一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法

摘要

本发明公开了一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法，属于食品微生物分析技术领域。该方法包括采集南美白对虾样本分别于不同温度条件下贮藏，均质处理，得到的样本匀浆液进行PMA前处理，提取活菌宏基因组DNA后进行16SrDNA特异引物的PCR扩增，构建克隆文库，用测序平台进行边合成边测序的深度测序，运用生物信息学技术对南美白对虾样本中活菌多样性进行分析。本发明首次提出PMA前处理与高通量测序相结合构建南美白对虾中活菌多样性分析模式，测序周期短、生成数据量大、信息较为全面、准确率高且成本低，解决传统微生物多样性分析技术无法区分死菌和活菌的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法，属于食品微生物分析技术领域。

背景技术

南美白对虾在贮藏期间常受到温度等外在因素的影响产生腐败，出现黑变，发出恶臭、滋生致病菌等品质败坏现象，从而严重影响对虾的对内销售和对外出口贸易。大量研究表明，南美白对虾生产、加工、贮藏及流通过程中，微生物是影响其食品安全的重要因素。因此，构建一种有效、可靠、国际通用的南美白对虾中微生物多样性分析方法，对于提升水产安全、维护公众健康具有十分重要的科研价值和实际意义。

传统基于微生物培养的方法不仅耗时费力，而且无法鉴定自然环境中99％以上的微生物。随着微生物学和分子生物学技术的迅猛发展，以16srDNA为基础的微生物群落多样性分析手段逐渐建立起来，如单链构象多态性(SSCP)、长度多态片段PCR(LH-PCR)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)等。然而，此类方法仍具有通量低和信息量小等缺点，仅能检测到样品中的优势种群，严重制约了在微生物多样性分析中应用。高通量测序技术又称“第二代”测序(NGS)技术，可以切实有效的解决上述难题，具有测序周期短、生成数据量大、信息较为全面、准确率高以及成本低等优点，使其在微生物多样性研究中具有独特的优越性。目前，运用高通量测序分析微生物多样性的技术已经日趋成熟，在人体、水源、土壤、食品等样本中广泛应用。然而，这种技术存在一个极大的缺陷，基于DNA扩增的技术均无法区分样品中的死菌和活菌，从而干扰了微生物多样性分析的准确性。

叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide，PMA)是一种对核酸具有高度亲和力的光敏反应染料，能够进入细菌的死细胞中，选择性地交联死菌的DNA，将其与DNA扩增检测技术相结合，可有效地抑制死菌细胞DNA的扩增。近年来，利用PMA结合实时荧光PCR技术，已经广泛应用于多种食源性致病菌的活菌检测，被认为是目前最为有效的新型活菌检测技术。然而，目前还没有将PMA前处理与高通量测序相结合，进行南美白对虾中活菌多样性分析的研究报道。

发明内容

为解决传统微生物多样性分析技术无法区分死菌和活菌的问题，本发明的目的在于提供一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)采集南美白对虾样本，分别于不同温度条件下贮藏；

(2)将不同贮藏温度的样本分别均质处理，对所得的样本匀浆液进行叠氮溴化丙锭(PMA)前处理；

(3)提取经PMA前处理的样本中活菌宏基因组DNA；

(4)用双标签进行引物对融合后，对提取的活菌宏基因组DNA进行16SrDNA特异引物的PCR扩增，构建克隆文库；

(5)对合格的克隆文库用Illumina Miseq测序平台进行边合成边测序的深度测序；

(6)运用生物信息学技术通过深度测序对南美白对虾样本中活菌多样性进行分析。

一些实施例中，步骤(1)中，所述南美白对虾由采集到贮藏整个过程不超过一个小时，贮藏温度分别为4℃和7℃。

一些实施例中，步骤(2)中，对不同贮藏温度的样本分组取样后，分别置于含有100mL蛋白胨水溶液的均质袋中均质2min，所述分组取样过程如下：4℃共贮藏120h，每24h取样一次；7℃共贮藏96h，每24h取样一次，且每次取样分为两组，一组进行PMA前处理，另一组不进行PMA处理作为对照组，每组共4个样品。

一些实施例中，步骤(2)中，所述南美白对虾样本的匀浆液PMA前处理的过程为：取100μL PMAxx溶解于900μL双蒸水中，得到2mM的PMA溶液，于-20℃避光保存；取25μL上述PMA溶液加入到975μL所述匀浆液中，得到终浓度为50μM的PMA-样品混合液，将该混合液在黑暗条件下静置30min和LED光源下曝光30min后，于13，400×g条件下高速离心10min。

