基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明涉及体外检测技术领域，特别涉及一种基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒。其包括盒体，及盖体，在盒体内设有用于检测阿尔茨海默病的检测卡，酶，底物，缓冲液，检测卡包括卡体，在卡体上分别设置有对照区，以及用于检测该疾病的检测区，检测区上设置有用于检测人体口腔咽喉部分泌物的膜体，膜体上具有与阿尔茨海默抗原相结合的特异性抗体。还包括一种阿尔茨海默早期检测试剂盒的制备方法，本发明通过采用Western Blot法来制备阿尔茨海默早期检测试剂盒，能够快速得到检测结果，实现了真正意义上阿尔茨海默的早期检测，准确率高，使用更便捷，在使用时无需各种检测仪器，更易于推广，无创伤，安全，值得被广泛推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，特别涉及一种基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最为常见的痴呆病症。这种病症是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，主要特征就是影响到记忆、思维与交流的大脑功能丧失，病因迄今未明。阿尔茨海默病通常影响超过65周岁的老年人，与神经细胞间β淀粉样蛋白的累积以及神经细胞中磷酸化的tau蛋白有关。这些蛋白质的聚集是会破坏神经细胞的功能。由于阿尔兹海默是一种发病进展缓慢，随着时间不断恶化且不可逆的中枢神经系统退行性疾病，患者通常会从早期的近期记忆减退发展到丧失身体机能，最终导致死亡。当人们被诊断出患有该病时，通常还能活5-10年，然而新的研究显示这种病的存活率正在不断下降，目前，患上该病之后大约还能存活3.3年。AD不但直接威胁生命，还造成生活质量严重下降，连带的劳动力丧失和护理成本更是不可计量。

随着世界人口的老龄化，AD的发病率也在逐年上升，已成为继心脑血管疾病和肿瘤后第三大危及人类生命健康的疾病。我国有部分城市的流行病学调查显示，在55岁及以上的人群中，AD患病率为2.1％，由此带来的社会、经济、家庭和社会公共卫生问题也日益突出。目前，主要依靠出现痴呆症状及评估精神量表等来明确诊断。临床诊断的AD患者基本都处于中晚期，现有的治疗均难以取得满意的疗效。因此，近年来AD的研究方向逐渐转向了临床前期AD，科研人员希望通过在出现AD症状前找到能提示AD的生物标志物，从而开发早期预防和减缓AD的药物干预措施。

目前，采用免疫结合反应的原理来检测阿尔茨海默病的方法有酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA)、PCR法、免疫组化法等。其中，应用较多的为ELISA法，其是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。上述方法主要是针对已有发病症状的被检测者进行检测，而不能针对未发病的被检测者进行检测。因为，上述方法均采用检测抗体的方式进行检测被检测者是否患有阿尔茨海默病。众所周知，当体内产生特异性抗体时，说明抗原已经在体内存在至少一个月的时间了，也就是说，该被检测者已经患有阿尔茨海默病，那么就表现出症状，所以说上述方法是针对已有发病症状的被检测者进行检测的。那么，也就是不属于早期诊断，而属于中晚期诊断，与早期诊断相比会耽误最佳干预时机。目前还没有研究然人员将Western Blot法应用于阿尔兹海默病的检测中。

如公开号为CN 107238711 A，名称为一种检测阿尔茨海默病外周血蛋白标志物的诊断试剂盒及其检测方法，该专利申请的方法及试剂盒具有高灵敏度、高通量性等优点，能够对多种阿尔茨海默病相关蛋白标志物同时进行定性和定量检测，检测方法更准确、方便快捷。如专利CN 112162101 A，其公开了一种检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其包括辣根过氧化物酶标记的生物标志物抗体溶液、抗生物标志物抗体包被的酶标板、浓缩洗液、发光底物液、校准品和质控品，并公开抗生物标志物抗体包被的酶标板的制备方法。虽然该专利在化学发光免疫分析基础上，引入具有抗生物标志物抗体包被的酶标板，改进抗生物标志物抗体包被工艺，提高反应的灵敏度，简化了试剂生产流程，缩短了生产时间，为市场提供质优价廉、稳定可靠、重复性好、批间差小、准确度高的检测试剂盒。但是上述专利中在进行检测时需要借助分析仪，检测过程较为复杂，对操作人员要求较高，环境要求也高，且仪器昂贵，检测时间较长，由于仪器不便于携带，且操作复杂，不利于推广应用。

