一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法

摘要

本发明公开了一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法，采用离体的溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者癌旁组织，进行转录组测序分析，筛选那些没有被国内外文献报道与溃疡性结肠炎相关的基因。再次采用溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者癌旁组织，运用实时荧光定量RT‑PCR进行验证；运用免疫印迹方法验证转录组测序所筛选基因编码的蛋白表达水平，最终筛选出表达一致的基因。最后进行临床验证，筛选出溃疡性结肠炎活动度的指标。本发明克服了传统方法通过查找文献、筛选基因，再逐步验证的缺点，本方法亦适用于克罗恩病、嗜酸粒细胞胃肠炎等疾病活动度指标的筛选，以及结肠部位息肉、肿瘤等疾病分期指标的筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及结肠组织的转录组测序领域，具体涉及一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法。

背景技术

溃疡性结肠炎是一种病因不明的大肠黏膜慢性炎症和溃疡性病变，好发于20～40岁的青年，临床表现为慢性腹泻伴粘液脓血便，严重影响患者的生活质量和劳动能力。重症溃疡性结肠炎患者可并发中毒性巨结肠、肠穿孔及肠大出血，危及患者的生命。在我国溃疡性结肠炎的发病率有逐年增高的趋势，其发病机制尚未完全阐明，目前认为可能是环境、遗传及免疫等因素共同作用所致。结肠上皮细胞屏障功能损伤可能是溃疡性结肠炎发生发展的重要环节，它使肠黏膜通透性增加，细菌、毒素以及大分子物质容易穿过黏膜进入黏膜下层，导致局部免疫紊乱，加重其病理损伤。造成肠黏膜屏障功能损伤的因素有很多，包括炎症因子、整合素家族、钙通道调控蛋白、肠道细菌，以及丁酸盐、锌等。这些因素与溃疡性结肠炎疾病活动度是否有关联，能否作为临床评价疾病活动度的指标，抑或作为临床鉴别诊断的依据，缺乏进一步的证据。

转录组测序差异分析及功能富集分析，可以全面、系统的分析疾病进展过程中的差异表达基因，及其与相关信号通路的关系。通过对病理标本和正常对照的转录组测序差异分析及功能富集分析，并进行数据库的比对，可能发现一些文献没有报道、但与疾病密切相关的差异表达基因及其信号转导通路，对临床疾病发病机制的探讨、疾病严重程度的评估有重要的临床意义。

发明内容

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

本发明的目的在于提供一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法，该方法实验过程简单，实验结果准确有效。

实现上述发明目的的技术方案是：

一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法，具体步骤如下：

1)收取离体的溃疡性结肠炎患者结肠活检标本，以及结肠癌手术患者癌旁组织，放入RNA样本保存液中浸透5分钟，然后放入液氮中保存；

2)采用离体的溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者切除的癌旁组织，每组6例，提取组织mRNA进行反转录，进行转录组测序分析。分别根据FC值升位和降位排序，各筛选出各组的前20位基因；再进一步筛选出那些没有被国内外文献报道与溃疡性结肠炎相关的新发基因；

3)采用离体的溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者切除的癌旁组织，每组各20例，提取结肠组织mRNA进行反转录，运用实时荧光定量RT-PCR验证转录组测序所筛选基因的转录差异；提取结肠组织蛋白，运用免疫印迹方法验证转录组测序所筛选基因编码的蛋白表达水平，最终筛选出表达一致的基因；

4)将筛选出表达一致的基因，进行临床验证。收取离体的溃疡性结肠炎患者结肠活检标本50例，免疫印迹方法检测上述基因所编码的蛋白水平，并与患者的疾病活动度进行相关分析，最终筛选出溃疡性结肠炎活动度的指标。

进一步地，步骤二筛选出的那些没有被国内外文献报道与溃疡性结肠炎相关的基因：ASS1、CAPRIN1。

本发明提供了使用上述方法筛选出的溃疡性结肠炎活动度的指标，精氨基琥珀酸合酶1(Argininosuccinate Synthase 1，ASS1)。

本发明的有益效果：

根据本发明方法筛选出的判断溃疡性结肠炎活动度的指标：精氨基琥珀酸合酶1(Argininosuccinate Synthase 1，ASS1)，与溃疡性结肠炎活动度Mayo评分有很强的正线性相关，表明ASS1可作为判断溃疡性结肠炎活动度的指标。

本发明克服了传统方法通过查找文献、筛选基因，再逐步验证的缺点(速度慢、新颖性不够)。本方法亦适用于克罗恩病、嗜酸粒细胞胃肠炎等疾病活动度指标的筛选，以及结肠部位息肉、肿瘤等疾病分期指标的筛选。

附图说明

图1为转录组测序基因表达降位图(前20位)；

图2为ASS1蛋白免疫印迹图；

图3为CAPRIN1蛋白免疫印迹图。

其中，PC为paracancerous tissues的简写，即癌旁组织；UC为ulcerativecolitis的简写，即溃疡性结肠炎。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