一些实施例中，步骤(3)中，经天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取经PMA前处理的样本中活菌宏基因组DNA，延长溶菌酶和蛋白酶K的处理时间1h和2h。

一些实施例中，步骤(3)中，还包括采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测所述活菌宏基因组DNA的步骤。

一些实施例中，步骤(4)中，所述引物对的序列如下：上游引物为含有P5Illumina接头序列的特异性引物338F，序列为‘5-ACTCCTACGGGAGGCAGGAG-3’；下游引物为含P7Illumina接头序列的特异性引物806R，序列为‘5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

一些实施例中，步骤(7)中，经所述深度测序后纯净成对的序列拼接成TAG，聚类为可操作分类学单元(OTU)，分析样品中活菌微生物多样性、结构和组成。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明首次提出PMA前处理与高通量测序相结合的南美白对虾中活菌多样性分析方法，具有测序周期短、生成数据量大、信息较为全面、准确率高以及成本低等优点，经过PMA前处理的样品与未经处理的相比，微生物多样性分析结果存在明显的差异，证明上述分析方法可以精准分析南美白对虾中的微生物多样性。

(2)本发明中采用虾液匀浆PMA前处理可以选择性地交联死菌的DNA，黑暗条件下静置可使PMA穿透死细胞与死菌的DNA相交联，LED光源曝光可确保PMA与死菌的DNA完全相互交联在一起，克服传统微生物多样性分析技术无法区分死菌和活菌的问题。

(3)本发明的南美白对虾中微生物多样性分析方法有效可靠，国际通用，为水产品中微生物多样性分析提供新的技术思路。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

附图作为本申请的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1为实施例1中不同温度条件下经/未经PAM前处理的南美白对虾样品中微生物群落主成分分析(PCA)图，(a)为低温条件(4、7℃)，(b)为高温条件(15、30℃)。

图2实施例1中南美白对虾中微生物群落结构总样本图。

图3为实施例1中基于PMA活菌前处理结合高通测序获得不同温度贮藏条件下南美白对虾样品微生物多样性Venn图，(a)、(b)、(c)、(d)分别为贮藏温度4、7、15、30℃。

具体实施方式

下面通过具体实例和附图，对本发明的技术方案做进一步的菌体说明。应当理解，以下描述的具体实例仅用于解释文本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

构建南美白对虾中活菌多样性分析模式，具体步骤如下：

(1)南美白对虾的采集和贮藏：采用生鲜南美白对虾样品购自上海市奉贤区最大的南美白对虾养殖基地。采收后南美白对虾低温下挑选并分装于无菌封口采样袋，置于高精度培养箱中进行贮藏，温度设定为常用水产品冷藏温度：4℃和7℃。为了确保生虾中初始微生物多样性不变，对虾样品从采集到贮藏，整个过程不超过一个小时。

(2)南美白对虾的取样与处理：对不同贮藏温度的南美白对虾进行取样分析：4℃条件下共贮藏120h，每24h进行一次取样分析；7℃条件下共贮藏96h，每24h进行一次取样分析。每次取样分为2组，每组共4个样品，置于含有100mL蛋白胨水溶液的均质袋中均质2min，收集虾液均浆。其中一组进行PMA前处理，另一组不加PMA处理，作为对照组。

(3)叠氮溴化丙锭前处理：取100μL PMAxx(Biotium，Hayward，CA，USA)溶解于900μL双蒸水中，得到的2mM的母液，放置-20℃冰箱避光保存。用移液枪量取25μL的PMA溶液加入975μL样品，获得终浓度为50μM的PMA-样品混合液。将样品置于黑暗条件下处理30min，使PMA穿透死细胞并与死菌的DNA相交联。将暗处理之后的样品置于仪器PMA-Lite

(4)活菌宏基因组DNA的提取：对天根细菌基因组DNA提取试剂盒的提取方法进行了修正：延长了溶菌酶的处理时间(1h)和蛋白酶K的处理时间(2h)，提取样本的活菌宏基因组DNA。完成DNA抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。

(5)16SrDNA特异引物的PCR扩增：运用双标签进行引物对的融合，上游引物为含有P5Illumina接头序列的特异性引物338F(‘5-ACTCCTACGGGAGGCAGGAG-3’)，下游引物为含P7Illumina接头序列的特异性引物806R(‘5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，运用PCR技术对活菌宏基因组DNA中16SrDNA的高变区片段进行扩增，以构建克隆文库。

