一种利用裂殖壶藻渣提高多鳞白甲鱼品质的功能性饲料

摘要

本发明提供了一种利用裂殖壶藻渣提高多鳞白甲鱼品质的功能性饲料的制备方法。步骤如下：称小料：使用电子天平称量Ca(H2PO4)2和膨润土，充分混匀；搓油：在混合好的小料中先添加入豆粕，鼓气膨胀后将小料与其充分混匀，加入豆油，充分搓匀；称大料：依次加鱼粉、肉骨粉、等入搓好油的大盆中，并依次充分混匀；加水制粒；清理制粒机，调整压轮和环模之间的缝隙，调整制粒机加料量，使其均匀出料；饲料风干，保存。本发明饲料显著提高了多鳞白甲鱼肌肉的DHA含量，降低了腹腔脂肪和肝脏等不可食用的内脏部分的比重，提高了鱼体的抗氧化能力，解决了普通商品料喂养下鱼体内DHA含量低、腹腔脂肪蓄积严重、健康状况差等问题。

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类饲料领域，涉及特殊原料的使用、专用饲料的配制，具体涉及一种利用裂殖壶藻渣提高多鳞白甲鱼品质的功能性饲料。

背景技术

多鳞白甲鱼(Onychostoma macrolepis)属鲤形目，鲤科，白甲鱼属(Onychostoma)，又名多鳞铲颌鱼、赤鳞鱼、钱鱼，主要分布于嘉陵江水系和汉水水系的中上游等地区，因其独特的地理分布和对生态环境的适应性，被称为鱼类的“活化石”。多鳞白甲鱼因其肉质鲜美、营养丰富和独特的保健价值，因此具有很高的经济价值。值得一提的是，在天然环境中生产的多鳞白甲鱼，其体内n-3LC-PUFA含量较高。

截止目前，生产中尚无多鳞白甲鱼的专用饲料，通常用普通商品饲料进行投喂。普通商品饲料无法满足多鳞白甲鱼的最适营养需求，导致其n-3LC-PUFA含量低、生长缓慢、健康状况较差，且腹腔脂肪堆积等问题严重。

裂殖壶藻(Schizochytrium sp.)，又名裂殖壶菌、裂壶藻，属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，其脂肪含量可占细胞干重50％以上，n-3LC-PUFA之一的DHA 含量高达20％以上。据报道，裂殖壶藻可显著增加DHA在鱼体内的蓄积，改善鱼体健康状况，提升水产品质量。本发明使用的裂殖壶藻渣是裂殖壶藻提油后的副产物，呈黑色碎末状，经检测仍含有一定量的DHA。因此，在满足多鳞白甲鱼特定的营养需求的配合饲料中添加适量的裂殖壶藻渣，进行专用饲料的创制，可克服常规饲料的缺点，提升多鳞白甲鱼的品质，具有较为重要的意义。

发明内容

要解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种添加了裂殖壶藻渣的多鳞白甲鱼专用饲料的配制方法和应用，以解决现阶段多鳞白甲鱼肌肉中n-3LC-PUFA含量低、体内脂肪蓄积严重、健康状况差等问题。

技术方案：一种利用裂殖壶藻渣提高多鳞白甲鱼品质的功能性饲料，包括以下成分：鱼粉、肉骨粉、豆粕、菜粕、棉粕、面粉、米糠、裂殖壶藻渣、豆油、Ca(H

进一步的，所述鱼粉260份、肉骨粉110份、豆粕120份、菜粕60份、棉粕80份、面粉120-213 份、米糠66-88.5份、裂殖壶藻渣30-120份、豆油19-31份、Ca(H

进一步的，所述预混料1000份包括：硫酸铝钾0.159份、碳酸钙18.101份、氯化钴0.07份、硫酸镁5.216份、硫酸锰0.007份、氯化钾16.553份、碘化钾0.014份、碳酸锌0.192份、硒酸钠0.006份、硫酸铜0.075份、柠檬酸铁1.338份、含硫胺素5份、核黄素5份、维生素A0.825份、维生素E 26.72份、维生素D30.06份、甲萘醌4份、盐酸吡哆醇4份、氰钴胺0.01 份、生物素0.6份、泛酸钙10份、叶酸1.5份、烟酸20份、肌醇200份，余量为石灰石载体。进一步的，所述裂殖壶藻渣的添加量为3-12％。

