1640(吉布可Brl公司(Gibco-Brl))，具有IL-7和IL-15(5ng/mL；派普泰克公司(Peprotech))的胎牛血清(10％，BioWittaker公司)。根据生产商的说明，通过蛋白-L(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))染色进行CAR转导效率和分选。在刺激后第21天进行表型分析和功能测试。肿瘤细胞通过过夜孵育进行LV转导，并用标志物基因进行FACS分选。血液肿瘤、膀胱癌和肺癌细胞在RPMI 1640(吉布可Brl公司)中培养，而胰腺肿瘤细胞在IMDM(吉布可Brl公司)中培养。T细胞和肿瘤细胞生长的所有培养基补充青霉素(100UI/ml；法玛西亚公司Pharmacia))、链霉素(100UI/ml；百时美施贵宝公司(Bristol-Meyers Squibb))、谷氨酰胺(2mM；吉布可公司(Gibco))和胎牛血清(10％，BioWhittaker公司)。XG-6和XG-7细胞在加入IL-6(2ng/ml，派普泰克公司)的情况下培养。原代角质细胞购自隆萨公司(Lonza)(LO192627)，并按照生产商的说明与人角质细胞生长补充剂(英杰公司，S-001-5)在EpiLife(英杰公司，M-EPI-500-CA)中培养。

Cosmc PCR和测序

使用QIAamp DNA迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen))由Jurkat和K562细胞分离总基因组DNA。对于Cosmc基因PCR，正向引物是：5’-CTCCATAGAGGAGTTGTTGC-3’(SEQ ID NO.1)，并且反向引物是：5’-TCACGCTTTTCTACCACTTC-3’(SEQ ID NO.2)。在琼脂糖凝胶上分析预期的1218bp的PCR条带产物，提取并测序。

逆转录病毒和慢病毒构建体

为了生成Cosmc慢病毒(LV)表达载体，通过GeneArt(赛默飞世尔公司)合成DNA序列并克隆到具有PGK双向启动子的自失活LV载体中，所述PGK双向启动子分别驱动CD44v6或Cosmc分子和标志物基因NGFR或eGFP的共表达。发明人通过将特定scFvs CD44v6，BIWA8mAb；CEA，BW431-26 mAb；CD19，FMC63 mAb)克隆到具有IgG1驱动的铰链区间隔子、CD28共刺激胞内结构域和TCRζ链的CAR主链生成了CD44v6、CEA、CD19 CAR构建体。将所有的CAR构建体表达到病毒载体中并在293T细胞中产生上清液。如Casucci M等,Blood.2013年11月14日；122(20):3392中所述使用逆转录病毒载体，而慢病毒载体如Amendola M等,NatBiotechnol 2005年1月；23(1):108-16中所述。如之前所述使用CD44v6慢病毒表达载体和分泌的萤光素酶表达载体(Norelli等,Nat Med 2018,24,第739–748页；Bondanza和Casucci,《分子生物学方法1393》(Methods in molecular biology 1393),肿瘤免疫学方法和方案(Tumor immunology methods and protocols),第10章)。

生成并克隆到病毒载体主链的所有序列如下所示。

COSMC序列(SEQ ID NO.3):

MLSESSSFLKGVMLGSIFCALITMLGHIRIGHGNRMHHHEHHHLQAPNKEDILKISEDERMELSKSFRVYCIILVKPKDVSLWAAVKETWTKHCDKAEFFSSENVKVFESINMDTNDMWLMMRKAYKYAFDKYRDQYNWFFLARPTTFAIIENLKYFLLKKDPSQPFYLGHTIKSGDLEYVGMEGGIVLSVESMKRLNSLLNIPEKCPEQGGMIWKISEDKQLAVCLKYAGVFAENAEDADGKDVFNTKSVGLSIKEAMTYHPNQVVEGCCSDMAVTFNGLTPNQMHVMMYGVYRLRAFGHIFNDALVFLPPNGSDND

CD19-scFv(FMC63)序列(SEQ ID NO.4):

CD44v6-scFv(Biwa-8)序列(SEQ ID NO.5):

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWLQQKPGQAPRILIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIKRGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYLDSIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGLDYWGRGTLVTVSS

CEA-scFv(BW431-26)序列(SEQ ID NO.6):

MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVHSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTISSGYSWHWVRQPPGRGLEWIGYIQYSGITNYNPSLKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCAREDYDYHWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSTSSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQWSSYPTFGQGTKVEIKV

铰链区序列(SEQ ID NO.7):

EPKSCDKTHTCPPCP

CD28序列(SEQ ID NO.8):

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

CD3ζ链序列(SEQ ID NO.9):

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*

2DG处理

为了进行剂量评估，将肿瘤细胞暴露于2、4、8、16或64mM 2DG(D8375，西格玛奥里奇公司(Sigma-Aldrich))中，并在48小时后，分别使用流式计数荧光球(Flow-CountFluorospheres，布雷亚贝克曼库尔特公司(Beckmancouler))、7-AAD和CFSE通过FACS确定坏死和增殖细胞的绝对细胞数和百分比。对于药代动力学研究，用4mM 2DG处理肿瘤细胞，并通过PHA-L染色法在处理或洗除的不同时间点评估表面N-糖基化，以分别评估去糖基化和糖基化的动力学。对于安全性研究，在通过PHA-L染色评估糖表型和通过7aad/膜联蛋白V染色评估细胞活力之前，在IL-2(100IU/mL；希龙公司(Chiron))、IL-21(10ng/mL；派普泰克公司)和IL-15(5ng/mL；派普泰克公司)存在的情况下，用4mM 2DG处理血沉棕黄层细胞18小时。

体外共培养试验

在不存在IL-7和IL-15的情况下，将来自健康供体的CEA或CD44v6 CAR-T细胞以1:5、1:10、1:25的E:T比例与靶细胞共培养。将经不相关CAR(CD19 CAR T)转导的T细胞作为对照。24小时或96小时后，使用流式计数荧光球(布雷亚贝克曼库尔特公司)通过FACS分析共培养物，并如下所示计算用消除指数表示的靶细胞杀伤：1-(具有实验性CAR-T细胞的残留靶细胞数/具有不相关CAR-T细胞的残留靶细胞数)。在将CAR-T细胞和2DG组合的共培养试验中，将靶细胞暴露于4mM 2DG 48小时，然后洗涤，与实验性或不相关CAR-T细胞共培养并如上所述进行分析。在这些实验中，单独的2DG消除指数如下所示计算：1-(在补充用2DG的培养基中培养的靶细胞数/在单独的培养基中培养的靶细胞数)。Jurkat CAR-TPR与肿瘤细胞以1:1的E:T比例进行共培养。作为对照，Jurkat CAR-TPR细胞用50ng/mL佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)或1μg/mL离子霉素或两者的组合处理。24小时后评估荧光的上调。

流式细胞术

发明人使用对人CD44v6(e-生物科学公司(e-Bioscience))、CD3、CD45、NGFR、LAG3(BD生物科学公司(BD-Bioscience))、HLA-DR、PD1、TIM3(白乐津公司(Biolegend))、CD57(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))具有特异性的mAB。为了确定细胞活力，使用7-氨基放线菌素D(7-AAD)、膜联蛋白V或DAPI试剂。对于LV转导的肿瘤细胞，通过直接荧光分析GFP表达。样品通过荧光活化的细胞分选(FACS)Canto流式细胞仪(BD生物科学公司)进行分析，而数据通过FlowJo软件(树星公司有限公司(Tree Star,Inc.))进行分析。对于支化N-聚糖表达分析，根据生产商的说明，将细胞与生物素化菜豆(Phaseolus vulgaris)白血球凝集素(PHA-L；Caderlane)孵育1小时，用PE偶联的链霉亲和素洗涤和孵育，并通过流式细胞术分析。

CAR

三重报告Jurkat T细胞系(Jurkat TPR)由Steinberger小组馈赠(S.Jutz等,Journal of Immunological Methods 430(2016)10–20)。首先，通过用表达CAR构建体的慢病毒载体(CD44v6(44v6.28z)或CD19(19.28z)特异性)过夜孵育来转导细胞。然后，通过视检标志物基因NGFR阳性细胞的百分比，在一周后通过流式细胞术检测转导效率。最后，CAR

Mgat5敲除胰腺肿瘤细胞的生成

编码Mgat5特异性gRNA和Cas9蛋白的慢病毒载体质粒购自ABM good(K1298706)。慢病毒载体产生后，将T3M4胰腺肿瘤细胞系转导并在补充有嘌呤霉素的培养基中培养，用于根据制造说明书(赛默飞世尔公司，A1113803)进行阳性选择。

