用于碳水化合物材料酶促水解和糖发酵的方法

摘要

本申请涉及一种用于从纤维素材料制备酶组合物的方法。

说明书

技术领域

本申请涉及一种用于制备酶组合物的方法。

背景技术

木质纤维素材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，并提供了用于产生矿物燃料的替代能源的有吸引力的平台。该材料是大量可得的，并且可以转化为有价值的产物，例如糖或生物燃料(例如生物乙醇)。

由木质纤维素材料生产发酵产物是在本领域中已知的，并且通常包括预处理、水解、发酵和任选地回收发酵产物的步骤。

通常，由微生物(如酵母)将所产生的糖转换为有价值的发酵产物，例如乙醇。发酵在相同或不同容器中以单独的，优选厌氧的工艺步骤进行。

通常，在从木质纤维素材料生产发酵产物的整个过程中，酶的生产成本是主要的成本因素。迄今为止，通过施用来自单一或多种微生物源的具有更宽和/或更高的(比)水解活性的酶产物可实现酶生产成本的降低(参见WO 2008/008793)。这导致了较低的酶需求、更快的转换率和/或更高的转换产率，并且因此降低了总生产成本。

除了酶优化之外，过程设计优化也是降低糖产物和发酵产物的总生产成本的关键工具。例如，由于糖降解产物，糖损失随着产率的降低而增加。由于糖降解产物能够抑制发酵，因此应优化过程设计以减少这些糖降解产物的量。

出于经济原因，因此期望引入旨在降低涉及碳水化合物材料的预处理、水解和发酵的过程中的总生产成本的新颖且创新的方法配置。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于制备酶组合物的改进方法。所述方法通过使用特定的水解条件而得到了改进。

具体实施方式

在整个说明书和所附权利要求书中，词语“包括(comprise)”和“包含(nclude)”以及诸如“包括(comprises/comprising)”和“包含(includes/including)”的变形形式将被包含性地解释。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传达可能包括未具体叙述的其他要素或整数。冠词“一(a/an)”或省略冠词的名词在本文中用于指代一个(种)或多于一个(种)(即，一个(种)或至少一个(种))该冠词的语法对象。举例来说，“要素”可以表示一个要素或多于一个要素。

本文描述了一种用于制备酶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)预处理纤维素材料，(b)酶促水解所述经预处理的纤维素材料以获得水解产物，(c)发酵所述水解产物以产生所述酶组合物，以及(d)任选地回收所述酶组合物，其中在步骤(b)之前和/或期间，通过向所述经预处理的纤维素材料中加入碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物来控制所述经预处理的纤维素材料的pH。

本文描述了一种用于从纤维素材料制备酶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)预处理纤维素材料，(b)酶促水解所述经预处理的纤维素材料以获得水解产物，(c)发酵所述水解产物以产生所述酶组合物，以及(d)任选地回收所述酶组合物，其中在步骤(b)之前和/或期间，通过向所述经预处理的纤维素材料中加入碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物来控制所述经预处理的纤维素材料的pH。

在一个优选的实施方式中，在步骤(b)期间通过向所述经预处理的纤维素材料中加入碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物来控制所述经预处理的纤维素材料的pH。代替术语“水解产物”，可以使用术语“糖产物”、“一种或多种糖”或“糖”。

本文还描述了一种用于制备酶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)预处理纤维素材料，(b)酶促水解所述经预处理的纤维素材料以获得水解产物，(c)发酵所述水解产物以产生所述酶组合物，以及(d)任选地回收所述酶组合物，其中在步骤(b)之前和/或期间，通过向所述经预处理的纤维素材料中加入强碱来控制所述经预处理的纤维素材料的pH。在一个优选的实施方式中，在步骤(b)期间通过向所述经预处理的纤维素材料中加入强碱来控制所述经预处理的纤维素材料的pH。酶促水解步骤(b)可以用如本文所述的酶组合物中的任何酶组合物来完成。

在本文中，“在步骤(b)之前控制所述经预处理的纤维素材料的pH”是指在预处理步骤已经结束之后并且在水解步骤开始之前控制所述pH。换句话说，在预处理步骤已经结束之后并且在水解步骤开始之前加入碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物或强碱。