1)实验材料准备

RNA/蛋白样品保存液(碧云天生物科技有限公司)，冻存管(康宁)，RNA提取试剂盒(TRizol)，反转录试剂盒(Qiagen)，实时定量PCR试剂盒(Qiagen)。总蛋白提取试剂盒(赛默飞)，蛋白一抗(赛默飞)，二抗(上海康成生物)。

2)溃疡性结肠炎患者样本留存方法

溃疡性结肠炎患者肠镜检查时，活检钳夹取病变处3块组织，置于冻存管中(含RNA/蛋白样品保存液)，15分钟内放入液氮罐中速冻，一周内放入-80℃冰箱中保存，用于转录组测序，实时定量RT-PCR验证，以及蛋白印迹检测。

3)结肠癌患者癌旁组织样本留存方法

结肠癌手术切除的组织，于离体15分钟以内，用手术剪获取少量癌旁组织(约100mg左右)，置于冻存管中(含RNA/蛋白样品保存液)，15分钟内放入液氮罐中速冻，一周内放入-80℃冰箱中保存，用于转录组测序，实时定量RT-PCR验证，以及蛋白印迹检测。

4)组织RNA提取、反转录，转录组测序分析

RNA提取试剂盒(TRizol)提取结肠组织RNA，然后使用反转录试剂盒(Qiagen)进行反转录，使用illumina NovaSeq 6000测序仪进行转录组测序，分别根据FC值升位和降位排序，各筛选出各组的前20位基因；再进一步筛选出那些没有被国内外文献报道与溃疡性结肠炎相关的新发基因ASS1、CAPRIN1(见附图1)。

5)组织RNA提取，实时荧光定量RT-PCR验证

采用溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者癌旁组织，每组各20例，提取结肠组织mRNA进行反转录，运用实时荧光定量RT-PCR检测两组样本ASS1、CAPRIN1基因的转录差异，结果发现两组样本ASS1、CAPRIN1的mRNA表达差异明显(见表1)。

表1.溃疡性结肠炎活检样本和结肠癌手术癌旁组织基因表达差异(χ±s)

6)组织总蛋白提取，免疫印迹法验证

采用溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者癌旁组织，每组各20-25例，提取结肠组织总蛋白，进行电泳及转膜，孵加蛋白一抗(赛默飞)，二抗(上海康成生物)。观察两组样本ASS1、CAPRIN1蛋白水平的差异，结果发现两组ASS1蛋白表达差异明显，而两组CAPRIN1蛋白表达无明显差异(见表2，图2，图3)。

表2.溃疡性结肠炎活检样本和结肠癌手术癌旁组织蛋白表达差异(χ±s)

7)筛选表达一致基因，进行临床验证

收取溃疡性结肠炎患者结肠活检标本50例，免疫印迹方法检测ASS1蛋白水平，并与患者的疾病活动度进行相关分析。溃疡性结肠炎活动度Mayo评分包括(a)大便频次：0＝正常，1＝每天大便比正常多1-2次；2＝每天大便比正常多3-4次；(b)直肠出血：0＝无，1＝少于一半的时间可见粪便带有血液，2＝有一半或更多时间可见大便带有血液，3＝持续大便带血或为血便；(c)内窥镜检查粘膜外观：0＝正常或疾病不活动，1＝轻度疾病(红斑，血管形态减少，轻度易碎)，2＝中度疾病(明显红斑，无血管形态，易碎，侵蚀)，3＝严重疾病(自发出血，溃疡)；(d)疾病活动的医师评分：0＝正常，1＝轻度，2＝中度。总分之和<2分症状缓解；3～5分轻度活动；6～10分中度活动；11～12分重度活动。

表3.溃疡性结肠炎活动度评分与组织ASS1蛋白表达相关性分析(χ±s)

表注：ASS1蛋白表达为相对量(％对照组)，以6例结肠癌旁组织混合后作为对照，观察50例溃疡性结肠炎患者结肠组织中ASS1的相对表达量与Mayo评分的关系。#Person相关系数为0.965，P＝0.000；在0.01水平，ASS1蛋白表达量与溃疡性结肠炎活动度评分呈强正线性相关。

本发明方法所筛选的溃疡性结肠炎活动度的指标ASS1，与溃疡性结肠炎活动度Mayo评分有很强的相关性(见表3)，表明ASS1可作为判断溃疡性结肠炎活动度的指标。

本发明克服了传统方法通过查找文献、筛选基因，再逐步验证的缺点(速度慢、新颖性不够)。本方法亦适用于克罗恩病、嗜酸粒细胞胃肠炎等疾病活动度指标的筛选，以及结肠部位息肉、肿瘤、炎症等疾病分期指标的筛选。此项发明技术对于判断溃疡性结肠炎活动度，指导临床用药及随访方面，将会起到明显的作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。