Western印迹试验

肿瘤细胞或健康原代角质细胞用单独培养基或补充有4mM 2DG的培养基处理48小时，裂解并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。去糖基化被评估为分子量偏移。对于选择性细胞膜蛋白分析，根据生产商说明(赛默飞世尔公司)进行生物素化分析。按照生产商说明书的建议，使用PNG酶F(NEB，P0704)处理细胞裂解物。

体内功效实验

所有实验均由圣拉斐尔大学医院和科学研究所(San Raffaele UniversityHospital and Scientific Institute)的机构动物护理和使用委员会(IACUC)以及意大利政府卫生研究所(意大利罗马)批准。NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl)获自杰克逊实验室公司(Jackson Laboratories)，并保存于单独通风笼内的无特定病原体(SPF)设施中。向9周龄NSG小鼠胰腺内注射表达分泌的萤光素酶的0,1x10

乳酸产生试验

根据生产商的说明，使用乳酸-Glo(Lactate-Glo)试验(普洛麦格公司(Promega))，在以2、4、8、16或64mM 2DG剂量的2DG处理48小时后评估乳酸产生。

统计学分析

使用Graphpad Prism 5.0a软件版本进行统计分析。所有数据表示为平均值+/-SEM。使用T检验、单向或双向ANOVA确定样品间差异的统计学显著性.P值<0.05的差异被认为具有统计学显著性。

实施例

实施例1：糖基化保护CD44v6+肿瘤细胞免于CD44v6CAR-T细胞杀伤

发明人最近开发并优化了CD44v6 CAR，其能够应付多种肿瘤类型，包括急性髓系白血病、多发性骨髓瘤和多种上皮癌(Casucci M等,Blood.2013年11月14日；122(20):3392-4)。因为CD44v6被广泛地糖基化(Ponta H等,Nat Rev Mol Cell Biol.2003年1月；4(1):33-45)和糖链可能是空间膨胀的，发明人研究了糖基化(O-或N-连接)是否会影响CD44v6 CAR-T细胞的靶向。作为回答该问题的第一步，发明人利用了Jurkat T细胞白血病细胞系，其自然特征是T合酶伴侣蛋白Cosmc的功能缺失突变导致O-糖基化缺陷(Ju T等,Proc Natl Acad Sci USA.2002年12月24日；99(26):16613-8；图1a)。为了恢复O-糖基化并为CAR-T细胞提供抗原，用携带Cosmc和CD44v6以及选择标志物的慢病毒载体转导Jurkat细胞(图1b)。引人注目的是，相对O-糖基化完全的Jurkat细胞(44v6pos/Cosmcpos)，CD44v6CAR-T细胞更高效地识别和杀伤O-糖基化不完全的Jurkat细胞(44v6pos/Cosmcneg)(图1c)。因此，一旦用CD44v6基因转导，天然O-糖基化完全的K562细胞被以类似于工程改造的糖基化完全的Jurkat细胞的方式裂解。这些结果表明，O-糖基化可能阻碍CAR-T细胞对靶细胞的杀伤。

为了验证N-糖基化的影响，发明人通过使用CRISPR-Cas9技术敲除糖基转移酶Mgat5的表达来生成N-糖基化缺陷型胰腺肿瘤细胞，例如，T3M4(图2a)。对N-糖基化的抑制通过减少与PHA-L(图2b)的结合得到证实，所述PHA-L是特异性结合Mgat5修饰的支化N-聚糖的凝集素。重要的是，糖基化抑制并不显著干扰细胞膜上的CD44v6暴露，这是CAR靶向的先决条件(图2c)。引人注目的是，阻碍T3M4细胞上的N-糖基化显著改善了CD44v6 CAR-T细胞对其的清除(图2d)。这种作用与CAR-T细胞活化改善(图2e)和细胞因子释放(图2f)相关，这表明更熟练的抗原结合。使用N-糖基化抑制剂衣霉素证实了这些发现。为了验证抗肿瘤活性改善是否源于不同的CAR诱导的胞内信号传导事件，发明人利用了“三参数报告物”(TPR)Jurkat T细胞(Jutz S等,J Immunol Methods.2016年3月；430:10-20和图3a)，其中将不同的荧光蛋白置于T细胞活化期间开启的转录因子(TF)的特定控制下，例如，NFAT、NF-kB和AP-1。这些细胞经CD44v6 CAR转导并用不同的靶细胞刺激。在N-糖基化缺陷型T3M4细胞中，TF升高更强(图3b，左图)。如所预期，在用CD19 CAR转导并用CD19阴性靶细胞刺激的TPR-Jurkat细胞中未观察到活化(图3b，右图)。

