用于将mRNA转染到细胞中的组合物及其应用

摘要

本发明涉及用于将信使RNA(mRNA)转染到细胞中的组合物及其应用。本发明涉及用于将mRNA转染到细胞中的组合物，所述组合物包含mRNA、至少一种中性脂质和式(I)的阳离子脂质，其中R1、R2、R3、R4和R5、(CH2)n和A‑如本说明书中所定义。本发明还涉及所述组合物的用途和体外转染活细胞的方法。

说明书

本发明涉及用于将信使RNA(mRNA)转染到细胞中的组合物及其应用。本发明涉及用于将mRNA转染到细胞中的组合物，所述组合物包含mRNA、至少一种中性脂质和式(I)的阳离子脂质，其中R

将遗传物质引入细胞中对现代生物学和医学的发展至关重要，并为我们提供了许多有关基因功能和调控的知识。在几乎所有情况下，都已将DNA用于转染目的，因为其具有固有的稳定性以及整合到宿主基因组中从而产生稳定转染子的能力。有多种方法可以将遗传物质引入细胞中。这些方法包括简单的操作，例如将DNA与磷酸钙、DEAE-葡聚糖、聚赖氨酸或载体蛋白混合。其他方法包括显微注射、电穿孔、原生质体融合、脂质体、基因枪递送、阳离子聚合物和病毒载体，等等。

转染质粒DNA是在培养中生长的细胞中过度表达蛋白质的最简单且最常见的方法。当该方法失败时，转染试剂通常被视为罪魁祸首，或者简单地认为细胞“难以转染”。

然而，不是DNA的摄取/递送，而是其一旦进入细胞内的处理可能是该技术的主要限制。在最终翻译成蛋白质之前，到达并穿透细胞核、将mRNA转录并释放到细胞质中都是关键步骤。

涉及使用现有阳离子聚合物基因载体进行细胞转染的主要问题是在接近所需的转染效率的同时面临较高的细胞毒性。

那么用mRNA序列而不是质粒DNA构建体转染细胞为显著提高大多数细胞类型中的瞬时蛋白表达水平提供了很好的机会，并为具有挑战性的细胞提供了独特的选择。

转染的mRNA不需要到达细胞核即可进行细胞作用。翻译是通过不依赖启动子的过程进行的，并且早在转染后6小时就可以检测到所需的蛋白质。

先前在1989年(Malone等人，1989)描述过使用转染步骤将mRNA引入哺乳动物细胞，但是由于mRNA缺乏稳定性，因此其使用在很长一段时间内受到限制。另一个问题是外源mRNA是免疫原性的并且通过Toll样受体(TLR)识别诱导强免疫应答(Heil等人，2004；Kariko等人，2004)。然而，核苷的适当化学修饰可以减少免疫激活以及mRNA降解。已证明含有5-甲基胞苷、N

近年来，使用转染的mRNA生产所需的蛋白质越来越受欢迎。表达的瞬时特征很具吸引力且非常适合于许多应用，在这些应用中，细胞内蛋白或肽的产生以及膜或分泌蛋白的表达都是必要的。例如，在递送编码转录和重编程因子的mRNA后，将体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)被证明是非常有效的。与病毒方法相比，该过程更安全，因为这是在基因组中的非整合方法(Yoshioka等人，2013；Warren等人，2010)。在递送mRNA后，还可以实现干细胞向体细胞的分化，其中该应用需要分化因子的瞬时和快速表达。将mRNA或长RNA(例如基因组病毒RNA))引入生产者细胞也与产生重组蛋白、抗体或重组病毒有关。

基因组编辑技术广泛用于将位点特异性修饰(基因组工程)引入细胞基因组中，包括进行修复或引入突变、缺失或基因替换。基因组修饰可以通过使用核酸内切酶如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复相关的系统(CRISPR/Cas)来实现。RNA引导的DNA核酸内切酶(例如Cas9蛋白)对修饰基因组非常有效(Doudna和Charpentier，2014)。CRISPR-Cas 9系统通过与后接独特的原间隔相邻基序(PAM)的单向导RNA(sgRNA)进行Watson-Crick碱基配对，将特定的DNA目标序列识别组合到基因组中，Cas9结合和切割该目标序列导致DNA目标中的双链断裂(Ran等人，2013)。双链DNA断裂通过修复系统检测出，并通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)事件进行修复。NHEJ导致基因组中的永久插入或缺失，而HDR需要DNA模板的存在，从而导致通过模板的同源重组并入基因组中。必须将CRISPR-Cas9的所有组件引入细胞中，包括sgRNA、Cas9蛋白和供体DNA模板，在HDR的情形下。将Cas9蛋白直接引入细胞中或通过DNA质粒或mRNA编码(Ran等人，2013)。使用mRNA的方法很具吸引力，因为Cas9的表达非常短暂，没有基因组整合的风险，从而避免了稳定的长期表达以及基因组修饰发生脱靶事件的风险。

基于mRNA的基因转移正成为很有前景的治疗方法(Yamamoto等人，2008，Tavernier等人，2011)。使用mRNA的最先进的方法之一是通过直接给药对病毒感染和癌症采取疫苗接种。已经报道将编码抗原的mRNA有效递送到体内的免疫细胞尤其是抗原呈递细胞(例如树突状细胞)中并证明能诱导编码抗原的表达、抗原呈递以及体液或细胞免疫应答。mRNA递送后抗原在肿瘤细胞上的表达也是一种新的免疫治疗方法。mRNA转移到肌肉中可以导致诱导特异性免疫应答的分泌抗原的产生。为了疫苗接种，通过IVT(体外转录技术)对mRNA本身的免疫激活可能是有益的，并且可以通过核苷修饰进行调节。许多基于mRNA的疫苗现在正在临床试验评估中(Kaczmarek等人，2017)。临床上试验的许多方法都是基于对用编码特异性抗原或免疫调节剂的mRNA离体转染的树突状细胞的过继转移。肌肉注射裸mRNA目前被用于触发基于RNA的疫苗接种。最近开发了治疗性mRNA的系统应用，以通过由病毒或非病毒载体(例如脂质纳米颗粒)介导的递送方式靶向肺、肝或肿瘤。

对于非免疫疗法相关的应用，例如针对遗传性疾病的蛋白质替换，必须尽可能减少IVT mRNA介导的免疫激活，以避免通过激活干扰素通路导致的细胞死亡。Kormann等人使用遗传性疾病先天性表面活性蛋白B(SP-B)缺乏的小鼠模型研究了修饰的mRNA在肺中的治疗潜力。局部重复鼻腔给药具有SP-B mRNA的气雾剂导致高水平的SP-B表达和具有低水平免疫激活的被治疗动物的存活(Kormann等人，2011)。这些结果通过分别用s2U和m5C置换包含在mRNA序列中的25％的尿苷和胞苷获得。分别使用25％或100％的尿苷和胞苷核碱基置换，通过肌肉注射(Kormann等人，2011)和腹膜内给药(Kariko等人，2012)注射EPO mRNA实现了促红细胞生成素蛋白(EPO)在小鼠中的系统表达。

