西南糯玉米地方品种waxy基因表达研究

摘要

糯玉米其糯质受隐性waxy基因控制，其特点是籽粒胚乳中的淀粉几乎全为支链淀粉。糯玉米具有许多优良特性，品质极佳，具有很高的经济价值，是食品、纺织、造纸、酿造、饲料等行业的重要原料。国外研究者对糯玉米突变体研究认为，由于Ac/Ds、Spm/En转座子及反转录转座子插入到玉米waxy基因5’UTR、内含子、外显子中，或waxy基因内发生缺失，影响waxy基因的正确表达，而使直链淀粉合成受阻。我国西南地区是天然Wx突变体即糯玉米遗传多样性中心，糯玉米的种质资源极其丰富。因此，通过对西南糯玉米waxy基因表达的研究，为阐明西南糯玉米糯质表型形成原因提供理论参考。本研究以8份西南糯玉米地方品种、2份普通玉米自交系黄早四和478为研究对象，从翻译水平和转录水平揭示糯玉米waxy基因表达的变化，并在DNA水平上揭示引起waxy基因表达变化的原因。主要研究内容及结果如下： ⑴在蛋白质水平上，利用SDS-PAGE电泳分析普通玉米、糯玉米的Wx蛋白是否存在差异。电泳结果表明，西南糯玉米胚乳中无Wx蛋白的合成或有极少量的Wx蛋白的合成；而普通玉米中有Wx蛋白的合成。序列分析表明西南糯玉米地方品种籽粒胚乳中无Wx蛋白或有极少量的Wx蛋白的原因可能是：①waxy基因的翻译进程受到抑制；②合成的Wx蛋白，但其不能进入淀粉体或不能结合淀粉粒；③合成的Wx蛋白极不稳定，迅速被降解。④Wx蛋白失去活性。 ⑵在转录水平上，采用半定量RT-PCR和克隆技术研究糯玉米、普通玉米中Wx基因表达是否存在差异。半定量RT-PCR结果研究表明：与普通玉米waxy相比，糯玉米中waxy基因表达降低。这表明西南糯玉米糯质表型与waxy基因表达降低有关。对糯玉米的ORF序列分析表明：糯玉米waxy基因不存在异常剪切或可变剪切。这表明糯玉米中waxy基因表达与普通玉米中waxy基因表达的差异主要受转录水平的调控。Wx基因在转运肽区域插入了3bp或9bp以及存在错义突变，该处发生的变异可能改变转运肽的功能。在第10外显子缺失了15bp，该处发生的变异可能影响Wx蛋白的活性。另外，在糯玉米waxy基因中PolyA信号提前出现，其序列为AATATAATAGT；相似的polyA信号AATATG在Gierl的研究转座子Spm-18中发现。 ⑶在DNA水平上，采用克隆技术进行序列分析糯玉米waxy基因表达发生变化的原因。分析结果表明：与普通玉米相比，糯玉米waxy基因5’UTR区域是保守的，具有完整的CAAT box、GC box、TATA box。在3’UTR区域存在较大差异，该处发生的变异极可能是引起糯玉米中waxy基因表达降低的主要原因，且3’UTR区域发生的变异不同于人工选育的糯玉米自交系。在内含子上存在不同DNA片段的插入、缺失以及单个碱基的替代；在内含子中发生变异的序列多为正向重复序列，属于“滑脱错配”现象。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 文献综述

1.1 糯玉米的起源

1.2 糯玉米的分布与特点

1.2.1 长江下游沪与杭嘉湖平原优质早熟生态区

1.2.2 长江上游滇、黔、川、桂高地遗传多样性生态区

1.2.3 北方高产生态区

1.3 西南地区糯玉米种质资源的遗传多样性

1.3.1 农艺性状

1.3.2 品质性状

1.3.3 分子标记揭示糯玉米种质资源遗传多样性

1.4 糯玉米的用途

1.5 waxy基因概述

1.6 Wx蛋白概述

1.7 waxy基因表达调控研究进展

1.7.1 Wx突变体研究进展

1.7.2 我国糯玉米糯质表型研究

1.8 实验目的与意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 材料处理

2.1.3 生化试剂及引物序列

2.2 实验方法

2.2.1 蛋白质水平检测糯玉米waxy基因表达

2.2.2 半定量RT—PCR(Semi—Quantitative RT—PCR)

2.2.3 waxy基因ORF(open reading frame)的克隆

2.2.4 waxy基因全长克隆及分析

3 结果与分析

3.1 蛋白质水平检测waxy基因表达

3.2 转录水平检测waxy基因表达

3.2.1 总RNA琼脂糖电泳图谱

3.2.2 半定量RT—PCR(sq RT—PCR)

3.2.3 西南糯玉米waxy基因cDNA序列分析

3.3 waxy基因全长克隆

3.3.1 waxy基因序列PCR扩增产物琼脂糖电泳图谱

3.3.2 waxy基因启动子和5’UTR序列分析

3.3.3 waxy基因内含子区序列分析

3.3.4 waxy基因3 'UTR变异

4 讨论

4.1 西南糯玉米waxy基因在蛋白水平低水平表达或不表达的原因

4.2 西南糯玉米waxy基因在转录水平低水平表达的原因

4.3 DNA水平上分析糯玉米waxy基因表达发生变化的原因

4.4 西南糯玉米糯质表型的分子机制

4.5 下一步的工作

参考文献

附一 药品配方

附二 碘染图片

致 谢