在一个优选的实施方式中，在发酵之前浓缩所述获得的水解产物。可以通过标准方法(例如蒸发、离心、过滤、沉淀，或它们的任何组合)来进行浓缩。

在一个优选的实施方式中，在发酵之前对所述获得的水解产物进行杀菌。可以通过标准方法(例如热处理、无菌过滤，或它们的任何组合)来进行杀菌。

所获得的水解产物可以首先进行杀菌，然后浓缩，但是优选将所获得的水解产物浓缩，然后将浓缩的水解产物杀菌。

在一个实施方式中，可以使所获得的水解产物经受保存步骤。此步骤可以在浓缩步骤之前、期间或之后和/或杀菌步骤之前、期间或之后执行。

在一个实施方式中，在反应器中进行预处理步骤和/或水解步骤。在一个实施方式中，预处理步骤和/或水解步骤还可以在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或甚至更多个反应器中进行。因此，术语“反应器”不限于单个反应器，而是可以意指多个反应器。在一个实施方式中，在不同反应器中执行预处理步骤和水解步骤。

在如本文所述的方法中，可以将经预处理的纤维素材料加入到发生水解步骤的反应器中。这可以分批、补料分批或连续地进行。在一个实施方式中，将酶组合物加入至发生水解步骤的反应器中。这可以分批、补料分批或连续地进行。酶组合物可以是水性组合物。

在一个实施方式中，水解步骤包括液化步骤和糖化步骤。在一个实施方式中，液化步骤和糖化步骤各自可在单一反应器中进行，但各自也可在多个反应器中进行。在一个实施方式中，液化步骤和糖化步骤在不同的反应器中进行。

在一个实施方式中，在体积为10-500m

在一个实施方式中，在如本文所述的方法中使用的预处理反应器的高度与直径之比为3:1至12:1。

在一个实施方式中，在体积为至少10m

在一个实施方式中，进行水解步骤的反应器的高度与直径之比为0.1:1至10:1。

在一个实施方式中，在水解步骤期间将氧加入至经预处理的纤维素材料中。在一个实施方式中，在水解步骤的至少一部分期间加入氧。可以在水解步骤期间连续或不连续地加入氧。在一个实施方式中，在如本文所述的方法期间加入氧一次或多次。在一个实施方式中，将氧加入至在水解步骤中使用的反应器中。

氧可以几种形式加入。例如，氧可以作为氧气、富氧气体(例如富氧空气)或空气加入。也可以借助于原位氧产生来加入氧。

如何加入氧的示例包括但不限于借助于以下方式来加入氧：鼓泡、喷吹、电解、氧的化学加入、从顶部填充用于水解步骤中的反应器(将液化的水解产物投入反应器中，并因此将氧引入水解产物中)，以及将氧加入至反应器的顶部空间中。当将氧加入至反应器的顶部空间时，可以供应水解反应所需的足够的氧。通常，可以控制和/或改变加入至反应器中的氧的量。通过在反应器的水解时间的部分期间仅加入氧，可以限制所供应的氧。另一种选择是加入低浓度的氧，例如通过使用空气和循环空气(离开反应器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气。通过在较长的水解时间段期间加入氧、加入较高浓度的氧或加入更多空气，可以实现氧加入量的增加。控制氧浓度的另一种方法是加入氧消耗器和/或氧发生器。可以将氧引入反应器中存在的经预处理的碳水化合物材料中。也可以将氧引入反应器的顶部空间中。可以将氧吹入反应器中存在的经预处理的纤维素材料中。也可以将氧吹入反应器的顶部空间中。

在一个实施方式中，在将经预处理的纤维素材料加入至反应器中之前和/或期间和/或之后，将氧加入到用于水解步骤中的反应器中。可以将氧与进入反应器的经预处理的纤维素材料一起引入。可以将氧引入将进入反应器的材料流中，或与经过反应器外部回路的反应器内容物的部分一起引入。优选地，当反应器中存在经预处理的纤维素材料时加入氧。

