一种用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物及其用途

摘要

本发明公开了LCA凝集素在制备用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的试剂中的用途。本发明通过采用凝集素微阵列检测类风湿关节炎(RA)患者血清IgG分子与凝集素特异性结合的聚糖谱，结果显示，LCA凝集素结合聚糖的含量在RA患者中是升高的。由于LCA凝集素是特异性结合葡萄糖，这表明葡萄糖水平在RA患者中的表达是升高的。进一步研究发现，LCA凝集素结合聚糖水平在RA相关间质性肺病(RA‑ILD)患者中的表达较非ILD患者更高，LCA凝集素结合聚糖水平可作为RA‑ILD的生物学标志物。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物及其用途。

背景技术

类风湿关节炎(RA)是常见的风湿免疫疾病,是一种以关节滑膜病变为主要特征的慢性全身免疫性疾病,其主要临床特征表现为慢性对称性关节肿痛、滑膜炎、关节部位压痛伴有晨僵,可以导致关节功能丧失,同时伴有关节外器官受累。研究表明，我国目前约有500万RA患者，其中未达到临床缓解的患者超过80％，给患者、家庭和社会带来了沉重的负担。由于该病是典型的致残、致死、致痛苦以及治疗药物副作用大和造成巨大经济损失的“5D”疾病，已引起临床工作者的高度重视。目前，临床上用于诊断RA乃至RA相关性肺间质病变(RA-ILD)的生物标志物具有一定的局限性，不同的方法学所致的敏感性及特异性也存在差异，迫切需要新的生物标志物来对RA-ILD进行早期诊断，早期治疗。

免疫球蛋白连接聚糖影响抗体的效应功能，这取决于N-聚糖和/或N-聚糖或O-聚糖的末端糖包括半乳糖和唾液酸的分支结构。IgG是血清中含量最高的Ig，结构上IgG分为可以受体结合Fc段以及和抗原结合的Fab臂。研究表明，自身免疫性疾病均具有独特的糖基化表达谱,在自身免疫性疾病的发生发展中发挥这重要的作用。例如血清IgG的Fc段糖基化水平的异常可造成机体抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用或补体依赖性细胞毒作用等免疫效应功能的变化。此外，IgG的Fab段糖基化水平异常会影响体内抗体半衰期、改变抗体的稳定性和聚集、通过聚糖信号通路导致恶性B细胞的存活、并且与静脉注射免疫球蛋白抗炎活性相关。由此可见，糖基化的研究已成为深入了解自身免疫性疾病的发病机制、疾病分类、病情评估、治疗效果、预后判断、疾病转归潜在的工具。

鉴于糖基化在疾病中的重要作用，我们拟通过高通量的糖基化分析技术——凝集素微阵列技术来筛查RA-ILD患者血清IgG糖基化的表达，以期探讨糖基化在RA-ILD中的临床应用价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物及其用途。

首先，本发明提供一种用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物，其为LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物。

其中，所述的IgG含有葡萄糖。

其次，本发明还提供所述生物标志物在用于制备诊断类风湿关节炎的试剂中的用途。

具体地，所述诊断包括：测定获自呈现类风湿性关节炎的患者的生物样品中LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平；任选地，

与对照数据比较所述生物样品中LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平可检测地升高表明患类风湿关节炎的可能性。

进一步地，相对于非合并肺间质纤维化的类风湿关节炎患者的数据，LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平可检测地升高表明患类风湿关节合并肺间质纤维化的可能性。

其中，所述生物样品为血清样品。

本发明还提供LCA凝集素在制备用于诊断类风湿关节炎的试剂中的用途。

其中，所述诊断包括：将LCA凝集素与获自呈现类风湿性关节炎的患者的生物样品进行接触，测定LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平；任选地，

与对照数据比较所述生物样品中LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平可检测地升高表明患类风湿关节炎的可能性。