进一步的，所述鱼粉、肉骨粉、豆粕、菜粕、棉粕、面粉、米糠、裂殖壶藻渣、豆油、Ca(H

上述利用裂殖壶藻渣提高多鳞白甲鱼品质的功能性饲料的制备方法，制备步骤如下：

S1：称小料：使用精度为0.001的电子天平准确称量充分粉碎的Ca(H

S2：搓油：在混合好的小料中先添加入豆粕，鼓气膨胀后将小料与其充分混匀后，倒入大塑料盆中，加入豆油，用手充分搓匀；

S3：称大料：依次加鱼粉、肉骨粉、棉粕、菜粕、面粉、米糠、裂殖壶藻渣、预混料入搓好油的大盆中，并依次充分混匀；

S4：加水：加10％～12％的纯净水进行制粒，用搅拌机多次少量加入直至混匀；

S5：制粒：清理制粒机，调整压轮和环模之间的缝隙，调整制粒机加料量约100～200g/次，使其均匀出料；

S6：饲料风干：将制作好的饲料均匀摊晾在塑料纸上，每隔1h翻晾，阴雨天注意增加翻晾次数，直至饲料颗粒干燥，轻捏不碎为干燥标准，放置-20℃下长期保存。

进一步的，所述S5中压轮和环模之间的缝隙为0.03～0.05mm。

有益效果：

1、本发明饲料显著提高了多鳞白甲鱼肌肉的DHA含量，降低了腹腔脂肪和肝脏等不可食用的内脏部分的比重，提高了鱼体的抗氧化能力，解决了普通商品料喂养下鱼体内DHA含量低，腹腔脂肪蓄积严重、健康状况差等问题。

2、本发明通过添加6％～9％的裂殖壶藻渣所配置的功能性饲料，可显著降低多鳞白甲鱼体脂蓄积，减少腹腔脂肪和肝脏等不可食用的内脏比例，增加多鳞白甲鱼肌肉中DHA的沉积，增高肠道绒毛长度，提高肝脏和血清的抗氧化能力，提高多鳞白甲鱼健康状况，改善鱼体体质差等作用。

附图说明

图1为多鳞白甲鱼的肌肉脂肪酸(占总脂肪酸的百分比)的主成分分析(PCA)，(A)主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的因子载荷图；(B)因子得分图。

图2为裂殖壶藻渣对肝脏细胞组织结构的影响，肝脏细胞组织结构(苏木精-伊红染色，放大 200倍)；裂殖壶藻渣对H&E染色中每单位面积(375000μm

图3为裂殖壶藻渣对肠道组织结构的影响，不同裂殖壶藻渣添加水平对中肠组织结构的影响；不同裂殖壶藻渣添加水平对肠道绒毛高度的影响，所有数据以平均值±标准差显示，组间不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图4为裂殖壶藻渣对腹腔脂肪细胞组织结构的影响，不同裂殖壶藻渣添加水平对腹腔脂肪细胞组织结构的影响；腹腔脂肪组织的单位面积内脂肪细胞平均面积大小，所有数据以平均值±标准差显示。组间不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图5为不同裂殖壶藻渣添加水平对多鳞白甲鱼肝脏抗氧化指标的影响，其中，(A)肝脏中的超氧化物歧化酶(SOD)活性(n＝3)、(B)肝脏中的丙二醛(MDA)含量(n＝3)。

图6为不同裂殖壶藻渣添加水平对多鳞白甲鱼血清中抗氧化指标的影响，其中，(A)血清中的超氧化物歧化酶(SOD)活性(n＝3)、(B)血清中的丙二醛(MDA)含量(n＝3)。

图7为裂殖壶藻渣图。

具体实施方式

本发明提出了一种利用裂殖壶藻渣提高多鳞白甲鱼品质的功能性饲料，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下将配合实施例来对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

1.1材料与方法

1.1.1饲料配方

前期本实验室通过试验，研究出多鳞白甲鱼最适的蛋白需求为37.5％，最适脂肪需求为 9.68％)。

在满足上述营养需求的条件下，分别添加0％，3％，6％，9％，12％的裂殖壶藻渣，配制五组等氮等脂的饲料，蛋白源为鱼粉、肉骨粉、豆粕(华秦农牧科技有限公司，杨凌示范区，陕西省，中国)等，脂质源为大豆油(益海嘉里粮油有限公司，深圳，广东省，中国)，裂殖壶藻渣由友康生物科技有限公司提供(友康生物科技有限公司，临沂市，山东省，中国)。饲料配方如表1：