(6)Illumina Miseq平台高通量测序：运用Illumina Miseq测序平台，对合格的文库进行边合成边测序的深度测序，并对边合成边测序的读取序列(READS)进行质量控制。

(7)生物信息学分析：运用生物信息学分析技术，把纯净成对的READS拼接成TAG，然后聚类成可操作分类学单元，分析样品中活菌微生物多样性、结构及组成。

将实施例1构建的南美白对虾中活菌多样性分析模式用于南美白对虾在贮藏期间微生物群落变化监测，以下结合附图和效果例进一步解释说明。

效果例1主成分分析(PCA)

如图1所示，每一个点代表一个样品，以温度和是否采用活菌处理为分组条件，色深且形状相同的点属于同一种分组，两个点之间的距离越近，说明两个样品的微生物群落差异越小。图1(a)为低温(4、7℃)贮藏过程中样品应用与未应用PMA前处理技术的微生物群落主成分分析，采用主成分PC1和次要成分PC2分析，其中PC1的贡献度为36.32％，PC2的贡献度为17.53％，说明两组间差异有统计学意义。相同温度同一贮藏时间点，经过PMA处理的样品与未经处理的样品相距较远，表明两者之间在微生物群落组成中存在差异。此外，同一组样品中每个时间点之间的距离较远，表明采收后南美白对虾样的微生物群落组成随时间的变化而发生改变。图1(b)为主成分PC1(41.62％)和次要成分PC2(23.68％)分析获得较高温度(15，30℃)贮藏过程中样品的微生物群落主成分分析，其结果与低温条件下相反，样品经不经过PMA前处理相距较近，且同一组样品中每个时间点之间在PCA图中相距不远，可见温度越高其微生物群落组成越稳定。

效果例2热图分析

如图2所示，每小格代表其在样品中某个OUT的相对丰度，颜色由白色至黑色反映样品的相对丰度比例由小变大(0-59.34％)。其中，图上方为样品间聚类关系树，反映样本与样本间序列的进化关系，样品序列进化关系相近则处于同一分支上，显示应用PMA处理的一组样品与对应的对照组样品几乎在同一小分支上或邻近分支上，说明PMA处理对微生物群落结构没有显著影响。从贮藏温度角度观察聚类可知同一贮藏温度下的样品大体在一个分支上，而高温样品与低温样品却在一个较大的分支上，说明贮藏温度影响南美白对虾贮藏过程的微生物群落结构。图左侧为物种丰度相似性树，显示同一分支上丰度最相近，主要优势菌Shewanella(希瓦氏菌属)、Exiguobacterium(微杆菌属)、Lactococcus(乳杆菌属)、Kurthia(库特氏菌属)、Aeromonas(气单胞菌属)、Acinetobacter(不动杆菌属)、Vibrio(弧菌属)、Macrococcus(巨型球菌属)等在总样本之间的丰度相似程度均高于3％，甚至高达59.34％。除去上述优势菌之外，高温贮藏条件下样本的微生物群落Photobacterium(发光杆菌属)、Clostridium_sensu_stricto_1(梭菌属)、Peptoclostridium、Plesiomonas(胞菌属)、Terrisporobacter、Bacillus(芽孢杆菌属)、Romboutsia等丰度相似性较高(>0.26)，而低温条件下Candidatus_Bacilloplasma、Planococcus(动性球菌属)、Chryseomicrobium、Enterobacter(肠杆菌属)等丰度相似程度略高。综上可知，是否采用PMA前处理技术对微生物群落结构(微生物种类及丰度)具有一定的影响，但不改变样品中优势菌的种类。此外，温度是影响样品微生物多样性的另一个因素，高温与低温在优势菌及微生物种类的稳定上均存在明显差异，且PMA对低温条件下微生物菌群多样性分析有较好的修正作用，可为食品冷链物流提供良好的技术支持。

效果例3Venn图分析

如图3所示，不同温度条件下PMA前处理技术后不同贮藏阶段的样品OTU分布Venn图，可比较直观地表现各环境样品之间OTU组成的相似程度，各个温度组中样品共有的OTU数量约为30个左右，且不同时间点各样品共同的OTU数目较少。温度越高，随贮藏时间的推移各样品所独有的OTU数量有减少的趋势，表明高温贮藏条件下微生物物种种类没有显著变化。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。