在一个实施方式中，在水解步骤期间加入氧，以将溶解的氧保持在饱和水平的11％至80％。在一个实施方式中，在水解步骤期间加入氧，以将溶解的氧保持在饱和水平的20％至60％。

在一个实施方式中，所述碱金属氢氧化物和/或所述碱土金属氢氧化物选自由以下项组成的组：氢氧化铝、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铯、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化钠、氢氧化铷、氢氧化锶，以及它们的任何组合。在一个优选的实施方式中，所述碱金属氢氧化物和/或所述碱土金属氢氧化物选自由以下项组成的组：氢氧化钙、氢氧化钠和氢氧化钾。

在一个实施方式中，所述强碱选自由以下项组成的组：氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铯、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化钠、氢氧化铷、氢氧化锶，以及它们的任何组合。在一个优选的实施方式中，所述强碱选自由以下项组成的组：氢氧化钙、氢氧化钠和氢氧化钾。

在一个实施方式中，在步骤(b)(即水解步骤)之前和/或期间将所述经预处理的纤维素材料的所述pH控制为3.0至6.5。优选地，所述pH为3.5至5.5，更优选所述pH为4.0至5.0。优选地，在步骤(b)期间控制所述pH。

在一个实施方式中，在步骤(b)之前和/或期间测量所述pH。优选地，在步骤(b)期间控制pH，并且当pH在优选范围之外时，向所述经预处理的纤维素材料中加入碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物或强碱。

在一个实施方式中，所述酶组合物来自真菌，优选地丝状真菌。在一个实施方式中，所述酶组合物由真菌，优选地丝状真菌产生。在一个实施方式中，所述酶组合物中的酶来源于真菌，优选地丝状真菌。在一个实施方式中，所述酶组合物包括真菌酶，优选地丝状真菌酶。在一个实施方式中，如本文所述的方法的步骤(c)包括用真菌发酵水解产物以产生酶组合物。

“丝状真菌”包括亚门真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的所有丝状形式(如由Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi，第8版，1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义的)。丝状真菌包括但不限于支顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauvaria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chaetomium paecilomyces、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、裸孢壳属(Emericella)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、白乔史密斯霉属(Geosmithia)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳菌属(Podospora)、梨孢霉属(Pyricularia)、Rasamsonia、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、柱顶孢霉属(Scylatidium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、壳多孢属(Stagonospora)、篮状菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、Trametes pleurotus、木霉属(Trichoderma)和毛癣菌属(Trichophyton)。在一个优选实施方式中，所述真菌是Rasamsonia，其中踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)是最优选的。因此，如本文所述的方法有利地与来源于Rasamsonia属微生物的酶组合应用，或者用于如本文所述的方法中的酶包括Rasamsonia酶。

在许多菌种保藏单位中几种丝状真菌菌株是公众可容易获得的，所述菌种保藏单位为例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH,DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、以及农业研究服务专利菌种保藏所(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)、北方地区研究中心(Northern Regional Research Center,NRRL)。

优选地，用热稳定的酶进行如本文所述的方法。如本文所用的“热稳定的”酶是指该酶具有50℃或更高、60℃或更高、70℃或更高、75℃或更高、80℃或更高，或甚至85℃或更高的最适温度。它们可以例如从嗜热微生物中分离出来，或者可以由技术人员设计并人工合成。在一个实施方式中，编码热稳定的酶的多核苷酸可以从嗜热或耐热的丝状真菌分离或获得，或从非嗜热或非耐热的真菌分离出，但被发现是热稳定的。“嗜热真菌”是指在50℃或更高温度下生长的真菌。“耐热的”真菌是指在45℃或更高，最大接近50℃的温度下生长的真菌。