表1.裂殖壶藻渣和饲料配方的营养成分(风干基础，g·kg

注：DS，裂殖壶藻渣

预混料1g：含硫酸铝钾0.159mg，碳酸钙18.101mg，氯化钴0.07mg，硫酸镁5.216mg，硫酸锰0.007mg，氯化钾16.553mg，碘化钾0.014mg，碳酸锌0.192mg，硒酸钠0.006mg，硫酸铜0.075mg，柠檬酸铁1.338mg；含硫胺素5mg，核黄素5mg，维生素A2500 IU,维生素E 40IU，维生素D32400 IU，甲萘醌4mg，盐酸吡哆醇4mg，氰钴胺0.01mg，生物素0.6mg，泛酸钙 10mg，叶酸1.5mg，烟酸20mg，肌醇200mg，余量为石灰石载体。

1.1.2饲料制作

S1：称小料：使用精度为0.001的电子天平准确称量充分粉碎的Ca(H

S2：搓油：在混合好的小料中先添加入豆粕，鼓气膨胀后将小料与其充分混匀后，倒入大塑料盆中，加入豆油，用手充分搓匀；

S3：称大料：依次加鱼粉、肉骨粉、棉粕、菜粕、面粉、米糠、裂殖壶藻渣、预混料入搓好油的大盆中，并依次充分混匀；

S4：加水：加10％～12％的纯净水进行制粒，用搅拌机多次少量加入直至混匀；

S5：制粒：清理制粒机，调整压轮和环模之间的缝隙为0.03～0.05mm，调整制粒机加料量约 100～200g/次，使其均匀出料；

S6：饲料风干：将制作好的饲料均匀摊晾在塑料纸上，每隔1h翻晾，阴雨天注意增加翻晾次数，直至饲料颗粒干燥，轻捏不碎为干燥标准，放置-20℃下长期保存。

1.1.3试验鱼及饲养管理

多鳞白甲鱼1龄幼鱼由镇坪县饮源生态资源保护开发有限公司提供(饮源生态资源保护开发有限公司，安康，陕西)。多鳞白甲鱼在水泥池(4.75m*1.65m*0.8m)中饲喂普通商品饲料 14天。分鱼前饥饿24h，挑选规格整齐体质健康的180尾幼鱼(体重9.00±0.20g)随机分至15 个循环水缸中(215L)，将15个水缸随机分为5组，每组3个重复，每个重复12尾鱼，分鱼结束停食24h后正式开始试验，每组随机饲喂5组试验饲料56天。试验期间每天饱食投喂3 次分别为8:30，12:30，16:30。试验用水采用曝气后的井水，并进行微流水养殖，每周清理一次池底。光照周期为12h灯光，12h黑暗。每日监测水质，并记录试验鱼死亡数量等。养殖过程中监测水温为25.5±1.5℃，pH 7.4±0.30，溶氧7.90±0.50mg L-1，氨氮0.05±0.01mg L-1，亚硝酸盐＜0.01mg/L，硫化物＜0.05mg/L。

1.1.4样品采集

样品采集尊重动物福利与道德规范，严格按照西北农林科技大学动物管理委员会的要求执行。使用MS-222(50mg·L

2.样品分析

2.1生物学性状计算：

根据上述解剖的组织和记录的数据，计算出特定生长率(SGR)、成活率(SR)、饲料系数 (FCR)、肾指数(KI)、肝胰脏指数(HSI)、脾指数(SI)、腹腔脂肪指数(IPFI)以及肠长比(RIL)根据以下公式计算得出：

特定生长率(Specific growth rate,SGR,％/d)＝[ln(鱼末均重)-ln(鱼初均重)]/试验天数×100％；

增重率(weight gain,WG,％)＝(末重-初重)/初重×100％；

成活率(Survival ratio,SR,％)＝试验结束鱼数量/试验初鱼数量×100％；

饲料转化率(Feed conversion ratio,FCR,g/g)＝投饲总量/体增重；

肥满度(Condition factor,CF,％)＝体重/体长3×100％；

肾指数(Kidney index,KI,％)＝肾脏重/鱼体重×100％；

肝胰脏指数(Hepatosomatic index,HSI,％)＝肝胰脏重/鱼体重×100％；

脾指数(Spleen index,SI,％)＝脾脏重/鱼体重×100％；

腹腔脂肪指数(Intraperitoneal fat body index,IPFI,％)＝腹腔脂肪重/鱼体重×100％；

肠体比(Relative intestine length,RIL,％)＝肠长/体长×100％；

2.2常规成分分析

饲料、组织和全鱼的常规成分根据(AOAC 1995)方法测定。其中，水分用105℃恒温干燥法测定，粗蛋白(N*6.25)使用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量用索氏抽提法，粗灰分含量使用马弗炉550℃灰化12h测定，粗纤维用酸碱消煮法测定。