再如专利CN 111175277 A，公开了一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法，其公开了检测试剂，其包括第一检测试剂和第二检测试剂中的至少一种；所述第一检测试剂包括同时负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒；所述第二检测试剂包括负载有第二抗体的SERS基底，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯；其中，所述第一抗体和所述第二抗体均能够特异性结合所述阿尔兹海默病的生物标记物。虽然采用该专利提供的检测试剂、试剂盒或方法检测阿尔兹海默病的生物标记物，能够简便、准确、高效地对生物标志物定量检测，能够满足对灵敏性和特异性等方面的要求。其采用了免疫学三大工具之一免疫组化，对组织(细胞)内抗原进行定性、定位的研究，但是达不到早期诊断的目的，因其采用抗原-抗体-二抗酶的模式进行检测，众所周知，当体内产生特异性抗体时，说明抗原已经在体内存在至少一个月的时间了，所以其不属于早期诊断，而属于中晚期诊断，与早期诊断相比会耽误最佳干预时机。二是，由于检测时需要操作相关仪器，不仅推广上有难度，且检测过程较为复杂，检测时间较长，一般得到检测结果需要2-3小时，同时误差较大，检测准确率不高。还有就是检测结果样本不能保存，随用随弃，而不能对干预后的患者再次检测时提供参考，不能为后期医师提供诊断指导。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种可实现早期检测，使用便捷，检测快速，检测准确率高，无创伤，易于推广的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒及其制备方法。

本发明为实现上述目的采用的技术方案是：基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，包括盒体，以及设置于盒体上的盖体，在盒体内设置有用于检测阿尔茨海默病的检测卡，用于标记检测卡上载有的生物标志物的酶，用于与酶反应后显色的底物，以及用于分别对标记、滴加底物完成后的检测卡进行清洗的缓冲液，所述检测卡包括卡体，在卡体上分别设置有对照区，以及用于检测该疾病的检测区，所述检测区上设置有用于检测人体口腔咽喉部分泌物的膜体，所述膜体上具有与阿尔茨海默抗原相结合的特异性抗体。

上述的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，所述卡体设置于盒体的上端，并与盒体固定连接，在卡体上沿检测区外边缘设置有用于防止待测样本溶液滴加至检测区上时待测样本溶液流出的边框，所述对照区设置于边框内。

上述的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，所述检测区与对照区纵向固定连接成一体后固定于卡体上，所述卡体放置于盒体内。

上述的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，所述检测区与对照区分开设置。

上述的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，所述卡体的面积为盒体上顶面面积的一半设置。

上述的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，所述卡体为玻璃板。

上述的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，所述人体口腔咽喉部分泌物为含有口腔腮部上皮细胞的漱口水。

上述的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，在所述对照区内设置有阳性阴性对照卡，所述膜体、阳性阴性对照卡均通过粘接的方式与卡体固定连接。

一种基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒的制备方法，所述膜体的制备步骤如下：

(一)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1).准备玻璃板，依次用水、10％SDS、H2O，乙醇，和水冲洗干净，备用；

(2).依次将40ml的分离胶、8ml的浓缩胶置入电泳装置中；其中，

所述分离胶的配制如下：水13.2ml；30％丙烯酰胺溶液16.0ml；1.5mol/L Tirs(PH8.8)10.0ml；10％SDS 0.4ml；10％过硫酸铵0.4ml；TEMED 0.016ml；