总之，这些结果表明糖基化抑制CAR-T细胞的靶细胞清除，可能是通过空间干扰抗原识别。考虑到实体瘤的特征在于多个糖基化改变(Pinho SS等,Nat Rev Cancer.2015年9月；15(9):540-55)，特别是包括增加N-聚糖的支化，评估了生成这类笨重糖结构的药理学干扰，以验证其是否可能增加肿瘤细胞识别和CAR-T细胞的杀伤。

实施例2：2DG阻断胰腺癌细胞上的N-糖基化

为了寻找与CAR-T细胞安全联用的糖基化抑制剂，发明人将注意力集中在2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)上。2DG是糖酵解和N-连接的糖基化的有效抑制剂，其在人中显示出良好的耐受性，这可能归因于由于瓦博格效应，相较于健康细胞，其在肿瘤细胞中优先积累(SinghD等,Strahlenther Onkol.2005年8月；181(8):507-14；Stein M等,Prostate.2010年9月15日；70(13):1388-94；Raez LE等,Cancer Chemother Pharmacol.2013年2月；71(2):523-30；Magistroni R等,J Nephrol.2017年8月；30(4):511-519；Xi H等,IUBMB Life.2014年2月；66(2):110-21)。出于这些原因，发明人们开始研究2DG是否可以增加CAR-T细胞针对实体瘤的抗肿瘤活性。作为第一肿瘤模型，他们使用了胰腺癌，这是一种对于开发新的治疗方案尤为迫切的癌症(只有5％的人在确诊5年后仍然活着，世界癌症报告2014WHO(WorldCancer Report 2014WHO))。

类似于敲除Mgat5基因后发生的情况，2DG能够有效地抑制N-糖基化，如与PHA-L结合减少(图4a)和用于western印迹分析的模型蛋白β-1整合素的分子量改变(图4b)所示。这种作用在5小时后(图4c)已经可以检测到，并且在洗除2DG后持续24小时(图4d)。此外，其在使用低剂量的2DG(图4e)时已经存在，其不能抑制糖酵解(图4f)，这表明用2DG进行N-糖基化的选择性阻断是可行的。值得注意的是，低剂量2DG对肿瘤细胞活力(图4g)和增殖(图4h)没有影响，这表明2DG作为单一疗法的疗效不佳。

因为细胞表面上的表达是CAR靶向的先决条件，发明人试图检测用2DG处理后产生的去糖基化抗原否能够到达细胞膜。为此，他们进行了生物素富集的western印迹分析(见方法)。重要的是，在使用2DG处理后，在表面蛋白质中清楚地检测到β-1整合素和CD44v6的去糖基化形式(图5a)。使用能够切割成熟蛋白质上的聚糖的PNG酶处理被用作对照并产生了类似的结果。通过FACS测量的β-1整合素和CD44v6的表面表达水平也保持不变(图5b)。

总之，这些结果表明，低剂量的2DG本身对肿瘤细胞没有细胞毒性，但是可以抑制N-糖基化，并且不干扰细胞表面上的蛋白质暴露。

实施例3：2DG增加CD44v6 CAR-T细胞的胰腺癌细胞杀伤

在证明2DG诱导去糖基化抗原暴露后，发明人研究了基于2DG加CAR-T细胞的联合方法的抗肿瘤活性。

为了避免2DG对T细胞活性潜在的混淆，将肿瘤细胞用2DG预处理，然后在没有2DG的情况下与CAR-T细胞共培养。虽然表达CD44v6，但是PT45和T3M4仅被CD44v6 CAR-T细胞较差地靶向(图6a-b，红色条和线)。然而，引人注目的是，经2DG预处理使肿瘤细胞对CD44v6CAR-T细胞的识别敏感，显著增加了它们的消除(图6a-b，蓝色条和线)。值得注意的是，这种作用不是简单的累加作用，而是协同作用，因为其高于单独使用2DG(缺乏)和CAR-T细胞(最小)各自的预期的单独抗肿瘤活性。