合适的嗜热或耐热真菌细胞可以是腐质霉属、根毛霉属、毁丝霉属、Rasamsonia、篮状菌属、嗜热丝孢菌属、热子囊菌属或梭孢壳属细胞，优选地是踝节菌属细胞。优选的嗜热或耐热真菌是灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)、绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、嗜热团丝核菌(Papulaspora thermophilia)、丝衣霉状篮状菌(Rasamsonia byssochlamydoides)、踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)、嗜热赭褐白乔史密斯霉(Rasamsoniaargillacea)、嗜热象牙白篮状菌(Rasamsonia eburnean)、Rasamsonia brevistipitata、嗜热柱孢白乔史密斯霉(Rasamsonia cylindrospora)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、杆孢篮状菌(Talaromycesbacillisporus)、Talaromyces leycettanus、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lenuginosus)、坚脆嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus)、嗜热栖热菌(Thermoascus thermophilus)、橙色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)和太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)。

Rasamsonia是包括耐热和嗜热的篮状菌属和白乔史密斯霉属的新属。目前，基于表型、生理学和分子数据，将物种埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、丝衣霉状篮状菌(Talaromyces byssochlamydoides)、象牙白篮状菌(Talaromyces eburneus)、赭褐白乔史密斯霉(Geosmithia argillacea)和柱孢白乔史密斯霉(Geosmithia cylindrospora)转移到新属Rasamsonia。术语埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、Penicilliumgeosmithia emersonii和踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)在本文中可互换使用。

在如本文所述的方法中，使用了酶组合物。在一个实施方式中，该组合物是稳定的。如本文所用的“稳定的酶组合物”是指酶组合物在30小时的水解反应时间后保持活性，优选在30小时的水解反应时间后保留其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一个实施方式中，酶组合物在40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、150小时、200小时、250小时、300小时、350小时、400小时、450小时、500小时的水解反应时间后保持活性。

酶可以通过用合适的微生物(例如踝节菌属埃默森蓝状菌或黑曲霉(Aspergillusniger))发酵合适的底物来制备，其中所述酶是由所述微生物产生的。可以改变微生物以改进或制造酶。例如，可以通过经典的菌株改良方法或通过重组DNA技术使微生物突变。因此，本文提及的微生物可以原样用于产生酶，或者可以经改变以增加产量或产生改变的酶，所述改变的酶可包括异源酶，例如纤维素酶，因此不是该微生物最初产生的酶。优选地，使用真菌，更优选地丝状真菌来产生酶。有利地，使用嗜热或耐热的微生物。任选地，使用诱导产生酶的微生物对酶进行表达的底物。

所述酶用于水解所述经预处理的纤维素材料(从包含多糖的纤维素材料中释放糖)。如本文所用的纤维素材料包括多糖。所述多糖可以是纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖和木葡聚糖)。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖存在，例如在木材来源的碳水化合物材料中。这些多糖转化成为可溶性糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(acting in concert)的不同酶的作用下。糖产物包含可溶性糖，包括单体和多聚体两者。在一个实施方式中，糖产物包括葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。其他糖的示例是纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和其他己糖和戊糖。糖产物可以原样使用或可以进一步处理，例如回收和/或纯化。

此外，纤维素材料可包括果胶和诸如阿拉伯聚糖的其他果胶物质，所述果胶和其他果胶物质可占来自非木本植物组织的典型细胞壁干质量的可观的比例(干质量的约四分之一到一半可为果胶)。此外，所述纤维素材料可包含木质素。

下文将更详细地描述可在如本文所述的方法中使用的酶。

裂解性多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解为诸如纤维寡糖(纤维二糖为主要产物)等产物，而β-葡糖苷酶(BG)则将寡糖(主要是纤维二糖和纤维三糖)转换为葡萄糖。

木聚糖酶与其他辅助酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酰酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶和β-木糖苷酶)一起催化半纤维素的水解。

用于本文所述方法中的酶组合物可包含至少两种活性，尽管通常组合物将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种活性。通常，用于如本文所述的方法的酶组合物包含至少两种纤维素酶。该至少两种纤维素酶可以包含相同或不同的活性。用于如本文所述的方法中的酶组合物还可包含至少一种除纤维素酶以外的酶。优选地，该至少一种其他酶具有辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的附加活性。此类辅助活性的示例在本文中提及，并且包括但不限于半纤维素酶。