将mRNA有效地引入细胞中需要转染的试剂、组合物或制剂。这些产品通常是阳离子系统，其能够通过静电结合与mRNA相互作用或复合。然后它们就能够与质膜相互作用，并通过细胞膜或内吞过程诱导mRNA转运。主要使用的是阳离子脂质或聚合物体系。它们中的大多数包含在酸性条件下可质子化的胺、或融合脂质，其通过胞内体裂解(endosomolysis)或胞内体膜失稳促使细胞质中mRNA的胞内释放。适合的阳离子聚合物(在Kaczmarek等人，2017中进行了论述)是聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚乙二胺(polyamidoamine)、聚(β-氨基酯)或寡聚烷基胺(Jarzebinska等人，2016)。针对mRNA转染已报道了阳离子聚合物的许多衍生物，诸如环糊精-PEI(Li等人，2017)、硬脂酸-PEI(Zhao等人，2016)、芳族-PEI(Chiper等人，2017)或组氨酸-PEI(Goncalves等人，2016)。许多在生理pH下具有净正电荷以与mRNA静电结合的市售阳离子脂质制剂可获得，并据报道其能在细胞中有效地载送mRNA，例如Thermo Fisher Scientific的Lipofectamine Messenger Max、Lipofectamine RNAiMax或Lipofectamine 2000，Mirus Bio的TransIT-mRNA或Stemgent的StemFect。阳离子脂质似乎比阳离子聚合物(例如PEI)更有效地将mRNA递送到细胞中，如Rejman等人，2010和De Haes等人，2013中所报道的那样。然而，如Drews等人，2012中所述，当他们使用Lipofectamine RNAiMax转染编码用于生成iPS细胞的重编程因子的mRNA时，毒性和免疫应答可能与阳离子脂质转染相关联。这样的副作用可限制许多阳离子脂质在体内应用中的使用。

美国专利7479573描述了具有下式的阳离子化合物：

其中，

L为{(CH

并且其中(CH

R

R

R

R

X是生理上可接受的阴离子；以及

a是正电荷数除以所述阴离子的化合价；

i和j独立地为0到100的整数；

k为1到25的整数；并且

其中R

上述阳离子化合物的商品名为

含DNA的脂质体(表面带正电荷)可以与活细胞的带负电荷的质膜融合，这是由于中性辅助脂质介导的脂质体与细胞膜的融合所致，从而允许核酸穿过进入细胞质且内容物可供细胞复制或表达。

美国专利5,627,159描述了在血清存在下转染动物细胞的方法，其包括使所述细胞与包含核酸和阳离子脂质的脂质聚集体接触，其中所述改进包括：在聚阳离子化合物存在下，使所述细胞与所述脂质聚集体接触，从而用所述核酸转染所述动物细胞，或使所述脂质聚集体与所述聚阳离子化合物接触以形成混合物，然后使所述细胞与所述混合物接触，从而用所述核酸转染所述动物细胞。

在美国专利8,399,422中描述了用于转染siRNA的组合物，其包含寡核苷酸和具有式I的阳离子两亲分子

其中X是N-R

该专利8,399,422要求该组合物含有寡核苷酸并用于siRNA干扰。

小干扰RNA(siRNA)具有由短双链RNA(通常长度为20至25个碱基对)组成的明确定义的结构。

与siRNA不同，mRNA是单链的，其可局部具有可变或复合结构(包括二级结构，例如配对区域、不配对区域、位于末端或中心的环)，并且与siRNA相比具有对应于长分子的高分子量。成熟的真核mRNA还由5'-帽结构(m7GpppN或m7Gp3N)、5'非翻译区(5'UTR)、编码蛋白质或肽的开放阅读框(ORF)、3'非翻译区(3'UTR)和多聚腺苷尾(100至250个腺苷残基)组成。

因此，本发明的目的是提供用于转染mRNA的更有效的转染制剂。

本发明的另一个目的是提供使用所述制剂转染mRNA的方法。

本发明涉及适用于将信使RNA(mRNA)转染到细胞、特别是哺乳动物细胞、优选人细胞中的组合物，所述组合物包含mRNA、至少一种中性脂质和式(I)的阳离子脂质：

其中，

-R

-R

-(CH

-A

本发明的组合物是阳离子组合物，尤其是阳离子脂质体组合物，其能够与带负电荷的DNA和细胞膜相互作用。将阳离子脂质与中性脂质稳定地配制为小尺寸脂质体。调节所述阳离子组合物(特别是所述阳离子脂质体)中的阳离子脂质和中性脂质的比例调节所述组合物(特别是所述阳离子脂质体)的表面电荷密度。当形成脂质体时，中性脂质的结构调节阳离子脂质体的层状结构、脂质双层刚性以及与细胞膜的融合活性，其参与到脂质复合体(核酸/阳离子脂质体复合物)内吞后的内体逃逸中。所形成的脂质体可具有50nm至200nm的平均尺寸，优选具有100nm的平均尺寸。

在本发明的特定实施方案中，所述至少一种中性脂质包括由连接到甘油分子上的三个脂肪酸组成的任何甘油三酯。优选地，所述至少一种中性脂质选自：磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)衍生物、脂质-聚乙二醇(PEG)缀合物、胆固醇衍生物和磷脂酰乙醇胺衍生物，例如1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-diphenytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)(DPyPE)、棕榈酰基亚油酰基磷脂酰乙醇胺(PaLiPE)、二亚油酰基磷脂酰乙醇胺(DiLiPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)。本发明的组合物可包含至少两种、至少三种或至少四种中性脂质，优选至少两种或三种中性脂质，所述中性脂质选自DPyPE、DOPE、胆固醇和脂质-PEG缀合物。优选地，所述至少一种中性脂质是DOPE或DPyPE，更优选地是DPyPE。因此，所述至少一种中性脂质可以是单一的中性脂质。

在本发明的特定实施方案中，在式(I)中，(CH

在本发明的另一特定实施方案中，(CH

在本发明的特定实施方案中，R

在另一特定的实施方案中，R

在本发明的优选实施方案中，(CH

在本发明的另一优选实施方案中，(CH

在本发明的另一优选实施方案中，(CH

在本发明的另一优选实施方案中，(CH

在本发明的特定实施方案中，(CH

在本发明的优选实施方案中，(CH

在本发明的另一优选实施方案中，(CH

在本发明的另一优选实施方案中，(CH

在本发明的另一优选实施方案中，(CH

在进行结构活性筛选后，发明人已识别出式(I)的阳离子脂质，其为基于咪唑鎓的阳离子脂质(图1)。

如本文所定义的，术语“咪唑鎓”是指通过咪唑质子化而含有阳离子形式的有机化合物，所述咪唑环中构成环的五个原子中的两个是氮原子。

在本发明的特定实施方案中，式(I)的阳离子脂质选自以下化合物：

在本发明的优选实施方案中，式(I)的阳离子脂质选自以下化合物：

在本发明的更优选实施方案中，式(I)的阳离子脂质选自以下化合物：

在本发明的特定实施方案中，上述选定的特定阳离子脂质选自以下群组：

-W9.7、W10.7、W11.7、W12.7、W13.7、W14.7、W15.7、W16.7、W17.7、W18.9、W19.7、W20.7、W21.7、W22.7、W23.7、W25.7、W26.7、W27.7、W28.7和W29.5，或

-W12.7、W20.7、W21.7和W22.7，

并且在所述组合物中与中性脂质DOPE或DPyPE、优选DPyPE结合。

在本发明的特定实施方案中，A

在本发明的特定实施方案中，式(I)的阳离子脂质与所述至少一种中性脂质的摩尔比为1:1至1:2，优选为1:1.5。

在本发明的特定实施方案中，所述mRNA与所述阳离子脂质和所述至少一种中性脂质的摩尔比为1:2至1:20，优选为1:5、1:10或1:15。

在本发明的特定实施方案中，所述mRNA是真核mRNA，特别是编码哺乳动物的蛋白、特别是人蛋白的mRNA。

在本发明的特定实施方案中，所述真核mRNA的5'-端被加帽。这允许创建能够在蛋白质合成期间被翻译的稳定且成熟的信使RNA。优选地，所述mRNA的5'-端用以下结构加帽：7-甲基鸟苷结构；帽结构类似物，如抗反向帽类似物(ARCA)；帽0结构，其包括7-甲基鸟苷酸帽；帽1结构，其包括7-甲基鸟苷酸帽和在第一核糖上的甲基化的2'-羟基基团；或帽2结构，其包括7-甲基鸟苷酸帽(m