2.3脂肪酸组成及脂肪酸健康指数分析

饲料以及鱼体(肌肉、肝胰脏和腹腔脂肪组织)脂肪酸的测定及肌肉脂肪酸健康指数的计算方法如下：称取0.3-0.5g样品于10ml离心管中，加入甲醇：氯仿(1:2)5ml，高速分散器(XHF-D，

动脉粥样硬化指数Atherogenicity index(AI)＝[C12:0+(4×C14:0)+C16:0]/(n-3PUFA+ n-6PUFA+MUFA)；

血栓形成指数Thrombogenicity index(TI)＝(C14:0+C16:0+C18:0)/[(0.5×MUFA)+(0.5× n-6PUFA)+(3×n-3PUFA)+(n-3PUFA/n-6PUFA)]

胆固醇血症指数hypocholesterolemic/Hypercholesterolemic FAratio(h/H)＝(C18:1n-9+C18: 2n-6+C20:4n-6+C18:3n-3+C20:5n-3+C22:5n-3+C22:6n-3)/(C14:0+C16:0)

血脂质量flesh lipid quality(FLQ)＝(C20:5n-3+C22:6n-3)/∑total FA

2.4组织学观察

肠道、肝脏、腹腔脂肪石蜡切片的制备及分析过程详细步骤如下：

将固定好的样品在自来水中洗涤12小时，然后在分级系列的乙醇(30、50、70、80、90、95和100％)中进行两次常规脱水。然后将样品在二甲苯中浸润并包埋在石蜡中。使用切片机(RM2235，Leica，德国)将切片切成5μm，安装在载玻片上，用苏木精和伊红(H&E) 染色。石蜡切片由西安依科生物科技有限公司制作。观察组织学样品并用正置显微镜(Leicabiosystems，Germany)拍照，使用Photoshop(Adobe，San Jose，USA)对不同的组织切片分别计算图像中的平均肠道绒毛高度，肝脏细胞数量，脂肪细胞面积大小，计算出每个组五个不重叠的图像的平均值并进行数据分析。

2.5甘油三酯含量和抗氧化指标测定

肝胰脏组织的甘油三酯含量，血清、肝脏组织抗氧化指标采用试剂盒检测(南京建成生物工程研究所，南京市，江苏省，中国)。

2.6数据分析

本试验数据均采用平均数±标准差(Mean±SD)表示，并通过Levene检验检验方差的均一性。所有数据均通过单因素方差分析和Duncan多重比较检验组间的差异，平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)。以不同添加水平的裂殖壶藻渣作为因变量(0、3、6、 9、12)，使用线性回归模型对所检测指标进行评估(P<0.05)。数据处理使用SPSS19.0软件(Chicago,IL,USA)进行处理。

2.7应用效果

2.7.1裂殖壶藻油渣对多鳞白甲鱼的生长性能及生物学性状的影响

多鳞白甲鱼的生长性能及生物学性状如表2所示，9％和12％组CF显著低于对照组(P>0.05)；6％，9％，12％组的HSI和IPF显著低于对照组(P>0.05)。其余指标各组之间无显著差异(P>0.05)。

表2裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼生长性能及生物学性状的影响(n＝3)

应用线性回归(R

2.7.2裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼常规成分的影响

如表3，肌肉中的水分，粗蛋白，灰分和全鱼中的水分，粗蛋白，粗脂肪，灰分各组之间无显著差异(P＞0.05)。随着藻渣的添加，肌肉中的脂肪含量呈现显著下降趋势(p＜0.05)， 3％，6％，9％，12％藻渣添加组肌肉中粗脂肪均显著低于对照组(P＜0.05)。

表3裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼常规成分的影响(％)(n＝3)

Table 3.Effect of DS on proximate composition in liver，muscle andwhole body of juvenile Onychostoma macrolepis(％)(n＝3)

应用线性回归(R

2.7.3裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼组织中甘油三酯含量的影响

如表4，多鳞白甲鱼肝脏和腹腔脂肪的甘油三脂含量，9％和12％添加组显著低于对照组(p＜ 0.05)，肌肉中甘油三酯各组之间无显著差异(p＞0.05)

表4.多鳞白甲鱼各组织中甘油三酯的含量(mmol/L)(n＝3)

Table 4.The content of triglycerides in tissues of juvenileOnychostoma macrolepis(mmol/L)(n＝3)

应用线性回归(R

2.7.4裂殖壶藻油替代鱼油对草鱼肌肉脂肪酸组成及其健康指数的影响

2.7.4.1裂殖壶藻油替代鱼油对草鱼肌肉脂肪酸组成的影响

如表5，随着藻渣的添加，肌肉中∑n-6PUFA显著下降，6％，9％，12％组中DHA，∑n-3PUFA，n-3/n-6PUFA含量显著高于对照组，说明适量的藻渣添加可显著提高肌肉中n-3LCPUFA的蓄积，尤其是DHA的含量，但增加至12％，DHA的含量不再升高，说明多鳞白甲鱼肌肉蓄积DHA的能力是有限的。