所述浓缩胶的配制如下：水5.5ml；10％丙烯酰胺溶液1.3ml；1.0mol/L Tirs(PH6.8)1.0ml；10％SDS 0.08ml；10％过硫酸铵0.08ml；TEMED 0.008ml；

(3).加样，将特异性抗体蛋白标准加入梳孔内；

(4).电泳，开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加至15V/cm凝胶，继续电泳至染料抵达分离胶底部，断开电源；

(5).取下凝胶，备用；

(二)、抗体从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜

(1).裁剪出尺寸大小与SDS-聚丙烯酰胺凝胶相同的6块3MM滤纸和一块硝酸纤维素膜，备用；

(2).将步骤(1)得到的滤纸及硝酸纤维素膜转移至转移缓冲液中浸泡3-5min；

(3).将步骤(2)得到的滤纸、硝酸纤维素膜及SDS-聚丙烯酰胺凝胶置入转移装置中；

(4).接通转移装置电源后，SDS-聚丙烯酰胺凝胶上带有负电的抗体向转移装置正极方向的硝酸纤维素膜移动，其中，控制为电压40V，电流为0.17-0.2A，转移时间为1.5-6h；

(5).转移结束，断电，取出转移有抗体的硝酸纤维素膜，然后将硝酸纤维素膜放在一张干净的3MM滤纸上，在室温下干燥30-60min，即得到载有特异性抗体的膜体。

上述的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒的制备方法，所述转移装置包括托盘，在托盘内设置有电极槽，在所述电极槽内对称设置有两组夹紧设置的转印组件，所述转印组件包括支架，设置于支架内侧的海绵，以及设置于海绵内侧的滤纸，所述硝酸纤维素膜设置于两组转印组件之间靠近电极槽正极的一侧，所述SDS-聚丙烯酰胺凝胶设置于两组转印组件之间靠近电极槽负极的一侧。

上述的基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒的制备方法，所述电极槽包括正极电极板和负极电极板，所述滤纸为3MM滤纸。

本发明基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒的有益效果是：

一是，本发明制备的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，在使用时，无需借助任何仪器设备，即完全脱离各种仪器的辅助，便可直接得到检测结果，使用更为便捷，且检测时间短，大概1-1.5小时就能得到检测结果，更易于推广应用。

二是，本发明首次采用Western Blot法来制备阿尔茨海默病早期检测试剂盒，该试剂盒可在短时间内直接得到检测结果；具体的摒弃传统的Western Blot法中(抗原-抗体-二抗酶)模式进行检测，而采用(抗体-抗原-抗体酶)新模式，即先将特异性抗体印转至膜体上，然后与检测样品中的阿尔茨海默抗原相结合形成抗原抗体复合物，此时特异性抗体上的酶特定结合点显露出，然后依次加入酶、底物，根据是否显色来判断检测结果，实现对阿尔茨海默病的定性检测目的；即通过利用特异性抗体来检测待测样本中是否含有抗原，来检测人体是否患有阿尔茨海默病。由于抗体是由抗原刺激产生的，所以采用检测抗原的方式，可以实现对还没有发病症状的被检测者进行检测，从而实现对阿尔茨海默病的早期诊断，达到早发现早干预的目的。且通过采用阿尔茨海默单克隆抗体与特定抗原相结合，使得检测结果更为准确。

三是，本发明的待检测样品采用口腔腮部分泌物，具体采用了漱口水，由于漱口水的采集是无创性的，且采集完成后便可直接作为检测样本使用，可减少被检测人员的疼痛，检测速度更快，可进一步缩短检测时间。

本发明通过采用Western Blot法来制备阿尔茨海默早期诊断试剂盒，能够快速得到检测结果，不仅实现了真正意义上阿尔茨海默病的早期检测，且检测准确率高，使用更为便捷，在使用时无需各种检测仪器，更易于推广，无创伤性，稳定性好，安全、可靠，值得被广泛推广应用。