进一步地，相对于非合并肺间质纤维化的类风湿关节炎患者的数据，LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平可检测地升高表明患类风湿关节合并肺间质纤维化的可能性。

其中，所述生物样品为血清样品。

在本发明具体的实施方案中，LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平通过以下步骤来测量，包括：

a.使来自患者的生物样品与LCA凝集素接触；

b.在生物样品中存在的IgG与LCA凝集素之间形成凝集素-聚糖复合物；

c.洗涤来除去任何未结合的IgG；

d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；

e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；和

f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。

其中，所述的LCA凝集素沉积或固定在固相表面载体上。

其中，所述的固相表面载体优选为乳胶珠子、多孔平板或膜条、纳米管道、带二维码的薄片等的形式。

其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。

另一方面，本发明还提供一种用于检测和/或定量生物样品中能与LCA凝集素结合的IgG的诊断试剂盒，包括：一种固相表面载体，其中，所述的LCA凝集素沉积或固定在固相表面载体上，其中，LCA凝集素与IgG结合所形成的复合物作为类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物。

在本发明优选的实施方案中，所述试剂盒还包括被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体。

优选地，所述固相表面载体是乳胶珠子、多孔平板或膜条、纳米管道、带二维码的薄片等的形式。

本发明通过采用凝集素微阵列检测类风湿关节炎(RA)患者血清IgG分子与凝集素特异性结合的聚糖谱，结果显示，LCA凝集素结合聚糖的含量在RA患者中是升高的。由于LCA凝集素是特异性结合葡萄糖，这表明葡萄糖水平在RA患者中的表达是升高的。进一步研究发现，LCA凝集素结合聚糖水平在RA相关间质性肺病(RA-ILD)患者中的表达较非ILD患者更高，LCA凝集素结合聚糖水平可作为RA-ILD的生物学标志物。

附图说明

图1所示为凝集素微阵列56个凝集素(三复孔)在阵列载玻片的布局。

图2所示为RA-ILD组、RA-non ILD组、DC组和HC组LCA凝集素信号值比较。

图3所示为凝集素微阵列同批次标本ConA凝集素印记验证图。

图4所示为凝集素微阵列同批次标本LCA凝集素印记结果灰度值比较。

图5所示为新批次标本LCA凝集素印记验证图。

图6新批次标本LCA凝集素印记结果灰度值比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实验标本：纳入本次研究的研究对象分成三组：RA组(35例，其中有15例RA-ILD)，疾病对照组(DC，包括40例自身免疫性疾病，其中系统性红斑狼疮20例，特发性炎症性肌病20例)，健康对照组(HC，包括43例健康体检者)。研究对象资料见表1。其中RA组和DC组的诊断均符合相应疾病的诊断标准。入组的人群均采集新鲜血液，并立即分离出血清，-80℃冻存备用。

表1凝集素微阵列检测118例研究对象的基本资料

实施例1凝集素微阵列分析血清IgG糖基化

由56种凝集素微组成的凝集素微阵列。将56种凝集素一式三份固定到芯片中,将每个患者的血清进行1:200稀释,添加到微阵列中，4℃孵育过夜。然后,抗IgG-Cy5共轭在避光环境中与微阵列芯片杂交1小时。对所有蛋白的荧光强度进行了独立分析。并将芯片图像转换为数字格式进行分析。

利用各凝集素点的信噪比(点的前景值与背景值的差值)计算了各凝集素点的信噪比(S/N)。为了防止凝集素微阵列在阵列间的偏置,我们使用阵列之间的归一化来归一化S/N数据。根据以下规则,通过组间的数据分布来确定凝集素结合力的显著性差异:(1)组间比较>1.7或<0.588；(2)组间比较检验类型，若符合正态性，选择T检验，否则选择非参数检验，若P值<0.05或者fisher检验P值<0.05或者[ROC_AUC>＝0.6并且ROC_P值<0.05)]。