适于有效转染的mRNA的来源一直是个问题，直到体外转录技术(IVT)改进，该技术现在是从DNA模板提供高质量和保真度的mRNA的有效方法。通过许多具有成本效益的市售试剂盒可以产生足量的mRNA。此外，可以通过酶促反应实现转录后修饰，以合并5’-端加帽和3’-端多聚腺苷酸化。为了本发明的目的，这样的体外合成技术因此可用于复制成熟真核mRNA，例如任选地由帽结构(所述帽如本文中所定义，特别是m7GpppN或m7Gp3N)、5’非翻译区(5’UTR)、编码蛋白质或肽的可读框(ORF)、3’非翻译区(3’UTR)和任选存在的多聚腺苷酸尾(100至250个腺苷残基)组成的mRNA。

如本文所定义，术语“对mRNA加帽”是指用脒基修饰帽对真核mRNA的5’-端加帽，这样极大地增加了RNA的稳定性以及进入核糖体中以进行翻译的加载。在自然产生的mRNA中，提供帽也改善了在mRNA于细胞核中转录后的核输出。在本发明的上下文中，mRNA的转染不涉及从细胞核的输出，因为转染的mRNA是直接提供给细胞质的。然而，加帽对于确保mRNA到达核糖体以进行翻译是必要的或有用的。因此，在mRNA转染到其翻译所在的细胞中之前，将其加帽。

“加帽0或加帽1或加帽2”是指对核碱基中5’-端鸟嘌呤的修饰。根据已知的帽命名法，帽0是指7-甲基鸟苷酸帽(m

在本发明的特定实施方案中，所述mRNA，尤其是加帽的mRNA，被进一步3'-端多聚腺苷酸化和/或含有修饰的核苷。尤其选择修饰的核苷，以便在转染到宿主细胞中时提高所述mRNA的稳定性和/或防止对所述mRNA的有害免疫激活反应。为了使免疫应答最小化，修饰的核苷可包括在mRNA合成期间，并且包括例如5-甲氧基尿苷、2-硫尿苷、5-碘尿苷、5-溴尿苷、5-甲基胞苷、5-碘胞苷、5-溴胞苷、2-硫代胞苷、假尿苷、N

在本发明的特定实施方案中，所述mRNA编码：(i)肽(具有约6至50个氨基酸残基的氨基酸残基长度)，尤其是用于疫苗接种的肽，例如与肿瘤有关的抗原或病毒抗原；(ii)酶，尤其是核酸酶，例如内切核酸酶(例如锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复相关系统(CRISPR/CAS))或核酸外切酶(在CAS9蛋白的实施例中提供了核酸酶的说明)；或(iii)根据其目的和功能定义的蛋白质，尤其是治疗性蛋白质，更优选用于矫正遗传病症的治疗性蛋白质(例如，肌营养不良蛋白、CFTR、人类因子IX)；抗癌的治疗性蛋白质，例如细胞因子、抗癌基因、抗体(尤其是阻断抗体)、抗肿瘤抑制因子或毒素；具有抗病毒活性的治疗性蛋白，特别是诸如VEGF、FGF或HGF的治疗性生长因子；或用于免疫治疗的治疗性蛋白，其中如此定义的蛋白质包括特别是超过50个氨基酸残基的肽或多肽，并且其中所述蛋白质可以是人蛋白质，尤其是当其是治疗性蛋白质时，更优选是用于矫正遗传病症的治疗性蛋白质、抗癌的治疗性蛋白质(例如细胞因子、抗癌基因、抗体，尤其是阻断抗体、抗肿瘤抑制因子或毒素)、具有抗病毒活性的治疗性蛋白或用于免疫治疗的治疗性蛋白；或报告蛋白，如荧光蛋白(例如GFP)、发光蛋白(例如荧光素酶)或β-半乳糖苷酶；或(iv)重编程因子，例如Oct4、SOX2、KLF4或c-MYC，或其组合。

在本发明的特定实施方案中，用于转染的细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、细胞系、原代细胞、贴壁细胞和悬浮细胞。

如本文所定义，术语“贴壁细胞”是指对于生长而言需要固体支撑物的细胞，因此是锚定依赖性的。贴壁细胞的实例包括MRC-5细胞、HeLa细胞、Vero细胞、NIH-3T3细胞、L293细胞、CHO细胞、BHK-21细胞、MCF-7细胞、A549细胞、COS细胞、HEK293细胞、Hep G2细胞、SNN-BE(2)细胞、BAE-1细胞和SH-SY5Y细胞。

如本文所定义，术语“悬浮细胞”是指对于生长而言不需要固体支撑物的细胞，因此是非锚定依赖性的。悬浮细胞的实例包括NSO细胞、U937细胞、Namalawa细胞、HL60细胞、WEHI231细胞、Yac 1细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、K562细胞和U266B1细胞。

在本发明的特定实施方案中，所述组合物还包含选自以下中的化合物：(i)用于共转染的不同的mRNA，(ii)非编码的短RNA，例如向导RNA，尤其是CRISPR向导RNA、microRNA、shRNA或siRNA，以及(iii)允许遗传和生物学调控的非编码的长RNA。

在本发明的特定实施方案中，本文定义的第一mRNA编码例如核酸酶的酶，并与向导RNA共转染。

本发明还涉及化合物的混合物，其中所述化合物包含至少一种中性脂质和选自以下化合物的阳离子脂质，其中所述至少一种中性脂质和所述阳离子脂质适用于将信使RNA(mRNA)转染到细胞中：

在本发明的特定实施方案中，适用于将信使RNA(mRNA)转染到细胞中的所述化合物的混合物包含至少一种中性脂质和选自以下化合物的阳离子脂质：

在本发明的特定实施方案中，所述化合物的混合物中使用的所述至少一种中性脂质如本文所定义，和/或所述阳离子脂质与所述至少一种中性脂质的摩尔比为1:1至1:2，优选为1:1.5。

在包含上述阳离子脂质之一的化合物的混合物的特定实施方案中，所述至少一种中性脂质为DOPE或DPyPE，优选为DPyPE。

本发明还涉及如本文所定义的组合物，其用作针对病毒感染的治疗性或预防性疫苗，或针对癌症的治疗性疫苗。通常，在此方面，所述疫苗通过直接施用，例如全身、肌内、皮内、腹膜内、肿瘤内、口服、局部或皮下施用来递送，并且在所述疫苗中，所述组合物与药学上可接受的载体相结合。换句话说，所述疫苗可以直接注射到体内，尤其是人体内，以诱导细胞和/或体液应答。

根据本发明的特定实施方案，所述组合物因此包含药学上可接受的载体。

如本文所定义，“药学上可接受的载体”是指生理学上可接受的(即，其适用于与宿主(尤其是人)接触的组合物中)且因此是无毒的任何物质或物质的组合。它可以指任何常规类型的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂辅料。

本发明还涉及根据本发明的组合物，其在体内应用中使用以用于基于mRNA的治疗。

本发明还涉及用于体外转染活细胞的方法，所述方法包括将根据本发明的组合物引入所述细胞中。

本发明还涉及根据本发明的组合物将所述组合物的mRNA转染到细胞中的用途，所述细胞优选哺乳动物细胞、尤其是人细胞)、昆虫细胞。用于转染的靶细胞可以是细胞系、原代细胞、贴壁细胞或悬浮细胞。

