马甲子或其提取物在制备盖髓材料中的用途

摘要

本发明公开了马甲子或其提取物在制备盖髓材料中的用途，属于医药领域，以马甲子鲜品或干品粉碎品或马甲子提取物为活性成分作为盖髓材料，具有稳定持久抗炎性并且可以促进硬组织形成，提高牙髓修复能力，效果明显，且优于临床常用对照药物，可有效解决现有盖髓材料抗炎性能差，无法用于轻度炎症牙髓直接盖髓的技术问题。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及到马甲子或其提取物在制备盖髓材料中的用途。

背景技术

马甲子(Paliurus ramosissimus(Lour.)Poir)为落叶灌木，系鼠李科(Rhamnaceae)，又名铁篱笆、铜钱树，是一种常见药用植物。据报道枝叶根花果均药用，性味苦、平，无毒，能除寒活血，发表解热，消肿，治跌打损伤及心腹疼痛。但尚未见马甲子或其提取物可用于轻度炎症牙髓的盖髓治疗的报道。

龋源性穿髓、机械性穿髓和外伤性穿髓都会导致活髓暴露，直接盖髓术是直接使用盖髓材料覆盖于已暴露的牙髓创面上，促进保护性屏障的形成，以达到保存牙髓活力的目的。通常直接盖髓术适用于根尖孔尚未发育完全，因机械性或外伤性露髓的年轻恒牙，或根尖已发育完全，机械性或外伤性露髓且穿髓孔直径不超过0.5mm的恒牙。美国牙髓病协会(AAE)对直接盖髓术的适应征的第一条便是“无牙髓临床症状的活髓牙发生的机械性的牙髓暴露”。对于牙髓有轻度炎症的患牙，或者患者已经有早期牙髓炎临床表现的患牙，临床上多采取牙髓摘除术后行根管治疗、根尖屏障术、根尖诱导、血运重建等治疗。然而，根管治疗后的牙齿牙体组织薄弱、易折断，而且由于没有牙髓，牙齿丧失了感觉功能；对于年轻恒牙的根尖屏障术不能增加牙根的长度，根尖诱导不能恢复牙髓的感觉功能，血运重建虽能使患牙部分恢复感觉功能，但其并没有形成正常有序排列的牙髓组织。因此，针对轻度炎症的患牙进行活髓保存治疗十分有意义。

牙髓存在轻度炎症进行直接盖髓治疗时，我们选择的盖髓材料应当具有两条关键的必要条件：其一便是必须具有有效的消炎作用，长期存在炎症会导致牙髓钙化或牙内吸收，甚至加重不可逆的牙髓炎症从而导致根尖周炎；其二，盖髓材料需要能促进形成硬组织屏障，严密封闭牙髓暴露区域，避免微渗漏造成牙髓组织再感染。1921年，氢氧化钙作为盖髓剂被使用于直接盖髓术，由于其良好的性能几十年以来一直被作为“金标准”，氢氧化钙盖髓后，初始的高pH值可中和炎性组织中的酸，刺激成纤维细胞和酶系统，杀灭牙髓创面上残存的感染物，促进牙髓组织的防御和修复功能；1998年，三氧化矿物聚合体(MTA)获美国FDA许可应用于临床，MTA置于创面后，不受周围组织液或血液的影响，可缓慢地释放钙离子，产生的氢氧化钙和水合硅酸钙形成高pH环境，可诱导细胞聚集，促进矿化细胞因子表达，实现牙本质的修复，其良好的密闭性、生物相容性、诱导成骨性和X线阻射性以及强碱性颇受口腔临床工作者的青睐，已广泛地使用于直接盖髓术中。近年来也涌现出了许多新的优秀的盖髓材料，如Bio-Dentin，Bio-Aggregate，iRoot BP等，也有许多在直接盖髓中参与辅助的药物或方法如激素、抗生素、激光等，同时仍有许多的新型盖髓材料正在开发研究当中。

发明内容

本发明的目的是提供马甲子或其提取物作为盖髓材料的新用途，可有效解决现有盖髓材料抗炎性能差，无法用于轻度炎症牙髓直接盖髓的技术问题。

应用时，马甲子采用马甲子全株植物或其中任一部位的鲜品或干品；其中，药用部位可为根、茎、叶、花和果中任一部位或其混合；最优选的部位为叶。

应用时，马甲子提取物是以马甲子全株植物或其中任一部位为原料，采用常规提取方法制备而得。本发明所得马甲子提取物主要成分包括黄酮类、萜类、生物碱类、香豆素类；进一步还包括上述黄酮、萜、生物碱、香豆素的苷及其单体成分；还包括多糖类和纤维素。