采用含有56个凝集素的凝集素微阵列来检测实验标本中的糖基化状态(图1)。凝集素可特异性的结合糖蛋白末端的聚糖分子，形成复合物，通过不同的凝集素与聚糖的特异性结合来研究目的蛋白表面聚糖的种类与含量。凝集素微阵列因其高效的特点，现今已越来越广泛的应用到糖基化的研究。冻存的标本室温平衡后，加入到凝集素微阵列，与之反应，再经过洗涤、封闭、荧光二抗反应和荧光检测等步骤，可获得每个凝集素与之特异结合聚糖的信号值，信号值与结合亲和力以及结合强度相关。

为了确保收集到的荧光信号来源于IgG的特定结合,我们使用Cy5标记IgG抗体。同时满足前述两种的凝集素S/N数据被认定为具有显著性差异，共筛选出7种凝集素(表2)。

表2凝集素微阵列中具有显著性差异的凝集素

Man：甘露糖；GlcNAc：N-乙酰葡糖胺；Glc：葡萄糖；GalNAc：N-乙酰半乳糖胺；Gal：半乳糖；DC：疾病对照组；HC：健康对照组。*：P<0.05；**：P<0.01。

6种凝集素的亲和力信号值显示出四组样本之间有显著性差异。S/N数据显示RA-ILD患者组相对于RA-non ILD组、DC组和HC组的IgG糖基化变化：(1)通过检测与刀豆凝集素A(ConA)的结合增加，表明RA-ILD患者甘露糖糖链的增加(P均<0.05)；(2)通过检测与曼陀罗凝集素(DSL)结合的升高，表明RA-ILD患者N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)的升高(P均<0.05)；(3)通过检测与扁豆凝集素(LCA)和豌豆凝集素(PSA)的结合升高，表明RA-ILD患者葡萄糖(Glc)的升高(P均<0.05)；(4)通过检测与辣木凝集素(黑接骨木)(MNA-M)结合升高，表明RA-ILD患者半乳糖(Gal)的升高(P均<0.05)；(5)通过检测与大豆凝集素(SBA)的结合降低，表明RA-ILD患者N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的降低(P均<0.05)。图2显示了RA-ILD组、RA-nonILD组、DC组和HC组LCA凝集素信号值比较。

实施例2血清凝集素印记验证实验

为了进一步明确凝集素微阵列检测出来的差异表达糖基化，分别采用凝集素微阵列同批次的12例标本(6例RA-ILD，6例RA-non ILD)和新批次12例标本(5例RA-ILD，7例RA-non ILD，基本资料见表3)进行了凝集素印记进行验证。血清标本1：100稀释后，与上样缓冲液混合，100℃煮沸5分钟后，在10％的预制胶中进行SDS-PAGE电泳，再将预制胶中蛋白电转移到PVDF膜中。将转印成功的PVDF膜进行封闭后，与Cy3标记的凝集素进行杂交，最后通过荧光呈像仪检测荧光信号。荧光信号的强度与凝集素结合的糖蛋白糖基的结合力呈正比。

通过对12例凝集素微整列同批次患者标本进行凝集素印记的结果比较(图3)，与RA-non ILD患者相比，血清IgG与LCA凝集素的结合强度在RA-ILD患者中是升高的(图4)。此外，对12例新批次患者标本进行凝集素印记的结果比较(图5)，与RA-non ILD患者相比，血清IgG与LCA凝集素的结合强度在RA-ILD患者中同样是显著升高的(P均<0.05)(图6)。

以上结果表明，RA-ILD患者血清中LCA凝集素结合的聚糖——葡萄糖水平是异常的，并且RA-ILD患者比RA-non ILD患者具有更高的LCA凝集素结合聚糖水平。

表3凝集素印记验证新批次RA患者的疾病资料

结果表明，LCA凝集素结合聚糖水平在RA-ILD患者中的表达较RA-non ILD患者更高，表明LCA凝集素结合聚糖水平可作为RA-ILD的生物学标志物。