用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记及应用

摘要

本发明涉及分子标记育种领域，具体涉及一种用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记及应用，该功能性分子标记所采用的引物序列为：FMwx1F:CACGGCATCTACAGGGACG；FMwx1R:GATGTTGTGGATGCAGAAAGC。上述的用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记可用于鉴定糯玉米自交系，采用PCR加电泳的方法来检测差异。本发明开发了一个针对waxy基因的变异位点的功能分子标记，其可以直接检测waxy基因的变异，用于分子育种，从而提高育种中选择的准确性，为利用分子标记辅助选择培育糯玉米品种奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记育种领域，具体涉及一种用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记及应用。

背景技术

糯玉米籽粒中的营养成分十分丰富，糖分、蛋白质、赖氨酸等多种氨基酸含量均高于普通玉米，并含有多种维生素和矿质元素，其淀粉分子量比普通玉米小10多倍，适口性好且更易消化吸收，深受广大人民的喜爱，同时也是加工支链淀粉的重要原料。

种质资源是培育一切优良品种的基础，因此如何高效的筛选和培育糯玉米自交系是目前研究的热点之一。常规的糯玉米自交系选育基本采用自交系选育方法、二环系选育法和回交转育法。这些方法为了保证隐性waxy1基因不丢失,通常需要育种家观察籽粒表型或通过碘染检法查配子体基因型，但这种育种方式周期长且选择效率低，已经无法完全满足当前糯玉米分子育种的需要。分子标记在糯玉米育种中的应用得到了广泛的发展，已经报道的有RAPD标记、SSR标记，都不是功能标记，在选育过程中往往易受重组、选择、环境等变化的影响。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记，所述功能性分子标记所采用的引物序列为：

FMwx1F: CACGGCATCTACAGGGACG；

FMwx1R: GATGTTGTGGATGCAGAAAGC。

上述的用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记可用于鉴定糯玉米自交系，包括如下步骤：

S1、利用FMwx1F和FMwx1R进行PCR扩增

配置PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 15μL；ddH2O 13μL；FMwx1F 0.5μL；FMwx1R0.5μL；DNA模板1μL；

配置完成后，在 PCR 仪上进行如下的反应程序：预变性95℃5min，使模板充分变性，然后进入PCR扩增循环，每个循环先95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min；循环 35次后，4℃保存，完成PCR的扩增；

S2、利琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物的检测。

将PCR扩增后的产物用3%浓度的琼脂糖凝胶分离检测，依次吸取PCR扩增后的产物6µl与1µl 的6×loading buffer溶液混匀后，依次加到点样孔中；在第一个点样孔中加入DNA Marker作为分子量标记，用于检测目的条带的大小；用1×TAE电泳缓冲液进行电泳，设置电压220V，电流150mA，时间45min；电泳结束后，用核酸染料进行染色并在凝胶成像分析系统下检测PCR反应结果并保存胶图。

本发明开发了一个针对waxy基因的变异位点的功能分子标记，其可以直接检测waxy基因的变异，用于分子育种，从而提高育种中选择的准确性，为利用分子标记辅助选择培育糯玉米品种奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例中差异位点比对图。

图2为本发明实施例中的胶图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

分子标记的获得：

本研究基于已经研究的waxy糯基因数据库通过NCBI下载序列分析得到一个用于检测waxy的功能性分子标记FMwx1F和FMwx1R，并对该实验室已有的糯玉米自交系进行PCR扩增，并使用该分子标记进行验证。

显性基因序列：

CACGGCATCTACAGGGACGCAAAGGTTGCCTTCTCTGCTGAACTGAACAACGCCGTCTTCGTTCTCCATGCTCGTATATACCTCATCTGGTGGTGGTGCTTCTCTGAAACTGAAACTGAAACTGACTGCATGTCTGTCTGACCATCTTCACGTACTACCTACCAGACCGCTTTCTGCATCCACAACATC

隐性基因序列：

CACGGCATCTACAGGGACGCCGTTTTCGTTCTCCATGCTCGTATATACCTCGTCTGGTAGTGGTGGTGCTTCTCTGAGAAACTAACTGAAACTGACTGCATGTCTGTCTGACCATCTTCACGTACTACCAGACCGCTTTCTGCATCCACAACATC

差异位点比对图如图1所示，前7个样品是普通玉米自交系为显性Waxy基因序列，后6个样品是纯合糯玉米自交系为隐性waxy基因

功能标记的应用方法：

本发明提供了一种检测waxy基因并鉴定糯玉米自交系的方法，具体来说，该方法为PCR加电泳来检测差异的方法，具体步骤如下：

S1、利用FMwx1F和FMwx1R进行PCR扩增

配置如表1所示的PCR反应体系，其中，FMwx1F: CACGGCATCTACAGGGACG；FMwx1R:GATGTTGTGGATGCAGAAAGC；

表1. PCR反应体系

配置完成后，在 PCR 仪上进行如下的反应程序：预变性95℃5min，使模板充分变性，然后进入PCR扩增循环，每个循环先95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min；循环 35次后，4℃保存，完成PCR的扩增；

S2、利琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物的检测

将PCR扩增后的产物用3%浓度的琼脂糖凝胶分离检测，依次吸取PCR扩增后的产物6µl与1µl 的6×loading buffer溶液混匀后，依次加到点样孔中；在第一个点样孔中加入DNA Marker作为分子量标记，用于检测目的条带的大小；用1×TAE电泳缓冲液进行电泳，设置电压220V，电流150mA，时间45min；电泳结束后，用核酸染料进行染色并在凝胶成像分析系统下检测PCR反应结果并保存胶图。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacggcatct acagggacg 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatgttgtgg atgcagaaag c 21

<210> 3

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacggcatct acagggacgc aaaggttgcc ttctctgctg aactgaacaa cgccgtcttc 60

gttctccatg ctcgtatata cctcatctgg tggtggtgct tctctgaaac tgaaactgaa 120

actgactgca tgtctgtctg accatcttca cgtactacct accagaccgc tttctgcatc 180

cacaacatc 189

<210> 4

<211> 155

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacggcatct acagggacgc cgttttcgtt ctccatgctc gtatatacct cgtctggtag 60

tggtggtgct tctctgagaa actaactgaa actgactgca tgtctgtctg accatcttca 120

cgtactacca gaccgctttc tgcatccaca acatc 155