附图说明

图1为实施例1中的阿尔茨海默病早期检测试剂盒结构示意图；

图2为实施例1中卡板结构示意图；

图3为转移装置结构示意图；

图4为实施例2中阿尔茨海默病早期检测试剂盒结构示意图；

图5为实施例3中检测区与对照区一体结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细说明；

实施例1

如图1、2、3所示，基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒，包括盒体1，以及设置于盒体1上的盖体2，在盒体1内设置有用于检测阿尔茨海默病的检测卡，用于标记检测卡上载有的生物标志物的酶，用于与酶反应后显色的底物，以及用于分别对标记、滴加底物完成后的检测卡进行清洗的缓冲液。检测卡包括卡体3，在卡体3上分别设置有阳性阴性对照区，以及用于检测该疾病的检测区，检测区上设置有用于检测人体口腔咽喉部分泌物的膜体4，膜体4上具有与阿尔茨海默抗原相结合的特异性抗体。

在本实施例中卡体3设置于盒体1的上端，并与盒体1固定连接。在卡体3上沿检测区外边缘设置有用于防止待测样本溶液滴加至检测区上时待测样本溶液流出的边框5，其中，也将对照区设置于边框5内，卡体3采用玻璃板。还包括用于盛装酶的酶盛装器15，用于盛装底物的底物盛装器16，用于盛装缓冲液的缓冲液盛装器17，以及用于盛装待测样本溶液的盛装器，在盒体1内还设置有用于支撑架18，支撑架18与盒体1固定连接设置。

为了方便将酶、底物、缓冲液放置盒体1内，将卡体3的面积设置为盒体1上顶面面积的一半。在阳性阴性对照区内设置有阳性阴性对照卡6，本实施例中，膜体4、阳性阴性对照卡6均通过粘接的方式与卡体3固定连接。

在本实施例中人体口腔咽喉部分泌物为含有口腔腮部上皮细胞的漱口水。其中，漱口水的采集为无创伤性的，采集较为方便，且采集完成后可直接用于检测，相较于采用尿液作为待检测样本更为方便，因无需等待处理便可使用。

一种基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒的制备方法，所述膜体的制备步骤如下：

(一)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1).准备玻璃板，依次用水、10％SDS、H2O，乙醇，和水冲洗干净，备用；

(2).依次将40ml的分离胶、8ml的浓缩胶置入电泳装置中；其中，

所述分离胶的配制如下：水13.2ml；30％丙烯酰胺溶液16.0ml；1.5mol/L Tirs(PH8.8)10.0ml；10％SDS 0.4ml；10％过硫酸铵0.4ml；TEMED 0.016ml；

所述浓缩胶的配制如下：水5.5ml；10％丙烯酰胺溶液1.3ml；1.0mol/L Tirs(PH6.8)1.0ml；10％SDS 0.08ml；10％过硫酸铵0.08ml；TEMED 0.008ml；

将配制好的浓缩胶注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡；

(3).加样，将特异性抗体蛋白标准加入梳孔内；

(4).电泳，开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加至15V/cm凝胶，继续电泳至染料抵达分离胶底部，断开电源；

(5).取下凝胶，备用；

(二)、抗体从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜

(1).裁剪出尺寸大小与SDS-聚丙烯酰胺凝胶相同的6块3MM滤纸和一块硝酸纤维素膜，备用；

(2).将步骤(1)得到的滤纸及硝酸纤维素膜转移至转移缓冲液中浸泡4min；

(3).将步骤(2)得到的滤纸、硝酸纤维素膜及SDS-聚丙烯酰胺凝胶置入转移装置中；

(4).接通转移装置电源后，SDS-聚丙烯酰胺凝胶上带有负电的抗体向转移装置正极方向的硝酸纤维素膜移动，其中，控制为电压40V，电流为0.2A，转移时间为2h；

(5).转移结束，断电，取出转移有抗体的硝酸纤维素膜，然后将硝酸纤维素膜放在一张干净的3MM滤纸上，在室温下干燥45min，即得到载有特异性抗体的膜体。

本实施例中转移装置包括托盘7，在托盘7内设置有电极槽，在电极槽内对称设置有两组夹紧设置的转印组件，转印组件包括支架8，设置于支架8内侧的海绵9，以及设置于海绵9内侧的滤纸10，硝酸纤维素膜11设置于两组转印组件之间靠近电极槽正极的一侧，SDS-聚丙烯酰胺凝胶12设置于两组转印组件之间靠近电极槽负极的一侧。其中，电极槽包括正极电极板13和负极电极板14，滤纸为3MM滤纸。