表5.裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼肌肉脂肪酸组成的影响(％)(n＝3) Table 5.Effect of DS on fatty acid composition in muscle of juvenile Onychostoma macrolepis(％)(n＝3)

SFA，饱和脂肪酸，saturated fatty acids；MUFA，，单不饱和脂肪酸，monounsaturated fatty acid；PUFA，多不饱和脂肪酸，polyunsaturated fatty acid；DS，defatted Schizochytrium sp.

应用线性回归(R

2.7.4.2多鳞白甲鱼的肌肉及饲料中脂肪酸的主成分分析

日粮一些特定脂肪酸的含量与其在鱼肉中的含量之间存在相关性，在PCA图1中可得，图(B)第二象限中的腹腔脂肪所对应图(A)中的C16，C14，C20，C24饱和脂肪酸，其主要为机体提供能量。肝脏的脂肪酸主要以单不饱和脂肪酸为主。如图(A)，n-3LC-PUFA，例如 DHA和EPA主要集中在第四象限，该区域与图(B)中的鱼肉组织相对应，说明多鳞白甲鱼鱼肉中富含大量的n-3PUFA。此种现象可能物种和组织特异性有关。

2.7.4.3.裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼肌肉中脂肪酸健康指数的影响

如表6，6％，9％，12％组肌肉的动脉粥样硬化指数AI和3％，6％，9％，12％组的血栓形成指数都显著低于对照组(P＜0.05)；9％和12％组的胆固醇血脂指数h/H和3％，6％，9％， 12％组血脂质量指数(FLQ)都显著高于对照组(P＜0.05)。

表6.裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼肌肉中脂肪酸健康指数的影响 Table 6.Effect of DS on health index of fatty acid in muscle of juvenile Onychostoma macrolepis(％)

2.7.5裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼组织结构的影响

2.7.5.1裂殖壶藻渣对肝脏细胞组织结构的影响

如图2所示，0％组肝脏中的空泡面积最多，随着藻渣的添加，肝脏中的空泡数呈逐渐递减的现象，根据单位面积(375000μm

2.7.5.2裂殖壶藻渣对肠道组织结构的影响

如图3所示，0％组肠道绒毛呈现部分破损，不完整，绒毛高度低，杯状细胞数量少的现象，添加了添加了藻渣的各个试验组，肠道绒毛高度显著高于对照组(P<0.05)，且绒毛形态清晰完整，杯状细胞的数量增多，裂殖壶藻渣可显著改善多鳞白甲鱼肠道组织结构。

2.7.5.3裂殖壶藻渣对腹腔脂肪细胞组织结构的影响

如图4所示，根据单位面积每个细胞的平均面积大小比较可知，随着藻渣的添加，各处理组的细胞面积都显著小于对照组(P<0.05)，这与之前的IFI，腹腔脂肪的甘油三脂含量的结果呈正相关。

2.7.6裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼组织中抗氧化指标的影响

2.7.6.1裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼肝脏中抗氧化指标的影响

如图5所示，随着藻渣的添加，处理组肝脏中的SOD活性显著低于对照组，3％，6％，9％，的MDA显著低于对照组和12％处理组(P<0.05)，这有可能是添加了藻渣的肝脏抵抗外界的氧化能力增强，机体自身不需要过高的抗氧化性，而12％过量添加藻渣，有可能造成肝脏的抗氧化应激，且体内过多不饱和脂肪酸遭到氧自由基的攻击，生成大量脂质过氧化物，MDA含量升高。

2.7.6.2裂殖壶藻渣对多鳞白甲鱼血清中抗氧化指标的影响

如图6，随着藻渣的添加，处理组血清中的SOD活性显著高于对照组(P<0.05)，MDA显著低于对照组(P<0.05)，说明藻渣有提高多鳞白甲鱼血清抗氧化能力的作用。

3.结论

结合以上结果分析，通过添加6％～9％的裂殖壶藻渣所配置的功能性饲料，可显著降低多鳞白甲鱼体脂蓄积，减少腹腔脂肪和肝脏等不可食用的内脏比例，增加多鳞白甲鱼肌肉中 DHA的沉积，增高肠道绒毛长度，提高肝脏和血清的抗氧化能力。

裂殖壶藻渣如图7所示：粉碎后的裂殖壶藻渣呈黑褐色，有黏性的粉末，遇水或长期暴露于空气中易结块。