用于如本文所述的方法中的酶组合物至少包含裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)、内切木聚糖酶(EX)、β-木糖苷酶(BX)和β-葡糖苷酶(BG)。酶组合物可包含每个活性类别中的多于一种酶活性。例如，组合物可以包含两种内切葡聚糖酶，例如具有内切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶和具有内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶。

用于在如本文所述的方法中使用的组合物可从真菌，诸如丝状真菌，诸如Rasamsonia，诸如踝节菌属埃默森蓝状菌获得。在一个实施方式中，酶中的至少一种酶可来源于踝节菌属埃默森蓝状菌。如果需要的话，可以用来自其他源的附加酶补充所述酶。此类附加酶可来源于经典来源和/或由经基因修饰的生物产生。

另外，用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物中的酶可能够在低pH下工作。出于本发明的目的，低pH表示pH为5.5或更低、5或更低、4.9或更低、4.8或更低、4.7或更低、4.6或更低、4.5或更低、4.4或更低、4.3或更低、4.2或更低、4.1或更低、4.0或更低、3.9或更低、3.8或更低、3.7或更低、3.6或更低、3.5或更低。

用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含来自Rasamsonia的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们还可以包含来自除了Rasamsonia以外的源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们可以与一种或多种Rasamsonia酶一起使用，或者它们可以在不存在附加Rasamsonia酶的情况下使用。

用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶I(CBHI)、纤维二糖水解酶II(CBHII)、β-葡糖苷酶(BG)、内切木聚糖酶(EX)和β-木糖苷酶(BX)。

用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含由如本文所述的组合物提供的一种类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，以及由附加的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。

在一个实施方式中，所述酶组合物包含真菌的全发酵培养液。在一个实施方式中，所述培养液包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切木聚糖酶、β-木糖苷酶和裂解性单糖加氧酶。已经在本文中更详细地描述了这些酶。

在本文中，纤维素酶是能够降解或修饰纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化将纤维素分解成更小单元(部分分解为例如纤维糊精，或完全分解为葡萄糖单体)的过程的多肽。如本文所述的纤维素酶可产生纤维糊精和葡萄糖单体的混合群体。此类降解通常将通过水解反应发生。

在本文中，半纤维素酶是能够降解或修饰半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可能够降解或修饰木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖中的一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化将半纤维素分解成更小的多糖(部分分解为例如寡糖，或者完全分解为糖单体，例如己糖或戊糖单体)的过程的多肽。如本文所述的半纤维素酶可产生寡糖和糖单体的混合群体。此类降解通常将通过水解反应发生。

在本文中，果胶酶是能够降解或修饰果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化将果胶分解成更小单元(部分分解为例如寡糖，或完全分解为糖单体)的过程的多肽。如本文所述的果胶酶可产生寡糖和糖单体的混合群体。此类降解通常将通过水解反应发生。

因此，用于如本文所述的方法的酶组合物可包含以下酶中的一种或多种：裂解性多糖单加氧酶(例如GH61)、纤维二糖水解酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶，以及β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。用于在如本文所述的方法中使用的组合物还可包含一种或多种半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯生物呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿魏酰酯酶、香豆酰基酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和/或β-甘露糖苷酶。用于在如本文所述的方法中使用的组合物还可包含一种或多种果胶酶，例如内切聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基酯酶、内切半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、果胶-乙酰基酯酶、内切果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、α-鼠李糖苷酶、外切半乳糖醛酸酶，外切聚半乳糖醛酸裂解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖酸酸水解酶，和/或木糖基半乳糖醛酸酶。另外，用于在如本文所述的方法中使用的组合物中可以存在以下酶中的一种或多种：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质素酶、己糖基转移酶、葡糖醛酸酶、扩展蛋白(expansin)、纤维素诱导的蛋白或纤维素整合蛋白，或类似蛋白(这些在上文中称为辅助活性)。