本发明还涉及根据本发明的组合物用于细胞重编程、特别是用于将分化的细胞重编程为诱导多能干细胞(iPC)、或用于分化细胞、用于基因编辑或基因组工程的用途。这样的用途可以在体外或离体细胞培养物中进行，用于制备生物制品，用于制备用于治疗目的的细胞，或用于研究细胞功能或行为，特别是在细胞转染后进行细胞扩增的步骤的情况下；或可以在有需要的宿主中为了治疗目的体内进行。

本发明还涉及根据本发明的组合物在制备编码蛋白质、特别是重组蛋白质或抗体的生物制品中的用途，或在制备重组病毒中的用途，其中所述组合物还包含不同的mRNA或长RNA。

根据本文提供的公开内容，根据本发明的组合物可以用作所述mRNA以及所述阳离子脂质和所述中性脂质的制剂，特别是用作脂质体制剂。或者，其可以作为细胞培养物或扩增的细胞使用，其中在作为培养物和/或作为扩增的细胞提供之前，分离的细胞已经根据本文提供的公开内容用所述mRNA以及所述阳离子脂质和所述中性脂质的制剂、尤其是作为脂质体制剂处理，以进行转染。除非另有说明，作为一个实施方案，本发明的组合物包括细胞、细胞培养物或扩增的细胞，其中根据本发明，已经通过转染引入了所述mRNA、阳离子脂质和中性脂质的制剂。所述细胞尤其是哺乳动物细胞，优选人细胞。

从下面的实施例中，本发明的其他特征和优点将是显而易见的，并且还会在附图中加以说明。

附图简要说明

图1.基于咪唑的阳离子脂质的化学结构。

图2.显示通过对阳离子脂质体制剂W21.7/DPyPE的动态光散射(DLS)进行的粒径和动电位测量的图。将含有1mM化合物W21.7和1.5mM DPyPE辅助脂质的1mL阳离子脂质体制剂用10％乙醇水溶液配制，以用于测定DLS。平均粒径为93.4±11.7nm。该制剂的动电位为+52.8±1.95mV。

图3.显示eGFP mRNA和化合物W9.7对CaCO

图4.凝胶电泳，其显示用阳离子脂质体制剂(化合物W21.7与DPyPE以1:1.5的比例配制)共转染Cas9 mRNA和靶向HRPT-1基因的向导RNA后，HEK293细胞中的基因组编辑。

使用0.3μL(A)和0.4μL(B)的2.5mM阳离子脂质体制剂W21.7/DPyPE(1:1.5)在HEK293细胞中进行Cas9 mRNA和HPRT-1向导RNA的共转染(A,B)。

使用0.3μL(C)和0.4μL(D)的阳离子脂质体制剂W21.7/DPyPE(1:1.5)在HEK293细胞中进行Cas9 mRNA和阴性对照向导RNA的共转染(C,D)。

使用0.3μL(E)和0.4μL(F)的阳离子脂质体制剂W21.7/DPyPE(1:1.5)在HEK293细胞中在无向导RNA的情况下进行Cas9 mRNA的转染(E,F)。

转染2天后，提取基因组DNA并通过PCR扩增靶向的HPRT-1基因座(focus)。在通过T7核酸内切酶I消化后，PCR产物在2％琼脂糖胶上运行并用溴化乙锭染色。测定基因组编辑效率(INDEL％)。

对于条件A和B，INDEL％分别为43.5％和30.0％，而对于其它条件，INDEL％都小于3％。

实施例

实验部分

试剂和化学品

所有用于化学和原料的试剂均从Sigma-Aldrich(法国)购买，未经事先纯化即予以使用。溶剂从SDS-Carlo Erba(法国)订购。将乙醚干燥并在二苯甲酮钠上蒸馏。格氏试剂专用的镁屑购自Fisher Scientific(法国)。1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)购自Fluka(Sigma-Aldrich)。1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPyPE)购自CordenPharma，棕榈酰基亚油酰基磷脂酰乙醇胺(PaLiPE)和二亚油酰基磷脂酰乙醇胺(DiLiPE)购自Avanti Polar Lipids。

脂质体制剂的制备

通过将阳离子脂质(1mM)和辅助脂质(2mM)溶解在2mL乙醇中形成脂质体。然后，将混合物注入18mL水中，用超声处理器Vitracell 500W(Fischer Scientific)在5分钟内以2秒14w的脉冲超声处理该溶液。将在10％乙醇中的脂质体制剂通过0.45μm过滤，并在4℃下储存。

粒径和动电位的测量

如上所述，用10％乙醇水溶液，以1mM两亲物和1.5mM DPyPE制备脂质体制剂。这些脂质体制剂的粒径通过使用Zetamaster(Malvern Instrument，Orsay，法国)通过光散射测定，其技术参数如下：采样时间，30秒；每个样品测量3次；介质粘度，1.0cP；折射率(RI)介质，1.335；RI颗粒，1.47；温度：25℃，激光波长633nm。在图2中所示的粒径测定是在水中具有1mM W21.7和1.5mM DOPE的脂质体制剂获得的(在5℃下储存1个月后脂质体的稳定性)。测量进行一式三份。

细胞培养

在37℃、5％CO

在37℃、5％CO

在37℃、5％CO

在37℃、5％CO

mRNA EGFP转染

将购自TriLink Technologies的mRNA eGFP(996nt,参考号L-6101)用于体外转染实验，并表达增强的绿色荧光蛋白，其是常见的报告基因(eGFP)。该mRNA用帽0加帽，经多聚腺苷酸化并用5-甲基胞苷和假尿苷修饰。

在转染前一天，将Caco-2、THP-1或BJ细胞分别以每孔10000、25000或5000个细胞(96孔板规格)接种在125μL各自的完全培养基中，并在37℃、5％CO

为了进行GFP表达分析，移除贴壁细胞的细胞培养基，并添加50μL胰蛋白酶-EDTA(1x，Lonza)，并将板在37℃下孵育5分钟。加入150μL完全培养基以中和胰蛋白酶，并使用Guava easyCyte 6HT细胞仪(Millipore)通过流式细胞术(Exc 488nm,Em 520nm)分析GFP表达(2000个事件)。

CRISPR Cas9 mRNA转染

HEK293(ECACC 85120602)人胚肾上皮细胞在Eagle MEM培养基中生长，其具有10％FBS并补充了2mM谷氨酰胺、0.1mM NEAA、200U/mL青霉素和200μg/mL霉素。转染前一天，在每孔125μL完全培养基中(96孔板规格)添加12500个细胞，并将板在37℃、5％CO

用于转染实验的CleanCap

将Cas9 mRNA与来自Integrated DNA Technologies(IDT)的CRISPR向导RNA共转染，该CRISPR向导RNA由Alt-R

转染当天，将100ng的CleanCap

转染两天后，移除培养基，并用PBS洗涤细胞。通过向每孔添加50μL的QuickExtract

体内mRNA递送

将CleanCap

为了体内递送，mRNA/阳离子脂质体复合物如下制备：在200μL的5％葡萄糖溶液(终浓度)中稀释1只小鼠所需量的mRNA(5、10或20μg)。将阳离子脂质体溶液添加到mRNA溶液中(比例为2μL/μg mRNA)，混合并在室温下放置至少15分钟。在此阶段，复合物在室温下稳定成果1小时。