转移装置的安装步骤如下：

(a).先将两支架8平放在含有转移缓冲液的托盘7中，然后在两支架8之间依次设置硝酸纤维素膜11、SDS-聚丙烯酰胺凝胶12；

(b).然后在硝酸纤维素膜11、SDS-聚丙烯酰胺凝胶12两侧对称设置有3块3MM滤纸10和海绵9；

(c).最后将两支架8夹紧，然后在靠近硝酸纤维素膜11一侧的支架8外侧设置正极电极板13，在另一塑料支架5的外侧设置负极电极板14。

其中，基于“Western Blot”法的阿尔茨海默病早期检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

S1.将制备得到的膜体裁切成若干条，并用10％的牛血清蛋白浸泡，备用；

S2.将步骤S1得到的膜体、阳性阴性对照卡固定在边框内侧的卡板上，然用缓冲液冲洗3-5次，每次冲洗时间为0.5-1min；

S3.加样，向膜体上滴加待测样本溶液，待30-35min后，用缓冲液冲洗3-5次，每次冲洗时间为0.5-1min；

S4.然后向膜体上滴加1ml酶标羊抗人IgG，在温度为37℃条件下恒温摇动，待30-35min后，用缓冲液冲洗3-5次，每次冲洗时间为0.5-1min；

S5.最后向膜体上滴加1ml的底物溶液，显色5-10min；

S6.结果判断，观察膜体上有没有条带，并与对照卡上色条对比，如没有条带检测结果为阴性，如果有条带检测结果则为阳性。

经实验证明，采用本发明的试剂盒检测准确率高于96.7％。

在使用本发明制备的阿尔茨海默早期诊断试剂盒时，无需借助任何机器设备，即完全脱离各种仪器的使用，使用更为便捷，且检测时间短，大概1-1.5小时就能得到检测结果，更易于推广应用。由于膜体的显色剂不会掉色，检测完成后的样本可以留存下来，作为干预后对比样本，具有为后期医师诊断提供指导的作用。也就是说，为干预后的患者再次检测时提供参考，为后期医师提供诊断指导。具体的，被检测者使用本发明的试剂盒进行患病检测后，当检测结果为阳性时，可将检测样本保存下来，采取干预措施后，进行再次检测时，为再次检测结果提供参考，来分析检测阿尔茨海默病是否得到有效治疗，干预措施是否起效。如果再次检测的结果还是阳性，则可指导医生改变干预策略。

本发明首次采用Western Blot法来制备阿尔茨海默早期诊断试剂盒，摒弃传统的Western Blot法中(抗原-抗体-二抗酶)模式进行检测，而采用(抗体-抗原-抗体酶)新的模式，即先将特异性抗体印转至膜体，然后与检测样品中的特定抗原相结合形成抗体抗原复合物，此时抗体上的酶特定结合点显露出，然后依次加入酶、底物，根据是否显色来判断检测结果，通过对抗原定性检测，来实现阿尔茨海默病的早期检测，达到早发现、早干预、早治疗的的目的。

实施例2

如图4所示，与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于，在本实施例中检测区20与对照区21纵向固定连接成一体后固定于卡体3上，且卡体3是盛装于盒体内的。待测样本为人体口腔咽喉部分泌物，具体采用咽拭子检测的方式使用医用棉棒进行采集口腔腮部上皮细胞。

实施例3

如图5所示，与实施例2相同之处不再赘述，不同之处在于，在本实施例中检测区与对照区是分开设置的。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修改，都应涵盖在本发明的保护范围内。