在本文中，裂解性多糖单加氧酶是最近被CAZy分类为AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)的酶。因此，存在AA9裂解性多糖单加氧酶和AA10裂解性多糖单加氧酶。裂解性多糖单加氧酶能够打开结晶的葡聚糖结构，并增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。它们是具有纤维素分解增强活性的酶。裂解性多糖单加氧酶也可影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等人，Journal of Biological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)，名为GH61的蛋白质(糖苷水解酶家族61或有时称为EGIV)是裂解性多糖单加氧酶。GH61最初基于一个家庭成员中非常弱的内切1,4-β-d-葡聚糖酶活性而被分类为内切葡聚糖酶，但最近被CAZy重新分类为AA9家族。CBM33(家族33的碳水化合物结合模块)也是一种裂解性多糖单加氧酶(参见Isaksen等人，Journal of BiologicalChemistry，第289卷，第5期，第2632-4642页)。CAZy最近将CBM33重新分类为AA10家族。

在一个实施方式中，裂解性多糖单加氧酶包括AA9裂解性多糖单加氧酶。这意味着酶组合物中的裂解性多糖单加氧酶中的至少一种是AA9裂解性多糖单加氧酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有裂解性多糖单加氧酶均为AA9裂解性多糖单加氧酶。

在一个实施方式中，所述酶组合物包含来自热子囊菌属(例如橙色嗜热子囊菌)的裂解性多糖单加氧酶，诸如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2和在WO2014/130812及WO 2010/065830中描述为SEQ ID NO:1的裂解性多糖单加氧酶；或来自梭孢壳属(例如太瑞斯梭孢壳)的裂解性多糖单加氧酶，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:8或在WO2014/130812及WO 2008/148131以及WO 2011/035027中描述为SEQ ID NO:4的裂解性多糖单加氧酶；或来自曲霉属(例如烟曲霉菌)的裂解性多糖单加氧酶，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:3的裂解性多糖单加氧酶；或来自青霉菌属(例如埃默森青霉(Penicillium emersonii))的裂解性多糖单加氧酶，诸如在WO 2011/041397中公开为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中公开为SEQ ID NO:2的裂解性多糖单加氧酶。其他合适的裂解性多糖单加氧酶包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)(参见WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(参见WO 2009/085935、WO2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(参见WO 2011/005867)、热子囊菌属(参见WO 2011/039319)和甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(参见WO 2011/041504)。可包含在酶组合物中的其他纤维素分解酶描述于WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO99/025847、WO 99/031255、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263、以及US 5,686,593(仅举几例)中。在一个优选的实施方式中，所述裂解性多糖单加氧酶来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌(参见WO 2012/000892)。

如本文中所用，内切葡聚糖酶是能够催化纤维素、地衣多糖(lichenin)或谷类β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键的内切水解的酶。它们属于EC 3.2.1.4，并且可能还能够水解还含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。内切葡聚糖酶还可以称为纤维素酶、结晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶。

在一个实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶和/或GH7内切葡聚糖酶。这意味着酶组合物中的内切葡聚糖酶中的至少一种是GH5内切葡聚糖酶或GH7内切葡聚糖酶。在酶组合物中存在更多的内切葡聚糖酶的情况下，这些内切葡聚糖酶可以是GH5内切葡聚糖酶、GH7内切葡聚糖酶，或GH5内切葡聚糖酶和GH7内切葡聚糖酶的组合。在一个优选的实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶。

在一个实施方式中，酶组合物包含来自以下的内切葡聚糖酶：木霉属，诸如里氏木霉；腐质霉属，诸如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株；曲霉属，例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)或白曲霉(Aspergillus kawachii)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)；镰刀菌属，例如尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)；梭孢壳属，例如太瑞斯梭孢壳；腐质霉属，例如灰腐质霉高温变种或特异腐质霉；白丝菌属(Melanocarpus)，例如热白丝菌(Melanocarpus albomyces)；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；毁丝霉属，例如嗜热毁丝霉；枝鼻菌属(Cladorrhinum)，例如多生枝鼻菌(Cladorrhinum foecundissimum)；和/或金孢子菌属，例如鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。在一个优选的实施方式中，内切葡聚糖酶来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的菌株(参见WO 01/70998)。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌内切葡聚糖酶，包括但不限于解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)内切葡聚糖酶(参见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655、WO 00/70031、WO 05/093050)；嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(参见WO 05/093050)；以及嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(参见WO 05/093050)。