所有动物研究均在小鼠临床研究所(CERBM GIE，Illkirch，法国)完成，并根据法国动物护理指南进行，并且实验方案已获得Direction des Services Vétérinaires的批准。从Elevage Janvier获得了6周大的SWISS OF1雌性小鼠。在2秒内通过眶后静脉窦静脉内注射mRNA/阳离子脂质体复合物。注射后24小时，通过腹膜内注射戊巴比妥(40mg/kg，Ceva)麻醉小鼠。解剖感兴趣的器官，将其在PBS(1x)中冲洗，并在Ultra-Thurax均质器中针对脾、肾和心与1mL裂解缓冲液1x(Promega)混合，针对肺和肝与2mL裂解缓冲液1x(Promega)混合。将每个器官混合物在-80℃下冷冻、解冻，并取0.5mL的等分试样用于荧光素酶分析。将等分试样以14,000g离心5分钟。使用100μl荧光素溶液(Promega)针对5μl的器官裂解物上清液评估荧光素酶活性。通过使用光度计(Centro LB960，Berthold)对10秒内的发光(以相对光单位表示，RLU)积分，并表示为每个器官的RLU(每组6只小鼠)。

实施例1.合成W21.7：1-丁基-3-(2,6-二甲基-14-十八烷基三十二烷-9-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

a)合成二醇W21.1：

向100mL 0.5M的十八烷基氯化镁THF溶液(50mmol)中滴加溶解在20mL乙醚中的2.51mL的ε-己内酯(2.58g；22.65mmol；MW＝114.14)。将得到的反应混合物在氩气气氛下于室温搅拌24小时。然后，将反应混合物倒入600mL碎冰中，用浓盐酸酸化1小时。过滤悬浮液中的固体残留物并用水洗涤。将由此获得的固体从丙酮中重结晶并干燥，得到12.2g纯的二醇W21.1(19.58mmol；MW＝623.13，86％收率)。

分析二醇W21.1：

TLC：Rf＝0.25；溶剂：乙酸乙酯-庚烷3:7(V:V)；用香草醛/硫酸检测(Merck TLC板硅胶60F

b)合成烯醇W21.2

将二醇W21.1(12.2g；19.58mmol；MW＝623.13)和对甲苯磺酸一水合物(750mg；3.9mmol；MW＝190.22)溶解在300mL甲苯中。将混合物回流3小时，用Dean-Stark分水器除去水。在减压下移除溶剂，得到粗产物，将粗产物在硅胶上层析(CH

分析烯醇W21.2：

TLC：Rf＝0.35；溶剂：CH

c)合成醇W21.3：

将烯醇异构体的混合物W21.2(10.80g，17.85mmol，MW＝605.12)溶解在300mL乙酸乙酯中，并在1个氢气大气压下通过钯碳(Pd/C 10％，2g)催化氢化24小时。用氩气代替氢气后，将混合物通过

分析醇W21.3：

TLC：Rf＝0.35；溶剂：CH

d)形成醛W21.4：

将醇W21.3(10.10g，16.63mmol，MW＝607.13)溶于300mL CH

分析醛W21.4：

TLC：Rf＝0.35；溶剂：CH

e)合成W21.5:

将醛W21.4(8.08g，13.35mmol，MW＝605.12)溶解在100mL THF中，然后逐滴引入50mL的1M 3,7-二甲基辛基溴化镁在乙醚中的搅拌溶液(50mmol)。将得到的反应混合物在氩气气氛下于室温搅拌24小时。然后，将反应混合物倒入600mL碎冰中，用浓盐酸酸化1小时。然后将该溶液用3x200mL的CH

分析醇W21.5：

TLC：Rf＝0.40；溶剂：CH

f)合成W21.6

将醇W21.5(9.80g；13.11mmol；MW＝747.40)溶于250mL干CH

分析甲磺酸酯W21.6：

g)合成W21.7:

将甲磺酸酯W21.6(9.60g；11.63mmol；MW＝825.49)重悬于40mL的1-丁基咪唑中，并在氩气气氛下于80℃搅拌5天。用400mL甲醇稀释混合物并过滤移除不溶物。将滤液在冰水浴中冷却，用100mL的37％盐酸缓慢酸化并蒸发至干。将残余物重悬于400mL超纯水中并在冰水浴中冷却1小时。通过过滤在滤纸上收集不溶于水中的所需的产物。将所得残余物在硅胶上进一步层析(CH

分析化合物W21.7：

TLC：Rf＝0.45；溶剂：CH

实施例2.合成W20.7：1-丁基-3-(24-十四烷基三十八碳-9-烯-19-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W20.1至W20.7。

分析化合物W20.7：

TLC：Rf＝0.5；溶剂：CH

实施例3.合成W22.7：1-丁基-3-(2,6-二甲基-14-十四烷基二十八烷-9-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W22.1至W22.7。

分析化合物W22.7：

TLC：Rf＝0.45；溶剂：CH

实施例4.合成W23.7：1-丁基-3-(14-(3,7-二甲基辛基)-2,6,17,21-四甲基二十二烷-9-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W23.1至W23.7。

分析化合物W23.7：

TLC：Rf＝0.60；溶剂：CH

实施例5.合成W24.7：3-(2,6-二甲基-14-十八烷基三十二烷-9-基)-1H-咪唑

按照类似于上述(W21.1至W21.6)的程序获得化合物W24.1至W24.6。将咪唑(0.165g；2.42mmol；MW＝68.08)用0.11g氢化钠(在矿物油中，60％)(2.75mmol；MW＝24.00)在20mL沸腾的四氢呋喃中处理1小时。然后加入溶解在20mL四氢呋喃中的1.00g甲磺酸酯W24.6，将混合物回流24小时。然后将反应混合物用水稀释，然后将溶液用3x200mL的CH

分析化合物W24.7：

TLC：Rf＝0.30；溶剂：CH

实施例6.合成W9.7：1-甲基-3-(20-十四烷基三十四烷-15-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W9.1至W9.7。

分析化合物W9.7：

TLC：Rf＝0.25；溶剂：CH

实施例7.合成W10.7：1-甲基-3-(24-十四烷基三十八碳-9-烯-19-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W10.1至W10.7。

分析化合物W10.7：

TLC：Rf＝0.40；溶剂：CH

实施例8.合成W11.7：1-甲基-3-(24-十四烷基三十八烷-19-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W11.1至W11.7。

分析化合物W11.7：

TLC：Rf＝0.50；溶剂：CH

实施例9.合成W12.7：1-甲基-3-(2,6-二甲基-14-十四烷基二十八烷-9-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W12.1至W12.7。

分析化合物W12.7：

TLC：Rf＝0.40；溶剂：CH

实施例10.合成W13.7：1-甲基-3-(24-十八烷基四十二烷-19-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W13.1至W13.7。

分析化合物W13.7：

TLC：Rf＝0.35；溶剂：CH

实施例11.合成W14.7：1-甲基-3-(1-环己基-7-十八烷基二十五烷-2-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W14.1至W14.7。

分析化合物W14.7：

TLC：Rf＝0.40；溶剂：CH

实施例12.合成W15.7：1-甲基-3-(7-十八烷基-1-苯基二十五烷-2-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W15.1至W15.7。

分析化合物W15.7：

TLC：Rf＝0.35；溶剂：CH

实施例13.合成W16.7：1-甲基-3-(2,6-二甲基-14-十八烷基三十二烷-9-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W16.1至W16.7。

分析化合物W16.7：

TLC：Rf＝0.35；溶剂：CH

实施例14.合成W17.7：1-甲基-3-(12-十八烷基三十烷-7-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W17.1至W17.7。

