三聚体化新冠病毒受体结合域、其制备方法与应用

摘要

本发明涉及生物医学领域，特别涉及三聚体化新冠病毒受体结合域、其制备方法与应用。本发明构建了并表达了三聚体化新冠病毒RBD。本发明将目的片段连接至pFastBac1载体，转化到DH10Bac感受态细胞后获得重组杆粒。将重组杆粒转染至sf9细胞后进行病毒拯救，获得重组杆状病毒，将重组杆状病毒接种悬浮sf9细胞96小时后收获培养基进行纯化。PCR及WesternBlot结果显示，重组杆状病毒构建成功，并可以成功表达外源蛋白RBD‑6HB。对纯化后的蛋白进行SDS‑PAGE及WesternBlot鉴定，结果显示，纯化效果良好，为后期的疫苗及基础研究奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及三聚体化新冠病毒受体结合域、其制备方法与应用。

背景技术

当前，新型冠状病毒在全球范围内仍呈现蔓延之势。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科β冠状病毒属，共分为四个结构蛋白(S、M、E、N)，其中S蛋白与病毒吸附入侵以及诱导特异性抗体、中和抗体的产生有关。S蛋白分为S1和S2两部分，S1与受体结合有关，S2与膜融合相关，与受体结合的部位受体结合域(ReceptorBinding Domain，RBD)位于S1的C端，天然状态下，S1蛋白呈现三聚体结构。

因此，模拟新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)的天然结构，对后期获得疫苗及基础研究具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了三聚体化新冠病毒受体结合域、其制备方法与应用。PCR及WesternBlot结果显示，重组杆状病毒构建成功，并可以成功表达外源蛋白RBD-6HB。对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定，结果显示，纯化效果良好，为后期的疫苗及基础研究奠定了基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了三聚体化新冠病毒受体结合域，在新型冠状病毒受体结合域的C端添加人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)gp41蛋白，获得目的片段，连接至载体，转化感受态细胞获得重组杆粒，转染至细胞收获重组杆状病毒，再接种细胞后培养，收集培养基、纯化获得所述三聚体化新冠病毒受体结合域。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为pFastBac1载体；所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞；所述细胞为sf9细胞。

本发明还提供了所述的三聚体化新冠病毒受体结合域的制备方法，在新型冠状病毒受体结合域的C端添加人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)gp41蛋白，获得目的片段，连接至载体，转化细胞获得重组杆粒，转染至细胞收获重组杆状病毒，再接种细胞后培养，收集培养基、纯化获得所述三聚体化新冠病毒受体结合域。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为pFastBac1载体；所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞；所述细胞为sf9细胞。

具体的，在新型冠状病毒受体结合域RBD的C端添加一段人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)gp41蛋白，使RBD形成三聚体结构，以模拟其天然结构。杆状病毒表达系统属于真核表达系统，具有安全、高效的优点，其表达的蛋白更加接近天然结构。本发明将目的片段连接至pFastBac1载体，经转化至DH10Bac感受态细胞获得重组杆粒，转染至sf9细胞后收获重组杆状病毒，再将重组杆状病毒接种sf9细胞后96h收获培养基，纯化，获得目的蛋白，即为三聚体化新冠病毒受体结合域。

本发明还提供了所述的三聚体化新型冠状病毒受体结合域或所述制备方法制得的三聚体化新型冠状病毒受体结合域在制备疫苗或新型冠状病毒研究中的应用。

此外，本发明还提供了重组杆状病毒，转化有目的片段，能够表达所述的三聚体化新型冠状病毒受体结合域或所述制备方法制得的三聚体化新型冠状病毒受体结合域；所述目的片段为在新型冠状病毒受体结合域的C端添加人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)gp41蛋白。

本发明还提供了所述的重组杆状病毒在制备治疗病症或疾病的药物中的用途；所述病症或疾病包括新型冠状病毒所致的病症或疾病。

具有重要意义的是，本发明还提供了以所述的重组杆状病毒制得的疫苗。

在本发明的一些具体实施方案中，所述疫苗还包括药学上可接受的保护剂、稳定剂、佐剂、稀释剂、载体或辅料。

本发明还提供了所述的疫苗在制备治疗病症或疾病的药物中的用途；所述病症或疾病包括新型冠状病毒所致的病症或疾病。

本发明通过在RBD的C端添加一段人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus，HIV)跨膜蛋白gp41的6HB序列，能使RBD形成三聚体结构，以模拟其天然结构。杆状病毒表达系统属于真核表达系统，具有安全、高效的优点，其表达的蛋白更加接近天然结构。本发明将目的片段连接至pFastBac1载体，经转化至DH10Bac感受态细胞获得重组杆粒，转染至sf9细胞后收获重组杆状病毒，再将重组杆状病毒接种sf9细胞后96h收获培养基，纯化，获得目的蛋白，为接下来的疫苗及基础研究奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示rB-SARS-CoV2-RBD-6HB示意图；