在本文中，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖水解，以从非还原末端去除连续的D-木糖残基的多肽。β-木糖苷酶也可水解木二糖。β-木糖苷酶也可以称为木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。

在一个实施方式中，β-木糖苷酶包括GH3β-木糖苷酶。这意味着酶组合物中的β-木糖苷酶中的至少一种是GH3β-木糖苷酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有β-木糖苷酶均为GH3β-木糖苷酶。

在一个实施方式中，酶组合物包含来自粗糙脉孢菌、烟曲霉菌或里氏木霉的β-木糖苷酶。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，诸如踝节菌属埃默森蓝状菌的β-木糖苷酶(参见WO 2014/118360)。

在本文中，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解的任何多肽。该酶也可以被称为内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。替代物是EC 3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖内切木聚糖酶，一种能够水解葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖中的1,4木糖苷键的酶。

在一个实施方式中，内切木聚糖酶包括GH10木聚糖酶。这意味着酶组合物中的内切木聚糖酶中的至少一种是GH10木聚糖酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有内切木聚糖酶均为GH10木聚糖酶。

在一个实施方式中，所述酶组合物包含来自棘孢曲霉(参见WO 94/21785)、烟曲霉菌(参见WO 2006/078256)、嗜松青霉(参见WO 2011/041405)、青霉菌属(参见WO 2010/126772)、太瑞斯梭孢壳NRRL 8126(参见WO 2009/079210)、Talaromyces leycettanus、嗜热裂孢菌，或囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)GH10(参见WO 2011/057083)的内切木聚糖酶。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的内切木聚糖酶(参见WO 02/24926)。

在本文中，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端非还原β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。此类多肽可对β-D-葡糖苷具有宽特异性，并且还可以水解以下中的一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷，或β-D-岩藻糖苷。该酶也可以称为苦杏仁酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。

在一个实施方式中，酶组合物包含来自曲霉属的β-葡糖苷酶，例如来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-葡糖苷酶，例如在WO 02/095014中公开的β-葡糖苷酶，或在WO2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来自烟曲霉菌的β-葡糖苷酶，例如在WO 2005/047499中公开为SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中公开为SEQ ID NO:5的β-葡糖苷酶，或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，诸如在WO 2012/044915中公开的β-葡糖苷酶，例如具有以下取代的β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ IDNO:5进行编号)，或来自棘孢曲霉、黑曲霉或白曲霉的β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶来源于青霉属，例如在WO 2007/019442公开为SEQ ID NO:2的巴西青霉(Penicillium brasilianum)；或来源于木霉属，例如里氏木霉，诸如在US 6,022,725、US6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US 2006/0258554、US 2004/0102619中描述的里氏木霉。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶来源于太瑞斯梭孢壳(WO 2011/035029)或囊状长毛盘菌(WO 2007/019442)。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，诸如踝节菌属埃默森蓝状菌的β-葡糖苷酶(参见WO 2012/000886)。

在本文中，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中的1,4-β-D-糖苷键水解，从而从链末端释放纤维二糖的任何多肽。该酶也可以称为纤维素酶1,4-β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)、1,4-β-纤维二糖水解酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶、结晶纤维素酶、外切-1,4-β-D-葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。

在一个实施方式中，酶组合物包含来自曲霉属(诸如烟曲霉菌)的纤维二糖水解酶I，例如在WO 2011/057140中以SEQ ID NO:6公开或在WO 2014/130812中以SEQ ID NO:6公开的Cel7A CBH I；来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维二糖水解酶I；来自毛壳菌属(诸如嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的纤维二糖水解酶I；来自篮状菌属(诸如Talaromyces leycettanus)的纤维二糖水解酶I；或来自青霉菌属(诸如埃默森青霉)的纤维二糖水解酶I。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的纤维二糖水解酶I(参见WO 2010/122141)。