分析化合物W17.7：

TLC：Rf＝0.30；溶剂：CH

实施例15.合成W18.9：1-甲基-3-(15,25-双十四烷基三十九烷-20-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.3，W21.8和W21.9)的程序获得化合物W18.1至W18.3、W18.8和W18.9。

a)合成W18.4

向含有1.50g三聚氯氰(8.13mmol；MW＝184.41)的20mL N,N-二甲基甲酰胺中加入重悬于100mL CH

分析化合物W18.4：

TLC：Rf＝0.90；溶剂：庚烷；用香草醛/硫酸试剂检测(Merck TLC板硅胶60F

b)合成W18.5

向含有1.65g化合物W18.4(3.30mmol；MW＝499.34)的100mL丙酮中加入1g碘化钠(6.67mmol；MW＝149.89)。将混合物在氩气气氛下回流6天。在减压下移除溶剂。将残余物溶于100mL CH

分析化合物W18.5：

TLC：Rf＝0.90；溶剂：庚烷；用香草醛/硫酸试剂和UV检测(Merck TLC板硅胶60F

c)合成W18.6:

将1.84g碘化物W18.5(3.11mmol；MW＝590.79)在10mL乙醚中的溶液滴加到含有0.15g镁屑(6.17mmol；MW＝24.31)的5mL乙醚中，同时加热。回流3小时后，将混合物冷却至室温并滴加0.1mL甲酸乙酯(1.24mmol；MW＝74.08)。4小时后，将混合物倒入100mL碎冰中，用浓盐酸酸化1小时。将悬浮液中的残余物过滤出并用水清洗，然后在硅胶上进一步层析(CH

d)分析化合物W18.6：

TLC：Rf＝0.30；溶剂：庚烷；用香草醛/硫酸试剂检测(Merck TLC板硅胶60F

分析化合物W18.9：

TLC：Rf＝0.45；溶剂：CH

实施例16.合成W19.7：1-甲基-3-(15-(十八烷基铵基)二十五烷-11-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

a)合成W19.1

向含有5mL戊二酰氯(39.17mmol；MW＝169.01)的100mL CH

分析化合物W19.1：

TLC：Rf＝0.45；溶剂：CH

b)合成W19.2

向含有6.00g化合物W19.1(15.76mmol；MW＝380.65)的250mL四氢呋喃中加入2.40g硼氢化钠(63.42mmol；MW＝37.83)。在室温下3小时后，在减压下除去溶剂。将残留物重悬在乙酸乙酯中，并过滤除去不溶物。将有机层用水清洗，经无水硫酸钠干燥并蒸发至干。将所得残余物在硅胶上进一步层析(CH

分析化合物W19.2：

TLC：Rf＝0.60；溶剂：CH

c)合成W19.3

向含有0.88g化合物W19.2(2.30mmol；MW＝382.66)的50mL四氢呋喃中加入0.68g十八胺(2.52mmol；MW＝269.51)和0.132mL乙酸(2.30mmol；MW＝60.05)。在室温下1小时后，加入含有0.087g硼氢化钠(2.30mmol；MW＝37.83)的5mL水。将混合物蒸发至干，并将残余物在硅胶上进一步层析(CH

分析化合物W19.3：

TLC：Rf＝0.50；溶剂：CH

d)合成W19.4

向含有0.48g化合物W19.3(0.75mmol；MW＝636.17)的30mL CH

分析化合物W19.4：

TLC：Rf＝0.25；溶剂：CH

按照类似于上述(W21.6至W21.7)的程序获得化合物W19.5至W19.6。

e)合成W19.7

用1mL三氟乙酸(13.06mmol；MW＝114.02)处理0.10g化合物W19.6(0.12mmol；MW＝836.84)。在室温下1小时后，将混合物蒸发至干。将残余物溶解在2mL甲醇和0.5mL 37％盐酸中，并将混合物蒸发至干。将残余物在硅胶上进一步层析(CH

分析化合物W19.7：

TLC：Rf＝0.35；溶剂：CH

实施例17.合成W25.7：1-(2-羟基乙基)-3-(24-十四烷基三十八烷-19-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W25.1至W25.7。

分析化合物W25.7：

TLC：Rf＝0.25；溶剂：CH

实施例18.合成W26.7：1-(2-羟基乙基)-3-(20-十四烷基三十四烷-15-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W26.1至W26.7。

分析化合物W26.7：

TLC：Rf＝0.25；溶剂：CH

实施例19.合成W27.7：1-乙基-3-(24-十四烷基三十八碳-9-烯-19-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W27.1至W27.7。

分析化合物W27.7：

TLC：Rf＝0.4；溶剂：CH

实施例20.合成W28.7：1-甲基-3-(15-十四烷基三十七烷-19-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.7)的程序获得化合物W28.1至W28.7。

分析化合物W28.7：

TLC：Rf＝0.4；溶剂：CH

实施例21.合成W29.5：1-甲基-3-(4-十六烷基二十烷基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(W21.1至W21.3，以及W21.5至W21.7)的程序获得化合物W29.1至W29.5。

分析化合物W29.5：

TLC：Rf＝0.43；溶剂：CH

实施例22.合成W8.7：1-甲基-3-(三十六碳-8,27-二烯-18-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

a)合成酰胺W8.1：

向3mL吡啶(2.93g；37.09mmol；MW＝79.10)和1.80g N,O-二甲基羟胺盐酸盐(19.48mmol；MW＝97.54)在50mL CH

分析化合物W8.1：

TLC：Rf＝0.3；溶剂：CH

b)合成醛W8.2：

向1g酰胺W8.1(3.07mmol；MW＝325.53)在20mL CH

分析化合物W8.2：

TLC：Rf＝0.3；溶剂：CH

c)合成氯化物W8.3：

向3.78g三聚氯氰(20.50mmol；MW＝184.41)在10mL二甲基甲酰胺中的溶液加入5g油醇(18.62mmol；MW＝268.48)在50mL CH

分析氯化物W8.3：

d)合成碘化物W8.4：

向3.00g氯化物W8.3(10.46mmol；MW＝286.92)在100mL丙酮中的溶液中加入3.14g碘化钠(20.95mmol；MW＝149.89)。将混合物在4天内回流。通过过滤移除不溶物后，除去溶剂，将粗产物在硅胶(环己烷)上进行层析，得到3.76克碘化物W8.4(9.94摩尔；MW＝378.37；95％收率)。

分析碘化物W8.4：

e)合成醇W8.5：

将1.10g碘化物W8.4(2.91mmol；MW＝378.37)在5mL乙醚中的溶液滴加到含有0.10g镁屑(4.11mmol；MW＝24.31)的5mL乙醚中，同时加热。回流2小时后，将混合物冷却至室温并滴加含有0.50g醛W8.2(1.88mmol；MW＝266.46)的10mL乙醚。4小时后，将混合物倒入100mL碎冰中，用浓盐酸酸化1小时。在用乙酸乙酯萃取并移除溶剂后，将粗产物在硅胶上层析(CH

分析醇W8.5：

TLC：Rf＝0.15；溶剂：CH

f)合成甲磺酸酯W8.6

将醇W8.5(0.27g；0.52mmol；MW＝518.94)溶于15mL干CH

分析甲磺酸酯W8.6：

g)合成化合物W8.7

将甲磺酸酯W8.6(0.26g；0.44mmol；MW＝597.03)溶于10mL的1-甲基咪唑中，并在氩气气氛下于80℃搅拌5天。将混合物在高真空下蒸发至干，然后将残余物溶解在20mL甲醇中，并加入10mL的3M盐酸。在移除溶剂后，将粗产物在硅胶上层析(CH

分析化合物W8.7：

TLC：Rf＝0.25；溶剂：CH

实施例23.合成W2.5：1-甲基-3-(三十七碳-9,28-二烯-19-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(分别为W8.1、W8.5、W19.2、W21.6和W21.7)的程序获得化合物W2.1至W2.5。