本发明马甲子的粉碎品的制备方法如下：以马甲子全株植物或其中任一部位鲜品或干品为原料药，经粉碎机粉碎，过筛，即得马甲子粉碎品。

本发明马甲子提取物的制备方法如下：以马甲子全株植物或其中任一部位鲜品或干品为原料药，经粉碎机粉碎，过筛，得马甲子粉碎品；再将马甲子粉碎品以水或有机溶剂提取、干燥、即得马甲子提取物。

进一步地，本发明马甲子提取物的制备方法中的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯或石油醚，优选乙醇。

本发明还提供一种盖髓剂，包括马甲子或其提取物。

本发明的有益效果：本发明提供马甲子或其提取物在盖髓材料中的新用途，以马甲子鲜品或干品粉碎品或马甲子提取物为活性成分作为盖髓材料，具有稳定持久抗炎性并且可以促进硬组织形成，提高牙髓修复能力，效果明显，且优于临床常用对照药物，可有效解决现有盖髓材料抗炎性能差，无法用于轻度炎症牙髓直接盖髓的技术问题。

附图说明

图1为本发明实施例1中P.g-LPS刺激不同时间HDPCs炎症相关因子mRNA表达结果图；

图2为本发明实施例1中不同浓度梯度的马甲子提取物用于培养HDPCs的细胞生长曲线图；

图3为本发明实施例1中炎症环境下各组HDPCs的炎性相关细胞因子蛋白表达量结果图；

图4为本发明实施例1中炎症环境下各组HDPCs的炎性相关细胞因子mRNA表达量结果图。

具体实施方式

以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。

实施例1

本实施例1的技术方案如下：

一、马甲子盖髓材料的制备

马甲子提取物溶液配制过程如下：

步骤(1)：马甲子提取物、二甲基亚砜和细胞培养液按照250μg：10μl：1ml的比例分别称量取出；

步骤(2)：在离心管中，将马甲子提取物与二甲基亚砜溶液混合，振荡器振荡6min，使得马甲子提取物溶解于二甲基亚砜溶液中；

步骤(3)：在步骤(2)所得二甲基亚砜溶液中加入步骤(1)取出的细胞培养液，振荡器振荡20min，使管内各组分溶解，得到混合溶液；

步骤(4)：无菌超净台下使用细菌滤器(0.22μm)过滤步骤(3)中所得混合溶液，即得到无菌的马甲子提取物的细胞培养液，溶液浓度为250mg/ml，并稀释为125μg/ml、62.5μg/ml备用，于4℃冰箱中保存；

其中，步骤(1)中马甲子提取物为马甲子乙醇提取物或马甲子乙酸乙酯提取物；且由四川省中医药科学院提供(批号：20170823)，植株采自四川省成都市牧马山，是以马甲子全株植物为原料，采用常规提取方法制备而得，经鉴定主要成分包括黄酮类、萜类、生物碱类、香豆素类；进一步还包括上述黄酮、萜、生物碱、香豆素的苷及其单体成分；还包括多糖类和纤维素。

二、马甲子提取物对体外牙髓细胞炎症的影响

(1)人牙髓细胞收集与培养

经患者知情同意后，取材于四川大学华西口腔医学院牙槽外科门诊拔除的符合收集牙髓组织标准的年轻第三磨牙，以改良组织块法培养牙髓原代细胞。配制含质量分数为10％胎牛血清、质量分数为1％青霉素链霉素双抗溶液的DMEM培养基，在体积分数为5％CO

(2)建立体外人牙髓细胞炎症模型

取(1)中培养所得的P4或P5代的人牙髓细胞(HDPCs)按1*10

P.g-LPS刺激不同时间HDPCs的炎症相关因子mRNA水平的表达情况，结果如图1所示，通过使用P.g-LPS刺激HDPCs 3h，能够显著诱导IL-1β，IL-6及TNF-α炎症相关细胞因子基因mRNA的表达，并且表达水平达高峰期。本实验选取P.g-LPS刺激HDPCs 3h，成功构建体外牙髓细胞炎症模型，用于后续马甲子提取物抗炎性能的实验研究；其中，图1中*,**,***表示该组与不加入LPS(脂多糖)的对照组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；ns表示该组与不加入LPS的对照组比较，差异无统计学意义。