图2示重组杆粒RT-PCR鉴定；其中，M：DL5000；1-2:rB-RBD-6HB；3：水；4：pFastBac1；

图3示重组杆状病毒感染sf9细胞病变观察(200×)；A：正常sf9细胞；B：sf9细胞感染rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB后48h；sf9细胞感染rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB后72h；

图4示重组杆状病毒RT-PCR鉴定；其中，M：DL2000；1：rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB；2：pFastBac1；3：MOCK(DH10Bac)；4：水；

图5示Western Blot鉴定重组杆状病毒外源基因表达；其中，M：蛋白MARKER；2：蛋白RBD-6HB；3：MOCK；

图6示目的蛋白的纯化；其中，M：MARKER；1：原液；2-5：洗脱液1-4。

具体实施方式

本发明公开了三聚体化新冠病毒受体结合域、其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的三聚体化新冠病毒受体结合域、其制备方法与应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

质粒、细胞、菌株

SARS-CoV-2RBD基因序列(如SEQ ID No.1所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，6HB(如SEQ ID No.2所示)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，pFastBac1载体购自Invitrogen公司；sf9细胞由本实验室保存；DH10Bac

SARS-CoV-2RBD基因序列：

AGAGTGCAGCCTACCGAGAGCATCGTGCGTTTCCCTAACATCACCAACCTCTGCCCTTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCCGTTTCGCATCCGTCTACGCCTGGAACCGTAAGCGTATCAGCAACTGCGTGGCTGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCATCGTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGCGTCAGCCCTACCAAGCTGAACGACTTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTCATCCGCGGTGACGAGGTCAGGCAGATCGCCCCCGGTCAGACCGGAAAGATCGCTGACTACAACTACAAGTTGCCCGACGACTTCACCGGATGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTCGGCGGAAACTACAACTACTTGTACCGTTTGTTCCGTAAGAGCAACTTGAAGCCATTCGAGCGCGACATCAGCACCGAGATATACCAGGCCGGTAGCACCCCATGCAACGGTGTGGAGGGTTTCAACTGCTACTTCCCATTGCAGTCCTACGGATTCCAGCCTACCAACGGAGTGGGTTACCAGCCATACAGGGTCGTGGTGCTGTCCTTCGAGTTGTTGCACGCCCCTGCTACCGTCTGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTC

6HB序列：

GGCGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGTGGTAGCTCCGGCATCGTGCAGCAGCAGAACAACCTGCTGCGTGCCATCGAAGCTCAGCAGCACCTGCTGCAGCTGACTGTGTGGGGTATCAAGCAGCTGCAGGCTCGTATCCTGGCTGGTGGTAGCTCCCTGCTGACCGAAGTGGAGACCCCTATCCGTAACGAGTGGGGCTGTCGCTGTAACGGTAGCAGCGATTCCGGAGGCCACACCACCTGGATGAACTGGACCCGTGAAATCAACAACTACACCTCCCTGATCCACAACCTGACCGAGGAATCCCAGAACCAGACTGAAAAGAACGAAAACGAAACTCTGGAA

主要试剂

sf-900

实施例1 pFB-SARS-CoV-RBD-6HB重组穿梭质粒的构建

将SARS-CoV-2RBD及6HB通过同源重组的方式连接至pFastBac1载体，命名为pFB-SARS-CoV2-RBD-6HB，经吉林省库美生物科技有限公司测序，结果显示目的片段序列正确。

实施例2重组杆粒制备及鉴定

将pFB-SARS-CoV2-RBD-6HB质粒转化到DH10Bac感受态细胞中，并涂布于含10μg/ml四环素、50μg/ml硫酸卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、100μg/mlX-gal和40μg/mlIPTG的筛选版上，37℃恒温培养48h。挑取白色菌落至SOC培养基，37℃震荡培养3h，使用通用引物pUC/M13F：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG(如SEQ ID No.3所示)和pUC/M13R：AGCGGATAACAATTTCACACAGG(如SEQ ID No.4所示)进行菌液PCR鉴定，菌株鉴定正确后进行杆粒提取，命名为rB-SARS-CoV2-RBD-6HB。