分析化合物W2.5：

TLC：Rf＝0.25；溶剂：CH

实施例24.合成W3.5：1-甲基-3-(三十六碳-8-烯-18-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(分别为W8.1、W8.5、W19.2、W21.6和W21.7)的程序获得化合物W3.1至W3.5。

分析化合物W3.5：

TLC：Rf＝0.25；溶剂：CH

实施例25.合成W4.3：1-甲基-3-(二十九烷-15-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(分别为W21.1、W21.6和W21.7)的程序获得化合物W4.1至W4.3。

分析化合物W4.3：

实施例26.合成W5.3：1-甲基-3-(三十三烷-17-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(分别为W21.1、W21.6和W21.7)的程序获得化合物W5.1至W5.3。

分析化合物W5.3：

实施例27.合成W7.4：1-甲基-3-(2-十七烷基二十烷基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

a)合成化合物W7.1

向二异丙基氨基锂(3.59g；33.51mmol；MW＝107.12)在100mL四氢呋喃中的溶液(在冰水浴中冷却)中，滴加含有10g十九烷酸(33.50mmol；MW＝298.50)在100mL四氢呋喃中的溶液。然后加入4.8mL的1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(39.70mmol；MW＝128.17)。使反应混合物在室温下放置30分钟。然后将混合物在-10℃下冷却，并滴加含有12.74g 1-碘代十八烷(33.50mmol；MW＝380.39)的80mL四氢呋喃。在室温下放置24小时后，将混合物倒入400mL碎冰中，用150mL浓盐酸酸化1小时。用乙酸乙酯萃取并移除溶剂后，将粗产物在硅胶上层析(CH

分析化合物W7.1：

TLC：Rf＝0.20；溶剂：CH

b)合成化合物W7.2

向4.50g化合物W7.1(8.17mmol；MW＝550.98)100mL四氢呋喃中的溶液(在冰水浴中冷却)中滴加64mL的1M硼烷四氢呋喃复合物四氢呋喃溶液(64mmol；MW＝85.94)。在室温下放置24小时后，将混合物倒入400mL甲醇中，并在减压下移除溶剂。将残余物在硅胶上层析(CH

分析化合物W7.2：

TLC：Rf＝0.50；溶剂：CH

c)合成化合物W7.3和W7.4

按照类似于上述(W21.6至W21.7)的程序获得化合物W7.3至W7.4。

分析化合物W7.4：

实施例28.合成W1.4：1-甲基-3-(三十七碳-9,28-二烯-19-基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(分别为W18.6、W18.7、W21.6和W21.7)的程序获得化合物W1.1至W1.4。

分析化合物W1.4：

TLC：Rf＝0.50；溶剂：CH

实施例29.合成W6.3：1-甲基-3-(二十九烷-11-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物

按照类似于上述(分别为W21.1、W21.6和W21.7)的程序获得化合物W6.1至W6.3。

分析化合物W6.3：

实施例30.mRNA EGFP转染

评估所有这些新的脂质体制剂(表1)以递送表达作为报告基因的增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的mRNA，以便测定基因表达和转染效率(表2)。在转染测定中，使用5’-端用帽0加帽、3’-端多聚腺苷酸化以及用5-甲基胞苷和假尿苷修饰的eGFP mRNA。如实验部分中所述进行转染测定，其中，在5％葡萄糖溶液中将150ng mRNA eGFP与1μL的1mM阳离子脂质体制剂复合，然后添加到细胞上。转染一天后，通过流式细胞术分析eGFP表达以测定转染百分比。在该测定中使用四种不同的细胞系，从易转染细胞到具有质粒DNA的难转染细胞，分别包括人BJ皮肤成纤维细胞、THP-1人外周血单核细胞、Caco-2人结肠上皮细胞和JurkatClone E6-1人T淋巴母细胞。

在缺乏烷基连接基(CH

在存在烷基连接基(CH

在存在烷基连接基(CH

在咪唑鎓脂质结构中引入其他变化，比如R

许多化合物是用不同的辅助脂质配制的，主要是DOPE或DPyPE，其对转染活性没有显著影响。然而，辅助脂质的选择可能会干扰在特定细胞类型中的转染活性。这在图3中用化合物W9做了举例说明，化合物W9与不同的辅助脂质一起配制，包括DOPE、DPyPE、PaLIPE或DiLiPE。用eGFP mRNA转染CaCo2细胞，发现以DPyPE作为W9的辅助脂质，转染一天后的GFP表达最佳。发现以DPyPE作为辅助脂质的大多数受试化合物的制剂在转染四种受试细胞系方面最佳。

表1.基于咪唑和咪唑鎓的化合物的化学结构

表2：由阳离子脂质体制剂介导的各种细胞系中eGFP mRNA的转染效率。

使用与表2中所用条件相同的条件，本发明人还测试了由包含化合物MONI(1-甲基-3-(1-十八烷基-十九烷基)-3H-咪唑-1-鎓氯化物)与中性脂质DOPE(比率为1:2)的制剂所介导的eGFP mRNA的转染效率，美国专利US8399422中公开了化合物MONI。

该制剂能够有效转染BJ细胞(50-60％GFP阳性细胞)和THP-1细胞(30-40％GFP阳性细胞)，并且在Jurkat和CaCo2细胞中显示低转染活性(5-10％)。

实施例31.mRNA转染对比DNA转染

使用质粒pCMV-GFP进行比较试验。该质粒具有CMV启动子和绿色荧光蛋白序列，其可以测量被转染的细胞百分比。该转染以下述方式进行：使用

表3.mRNA转染对比DNA转染

结论

结果表明，使用阳离子脂质1-丁基-3-(2,6-二甲基-14-十八烷基三十二烷-9-基)-1H-咪唑-3-鎓氯化物W21.7和中性磷脂DPyPE的制剂转染mRNA比使用已知的转染剂

实施例32.通过动态光散射(DLS)测量粒径和动电位

在10％乙醇水溶液中，基于阳离子咪唑鎓的脂质体与中性辅助脂质以1:1.5-2(mM阳离子脂质:mM辅助脂质)的比率配制。所形成的脂质体通过DLS测得的平均尺寸接近100nm，如化合物W21.7/DPyPE(比率1:1.5)的制剂所例证的，其平均尺寸为93.4+/-11.7nm，如图2中所示。这些制剂也带正电，因为动电位接近+50mV，如化合物W21.7/DPyPE(比率1:1.5)的制剂所例证的。这些尺寸和电荷使得所述制剂适合体外使用以及直接给药。

实施例33.基因编辑

基因编辑实验

使用CRISPR-Cas9技术在靶向基因中引入缺失。Cas9蛋白通过转染编码Cas9蛋白的mRNA而引入。在该实验中使用了来自Integrated DNA Technologies(IDT)的市售Alt-R

CRISPR向导RNA通过络合HPRT-1或阴性对照crRNA和tracrRNA而结合，并添加Cas9mRNA。然后，将与辅助脂质DPyPE一起配制(比率1:2)的化合物W21.7用于在HEK293人胚肾上皮细胞中共转染向导RNA和cas9 mRNA。48小时后，提取基因组DNA，并使用HPRT-1特异性引物进行PCR。通过T7核酸内切酶测定分析基因组编辑事件，并将其在琼脂糖凝胶上可视化，使用溴化乙锭染色定量，以测定％INDEL(插入/缺失CRISPR事件的百分比)。Cas9 mRNA(图4，条件A和B)和HPRT-1向导RNA的共转染显示在凝胶上存在两个预期的条带，为256bp和827bp。在条件A和B下，％INDEL分别为43.5％和30.0％。显示出共转染的特异性，因为在转染Cas9 mRNA和阴性对照向导RNA(条件B和C)后或在单独转染Cas9 mRNA(条件E和F)后，观察到裂解条带的特异性信号。实验表明，用于转染的制剂有效诱导CRISRP Cas9基因组修饰，而不会产生脱靶事件。