(3)马甲子提取物对HDPCs生长的影响

取培养所得的P4或P5代HDPCs按1*10

不同浓度梯度的马甲子提取物培养HDPCs的细胞生长曲线，结果如图2所示，通过测量各分组在各时间点的吸光度计算各组细胞活力相对值所绘制的各组5天内的HDPCs生长曲线可见，1％DMSO对细胞生长曲线无明显影响；125μg/ml和62.5μg/ml浓度的马甲子提取物能保证细胞处于较好的生长增殖状态。

(4)马甲子提取物对HDPCs的炎性因子表达的影响

选取生长状态良好的P4或P5代的HDPCs，以每孔2*10

马甲子提取物对炎症环境下HDPCs的炎性相关细胞因子mRNA和蛋白表达的影响，结果如图3和图4所示，马甲子乙醇提取物和马甲子乙酸乙酯提取物能下调在P.g-LPS刺激下的HDPCs的IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA的表达，也能抑制P.g-LPS刺激下的HDPCs分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白。两种提取物对炎症因子mRNA和蛋白的表达影响无明显差异。1％DMSO溶剂对炎症HDPCs的相关炎症细胞因子的表达和分泌无显著影响；其中，图3中**,***表示该组与对照组(LPS+)比较，**P<0.01,***P<0.001；ns表示该组与对照组(LPS+)比较，差异无统计学意义；ns’表示马甲子的两种提取物在各细胞因子蛋白表达量相比较，差异无统计学意义；图4中*,**,***表示该组与对照组(LPS+)比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；ns表示该组与对照组(LPS+)比较，差异无统计学意义；ns’表示马甲子的两种提取物在各细胞因子mRNA表达量相比较，差异无统计学意义。

其中，上述实验结果由SPSS 20.0及Graph Pad软件进行统计学分析得到，各实验组与对照组间分别采用独立样本t检验来比较组间差异，以P<0.05判定差异有统计学意义。

综上所述，马甲子提取物在体外可以保证细胞的生长增殖状态，同时抑制LPS诱导的细胞炎症。

实施例2

本实施例2与实施例1的区别仅在于：将实施例1中的马甲子盖髓材料由马甲子提取物替换为马甲子鲜品粉碎品；其中，马甲子鲜品粉碎品的制备方法如下：以马甲子全株植物鲜品1kg为原料药，经粉碎机粉碎，过60目药筛，即得马甲子鲜品粉碎品。

本实施例2所得实验结果与实施例1相符，说明马甲子鲜品粉碎品在体外可以保证细胞的生长增殖状态，同时抑制LPS诱导的细胞炎症。

实施例3

本实施例3与实施例1的区别仅在于：将实施例1中的马甲子盖髓材料由马甲子提取物替换为马甲子干品粉碎品；其中，马甲子干品粉碎品的制备方法如下：以马甲子全株植物鲜品2kg为原料药，干燥，经粉碎机粉碎，过80目药筛，即得马甲子干品粉碎品。

本实施例3所得实验结果与实施例1相符，说明马甲子干品粉碎品在体外可以保证细胞的生长增殖状态，同时抑制LPS诱导的细胞炎症。

实验例1

将实施例1-3所得马甲子盖髓材料与现有的常规盖髓剂三氧化物聚合物(MTA)分别动物体内实验检测使用，具体过程及结果如下：

麻醉下，高速手机(口腔科用于钻牙齿的涡轮机)在SD大鼠第一磨牙合面开髓，暴露牙髓，取本发明盖髓剂和对照物MTA覆盖在暴露的牙髓创面上，玻璃离子封闭窝洞。将本发明提出的盖髓剂和现有盖髓剂随机使用后：

综上比较后得出，马甲子或其提取物在盖髓材料中的新用途，本发明提供了马甲子或其提取物在盖髓材料中的新用途，用于轻度炎症牙髓的盖髓治疗，具有稳定持久抗炎性并且可以促进硬组织形成，提高牙髓修复能力，效果明显。

以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。