此外，将pFastBac1空载体按上述方法转化、筛选、培养后用作空载体重组杆粒对照。

用pUC/M13F和pUC/M13R引物对rB-SARS-CoV2-RBD-6HB及空载体重组杆粒(图1)进行RT-PCR鉴定。结果如图2所示，rB-SARS-CoV2-RBD-6HB可扩增出长度约为3518bp的片段，空片段可扩增出长度约为2300bp的片段，与预期相符。

实施例3重组杆状病毒的拯救

接种sf9细胞到六孔板，细胞密度为2×10

如图3所示：接种rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB到sf9细胞后，分别于48h和72h镜下观察，可见感染重组杆状病毒后，sf9细胞大量脱落，贴壁细胞稀疏、胀大。

实施例4 RT-PCR鉴定重组杆状病毒

将rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB接种于sf9细胞，培养72小时后收集细胞，加入一定体积Trizol，室温放置10分钟后提取总RNA。经反转录后，用引物RBD-6HB-F(如SEQ ID No.5所示)：

CCCACCATCGGGCGCGGATCCAACTTAAAAAAAAAAATCAAAATGAAGTT和RBD-6HB-R(如SEQID No.6所示)：

CTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTATTCCAGAGTTTCGTTTTCGTTC进行PCR鉴定。

如图4所示：收获感染rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB 72小时后的sf9细胞，经总RNA提取、反转录、PCR鉴定后，结果如图4所示，可见长度为1260bp的目的条带，与预期相符。

实施例5 Western Blot鉴定重组杆状病毒表达外源蛋白

将rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB接种于sf9细胞，培养72小时后收集细胞，加入IP裂解液后超声破碎，12000rpm，4℃离心3分钟收集上清。向上清中加入5×SDS后，沸水浴10分钟后进行SDS-PAGE电泳。用半干转方法转印后，以5％脱脂乳室温封闭2小时，经抗RBD小鼠多抗孵育、TBST清洗后，用山羊抗鼠二抗孵育、TBST清洗，最后将ECL滴加到NC膜上进行曝光。

收获感染rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB 72小时后的sf9细胞，超声破碎处理后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转印到NC膜，经5％脱脂乳封闭、一抗孵育、山羊抗鼠二抗孵育后显色，如图5所示，可见大小约为41kDa的条带，与预期相符。

实施例6目的蛋白纯化

将rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB接种于悬浮细胞，培养96小时后收取细胞及培养基，3000rpm，4℃离心5min收集上清。使用IBA公司出品的

收获感染rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB 96小时后的sf9悬浮细胞的培养基，经柱平衡、蛋白吸附、洗涤后进行洗脱。首先以0.6倍柱体积的洗脱液进行洗脱，即为洗脱液，待洗脱液1全部流尽后，再以上述方法分三次加入0.8倍柱体积的洗脱液，分别回收，命名为洗脱液2、3、4。将洗脱液分别命名为洗脱液1-4。结果如图6所示，除洗脱液1外，洗脱液2-4均有很好的纯化效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

<120> 三聚体化新冠病毒受体结合域、其制备方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtgcagc ctaccgagag catcgtgcgt ttccctaaca tcaccaacct ctgccctttc 60

ggcgaggtgt tcaacgccac ccgtttcgca tccgtctacg cctggaaccg taagcgtatc 120

agcaactgcg tggctgacta ctccgtgctg tacaactccg catcgttctc caccttcaag 180

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agcttcgtca tccgcggtga cgaggtcagg cagatcgccc ccggtcagac cggaaagatc 300

gctgactaca actacaagtt gcccgacgac ttcaccggat gcgtgatcgc ctggaacagc 360

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agcaacttga agccattcga gcgcgacatc agcaccgaga tataccaggc cggtagcacc 480

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cacgcccctg ctaccgtctg cggtcctaag aagtccacca acctcgtgaa gaacaagtgc 660

gtgaacttc 669

<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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ctgcgtgcca tcgaagctca gcagcacctg ctgcagctga ctgtgtgggg tatcaagcag 120

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tcccagaacc agactgaaaa gaacgaaaac gaaactctgg aa 342

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cccagtcacg acgttgtaaa acg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcggataac aatttcacac agg 23

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<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccaccatcg ggcgcggatc caacttaaaa aaaaaaatca aaatgaagtt 50

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctagtacttc tcgacaagct tttattccag agtttcgttt tcgttc 46