实施例34.体内mRNA递送

基于mRNA的基因转移正成为很有前途的治疗方法，其使用许多方法，例如免疫疗法、遗传疫苗接种、遗传病症的矫正或基因组编辑。

编码萤火虫荧光素酶基因的mRNA用作报告基因。该Luc mRNA(CleanCap

表4.通过对小鼠全身注射，由阳离子脂质体制剂W21.7/DPyPE(比率1:1.5)介导的体内mRNA递送。

通过眶后静脉窦静脉内注射具有各种mRNA量(每次注射5、10或20μg)的Luc mRNA/阳离子脂质体复合物。注射一天后测定多个提取的器官中荧光素酶的表达水平。每个条件下注射6只小鼠。

在脾中发现了高荧光素酶表达，其次是在肺和肝中的表达，在其他测试器官(胰腺、肾、心)中发现了非常低的水平。10和20μg的mRNA注射量提供了相似的表达谱和水平。注射5μg mRNA后，荧光素酶活性降低，但在脾中仍然很显著。

通过将阳离子脂质和辅助DPyPE脂质的比例从1:1变为1:2进行另一实验(表5)。将20ug mRNA用这些脂质体制剂配制并给每只小鼠注射。在1:1.5的比率下发现了最佳的荧光素酶表达，具有与在先前的体内实验中所观察到的相类似的谱表达。阳离子脂质也以1:1.5的比例与辅助脂质DOPE一起配制，并且该制剂显示出与具有DPyPE且比例同样为1:1.5的制剂相似的荧光素酶表达水平和谱(脾脏、肝脏和肺)。

表5.对小鼠全身注射后，阳离子脂质与辅助脂质的比率对体内mRNA递送的影响。

虽然已经根据各种优选实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员会明白可在不脱离本发明范围的情况下进行各种修改、替换、省略和改变。因此，本发明的范围旨在由以下权利要求的范围限制，包括其等同。

参考文献

Chiper M,Tounsi N,Kole R,Kichler A,Zuber G.Self-aggregating 1.8kDapolyethylenimines with dissolution switch at endosomal acidic pH are deliverycarriers for plasmid DNA,mRNA,siRNA and exon-skippingoligonucleotides.Journal of controlled release:official journal of theControlled Release Society 2017；246:60-70.

De Haes W,Rejman J,Pollard C,Merlin C,Vekemans M,Florence E,etal.Lipoplexes carrying mRNA encoding Gag protein modulate dendritic cells tostimulate HIV-specific immune responses.Nanomedicine(Lond)2013；8:77-87.

Doudna JA,Charpentier E.Genome editing.The new frontier of genomeengineering with CRISPR-Cas9.Science 2014；346:1258096.

Drews K,Tavernier G,Demeester J,Lehrach H,De Smedt SC,Rejman J,etal.The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.Biomaterials 2012；33:4059-68.

Goncalves C,Akhter S,Pichon C,Midoux P.Intracellular Availability ofpDNA and mRNA after Transfection:A Comparative Study among Polyplexes,Lipoplexes,and Lipopolyplexes.Molecular pharmaceutics 2016；13:3153-63.

Goncalves C,Berchel M,Gosselin MP,Malard V,Cheradame H,Jaffres PA,etal.Lipopolyplexes comprising imidazole/imidazolium lipophosphoramidate,histidinylated polyethyleneimine and siRNA as efficient formulation for siRNAtransfection.International journal of pharmaceutics 2014；460:264-72.

Heil F,Hemmi H,Hochrein H,Ampenberger F,Kirschning C,Akira S,etal.Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor7 and 8.Science 2004；303:1526-9.

Jarzebinska A,Pasewald T,Lambrecht J,Mykhaylyk O,Kummerling L,Beck P,et al.A Single Methylene Group in Oligoalkylamine-Based Cationic Polymers andLipids Promotes Enhanced mRNA Delivery.Angew Chem Int Ed Engl 2016；55:9591-5.

Kaczmarek JC,Kowalski PS,Anderson DG.Advances in the delivery of RNAtherapeutics:from concept to clinical reality.Genome medicine 2017；9:60.

Kariko K,Buckstein M,Ni H,Weissman D.Suppression of RNA recognitionby Toll-like receptors:the impact of nucleoside modification and theevolutionary origin of RNA.Immunity 2005；23:165-75.

Kariko K,Muramatsu H,Keller JM,Weissman D.Increased erythropoiesis inmice injected with submicrogram quantities of pseudouridine-containing mRNAencoding erythropoietin.Molecular therapy:the journal of the American Societyof Gene Therapy 2012；20:948-53.

Kariko K,Muramatsu H,Ludwig J,Weissman D.Generating the optimal mRNAfor therapy:HPLC purification eliminates immune activation and improvestranslation of nucleoside-modified,protein-encoding mRNA.Nucleic acidsresearch 2011；39:e142.

Kariko K,Ni H,Capodici J,Lamphier M,Weissman D.mRNA is an endogenousligand for Toll-like receptor 3.The Journal of biological chemistry 2004；279:12542-50.

Kormann MS,Hasenpusch G,Aneja MK,Nica G,Flemmer AW,Herber-Jonat S,etal.Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modifiedmRNA in mice.Nature biotechnology 2011；29:154-7.

Lv P,Zhou C,Zhao Y,Liao X,Yang B.Modified-epsilon-polylysine-grafted-PEI-beta-cyclodextrin supramolecular carrier for gene delivery.Carbohydratepolymers 2017；168:103-11.

Malone RW,Felgner PL,Verma IM.Cationic liposome-mediated RNAtransfection.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 1989；86:6077-81.

Ran FA,Hsu PD,Lin CY,Gootenberg JS,Konermann S,Trevino AE,etal.Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editingspecificity.Cell 2013；154:1380-9.

Ran FA,Hsu PD,Wright J,Agarwala V,Scott DA,Zhang F.Genome engineeringusing the CRISPR-Cas9 system.Nature protocols 2013；8:2281-308.

Rejman J,Tavernier G,Bavarsad N,Demeester J,De Smedt SC.mRNAtransfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated bycationic carriers.Journal of controlled release:official journal of theControlled Release Society 2010；147:385-91.

Tavernier G,Andries O,Demeester J,Sanders NN,De Smedt SC,RejmanJ.mRNA as gene therapeutic:how to control protein expression.Journal ofcontrolled release:official journal of the Controlled Release Society 2011；150:238-47.

Warren L,Manos PD,Ahfeldt T,Loh YH,Li H,Lau F,et al.Highly efficientreprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cellswith synthetic modified mRNA.Cell stem cell 2010；7:618-30.

Yamamoto A,Kormann M,Rosenecker J,Rudolph C.Current prospects formRNA gene delivery.European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics:official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische VerfahrenstechnikeV 2009；71:484-9.

Yoshioka N,Gros E,Li HR,Kumar S,Deacon DC,Maron C,et al.Efficientgeneration of human iPSCs by a synthetic self-replicative RNA.Cell stem cell2013；13:246-54.

Zhao M,Li M,Zhang Z,Gong T,Sun X.Induction of HIV-1 gag specificimmune responses by cationic micelles mediated delivery of gag mRNA.Drugdelivery 2016；23:2596-607.