通过利用CAR转导的Jurkat TPR细胞，发明人证明了肿瘤细胞杀伤改善也与T细胞活化改善有关(图6c)，正如Mgat5敲除细胞的情况(参见实施例1)。

实施例4：2DG不增加CD44v6 CAR T细胞对健康角质细胞的杀伤

为了阐明该方法的安全性，发明人首先评估了单独使用2DG对健康外周血单核细胞(PBMC)的影响。能够抑制肿瘤糖基化的相同剂量的2DG无法干扰PBMC糖基化(图7a)并且不影响CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD14+单核细胞和CD15+粒细胞的活力(图7b)。

接下来，发明人研究了该联合方法对有可能被CAR-T细胞靶向的健康细胞的影响。它们之前报道了这样的体外(Casucci M等,Blood.2013年11月14日；122(20):3392-4)和体内测试，虽然人角质细胞表达CD44v6，但其不被CD44v6 CAR-T细胞靶向。为了验证2DG是否能增加其杀伤，在与CD44v6 CAR-T细胞共培养之前，将人原代角质细胞暴露于2DG。重要的是，能够增强肿瘤细胞识别的相同剂量的2DG无法抑制角质细胞糖基化(图7c)并增加CD44v6 CAR-T细胞对角质细胞的清除(图7d)。这些数据支持了糖基化抑制剂改善CAR-T细胞治疗的功效。特别是由于瓦博格效应，2DG改善了CD44v6 CAR-T细胞治疗的功效，并且不会增加针对健康组织的毒性。

实施例5：使用2DG进行的处理使胰腺肿瘤细胞对体内CD44v6 CAR-T细胞疗法敏感

然后，发明人试图评估糖基化抑制剂(诸如2DG)在胰腺癌异种移植小鼠模型中是否可以使肿瘤细胞对CAR-T细胞的杀伤敏感。为此，他们使用了两种不同的设置，即具有高CAR-T细胞剂量(图8a)的最小残留病(MRD)以及具有低CAR-T细胞剂量(图8b)的高肿瘤负荷(HTB)，从而分别在更宽松的设置和更具挑战性的设置中测试组合治疗模式。简言之，向NSG小鼠注射表达分泌的萤光素酶的44v6pos/19neg T3M4细胞，其允许通过简单分析血液样品来方便地监测肿瘤生长(Falcone L等,Methods Mol Biol.2016；1393:105-11)。2天或7天后(分别为MRD和HTB设置)，小鼠接受2DG并用不同剂量的CD44v6或CD19CAR-T细胞处理(参见方法)。通过血液样品的生物发光分析每周监测肿瘤生长。而在MRD设置中，CD44v6 CAR-T细胞能够单独清除胰腺肿瘤细胞(图8c)，在HTB设置中，接受CD44v6 CAR-T细胞的小鼠显著受益于2DG给予(图8d)。有趣的是，处死时，相较于未接受2DG的小鼠，来自接受2DG的小鼠的肿瘤浸润性CD44v6 CAR-T细胞包括显著较低频率的表达衰竭和衰老标志物的细胞，这表明在长期内具有更好的抗肿瘤活性(图8e)。总之，这些结果显示了联合治疗针对极具侵袭性的胰腺癌细胞系的有效性，即使在其中CAR-T细胞单独不能介导任何抗肿瘤活性的情况下也是如此。

实施例6：联合方法对于不同CAR特异性是可行的

为了验证2DG和CAR-T细胞之间的协同效应对于其他CAR特异性是否是共同的，发明人利用了CEA CAR-T细胞。发明人选择CEA是因为其是在多种实体肿瘤中过表达的高度糖基化的蛋白质(60％的重量来自碳水化合物)。最近，CEA CAR-T细胞在结直肠癌或胰腺癌的肝转移患者中被证明具有功效，并且不存在明显的毒性(Katz SC等,Clin CancerRes.2015年7月15日；21(14):3149-59；Zhang C等,Mol Ther.May 3；25(5):1248-1258)，这表明增加CEA-CAR-T细胞的抗肿瘤功效的策略是该领域的研究热点。

在本发明中，类似于使用CD44v6 CAR-T细胞(实施例1)观察到的结果，发明人证明了相比N-糖基化完全的细胞，CEA CAR-T细胞更高效地杀伤N-糖基化缺陷型T3M4细胞(图9a)。同样在这种情况下，如通过分析CD69上调(图9b)以及通过利用如实施例1所述的Jurkat TPR细胞(图9c)所示，肿瘤杀伤增加伴随着T细胞活化增加。

最重要的是，虽然使用2DG进行预处理并不增加CEA CAR-T细胞对CEAneg PT45肿瘤细胞的识别(图9d)，但是其显著改善了CEApos BxPC3和T3M4肿瘤细胞的清除(图9e-f)。同样，这类改善与增加CAR-T细胞活化(图9g-h)和细胞因子释放(图9i)相关联。

总之，这些结果支持该联合策略在不同CAR特异性下的应用。

实施例7：该协同效应适用于不同的肿瘤类型

为了验证糖基化抑制剂(例如2DG)和CAR-T细胞之间的协同效应是否可以利用不同的肿瘤类型，发明人通过利用PHA-L染色筛选了不同的实体瘤细胞系(图10a)和血液肿瘤细胞系(图11a)以了解它们的糖基化状态。尽管存在预期的变异性，但是来自实体和血液类型的几种癌细胞系被发现为高度N-糖基化的，这表明不同的癌症类型，包括胰腺、肺和膀胱实体瘤以及AML、ALL和MM可以通过结合糖基化抑制剂和CAR-T细胞治疗的方法被靶向。

为了从功能上证明这一点，发明人对经分析的一些细胞系进行了共培养分析。引人注目的是，观察到N-糖基化水平与CD44v6 CAR-T细胞的杀伤之间呈负相关(图10b)，这进一步支持糖基化对CAR-T细胞识别产生负面影响。此外，发明人证明了使用抑制剂，特别是2DG，来抑制糖基化，特别是N-糖基化，可以显著增加仅靠CAR-T细胞几乎无法靶向的高度糖基化的肿瘤的消除(图10c)。

总之，这些结果支持该联合策略用于多种肿瘤类型治疗的应用。

序列表

<110> 圣拉斐尔医院有限公司（Ospedale San Raffaele Srl）

圣拉斐尔基金会中心（Fondazione Centro San Raffaele）

<120> 与免疫疗法组合

<130> PCT 140715

<150> EP18185006.6

<151> 2018-07-23

<150> EP19161718.2

<151> 2019-03-08

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

ctccatagag gagttgttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

tcacgctttt ctaccacttc 20

<210> 3

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Met Leu Ser Glu Ser Ser Ser Phe Leu Lys Gly Val Met Leu Gly Ser

1 5 10 15

Ile Phe Cys Ala Leu Ile Thr Met Leu Gly His Ile Arg Ile Gly His

20 25 30

Gly Asn Arg Met His His His Glu His His His Leu Gln Ala Pro Asn

35 40 45

Lys Glu Asp Ile Leu Lys Ile Ser Glu Asp Glu Arg Met Glu Leu Ser

50 55 60

Lys Ser Phe Arg Val Tyr Cys Ile Ile Leu Val Lys Pro Lys Asp Val

65 70 75 80

Ser Leu Trp Ala Ala Val Lys Glu Thr Trp Thr Lys His Cys Asp Lys

85 90 95

Ala Glu Phe Phe Ser Ser Glu Asn Val Lys Val Phe Glu Ser Ile Asn

100 105 110

Met Asp Thr Asn Asp Met Trp Leu Met Met Arg Lys Ala Tyr Lys Tyr

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130 135 140

Pro Thr Thr Phe Ala Ile Ile Glu Asn Leu Lys Tyr Phe Leu Leu Lys

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Lys Asp Pro Ser Gln Pro Phe Tyr Leu Gly His Thr Ile Lys Ser Gly

165 170 175

Asp Leu Glu Tyr Val Gly Met Glu Gly Gly Ile Val Leu Ser Val Glu

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Ser Met Lys Arg Leu Asn Ser Leu Leu Asn Ile Pro Glu Lys Cys Pro

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Val Cys Leu Lys Tyr Ala Gly Val Phe Ala Glu Asn Ala Glu Asp Ala

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Asp Gly Lys Asp Val Phe Asn Thr Lys Ser Val Gly Leu Ser Ile Lys

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> 合成的

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Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

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20 25 30

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100 105 110

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130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

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165 170 175

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Thr Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

180 185 190

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195 200 205

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

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<220>

<223> 合成的

<400> 9

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