在一个实施方式中，所述酶组合物包含来自曲霉(例如烟曲霉)的纤维二糖水解酶II，例如在WO 2014/130812中以SEQ ID NO:7所示的纤维二糖水解酶II；或来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维二糖水解酶II；或来自篮状菌属(例如Talaromyces leycettanus)的纤维二糖水解酶II；或来自梭孢壳属(例如太瑞斯梭孢壳)的纤维二糖水解酶II，诸如来自太瑞斯梭孢壳的纤维二糖水解酶II CEL6A。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的纤维二糖水解酶II(参见WO 2011/098580)。

在一个实施方式中，酶组合物还包含以下提及的酶中的一种或多种。

在本文中，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-键和1,4-键的β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键水解的任何多肽。此类多肽可以作用于地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅包含1,3-键或1,4-键的β-D-葡聚糖。该酶也可以称为地衣多糖酶(licheninase)、1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶、地衣聚糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这种酶的替代物是EC 3.2.1.6，被称为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶。当其还原基团参与要水解的键的葡萄糖残基本身在C-3处被取代时，这种酶会水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶、昆布多糖酶、1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖、地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖。

在本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。该酶也可以称为α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。可包含在酶组合物中的阿拉伯呋喃糖苷酶的示例包括但不限于来自黑曲霉、特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2006/114094和WO 2009/073383)和大型亚灰树花菌(M.giganteus)(参见WO 2006/114094)的阿拉伯糖呋喃糖苷酶。

在本文中，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸酯。该酶也可以称为α-葡糖醛酸酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶还可以水解4-O-甲基化的葡糖醛酸，所述4-O-甲基化的葡糖醛酸也可以作为取代基存在于木聚糖中。替代物是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸苷酶(glucuronosidase)，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基键的水解。可包含在酶组合物中的α-葡糖醛酸酶的示例包括但不限于来自棒曲霉(Aspergillusclavatus)、烟曲霉菌、黑曲霉、土曲霉(Aspergillus terreus)、特异腐质霉(参见WO 2010/014706)、黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)(参见WO 2009/068565)和里氏木霉的α-葡糖醛酸酶。

在本文中，乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木糖寡糖的去乙酰化的任何多肽。此类多肽可以催化来自聚合的木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、乙酸α-萘酯或乙酸对硝基苯酯的乙酰基的水解，但是通常不催化来自三乙酰基甘油的乙酰基的水解。此类多肽通常不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。可包含在酶组合物中的乙酰木聚糖酯酶的示例包括但不限于来自棘孢曲霉(参见WO 2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、细丽毛壳(Chaetomium gracile)、特异腐质霉DSM 1800(参见WO2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(参见WO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(见WO 2010/014880)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)和太瑞斯梭孢壳NRRL 8126(参见WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的乙酰木聚糖酯酶(参见WO 2010/000888)。

在本文中，阿魏酰酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：阿魏酰糖+H

在本文中，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：香豆酰基糖+H(2)O＝香豆酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。该酶也可以被称为反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。该酶也落入EC3.1.1.73之内，因此也可以称为阿魏酰酯酶。

在本文中，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷中的末端非还原α-D-半乳糖残基水解的任何多肽，所述α-D-半乳糖苷包括半乳糖低聚糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。此类多肽也可能够水解α-D-岩藻糖苷。该酶也可以称为蜜二糖酶。

在本文中，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中的末端非还原β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。此类多肽也可能够水解α-L-阿拉伯糖苷。该酶也可以称为外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。

在本文中，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的随机水解的任何多肽。该酶也可以称为甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。

在本文中，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中的末端非还原β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。该酶也可以称为甘露聚糖酶(mannanase)或甘露糖酶(mannase)。

在本文中，内切聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖(galacturonan)中的1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。该酶也可以称为聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶、果胶酶(pectinase)、内切聚半乳糖醛酸酶、果胶酶(pectolase)、果胶水解酶、果胶聚半乳糖醛酸酶、聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶、内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。

在本文中，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化以下反应的任何酶：果胶+nH

在本文中，内切半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中的1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。该酶也可以被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶、内切-1,4-β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。

在本文中，果胶乙酰基酯酶在本文中定义为具有乙酰基酯酶活性的任何酶，该酶催化果胶的GalUA残基的羟基处的乙酰基的去乙酰化。

在本文中，内切果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲酯的清除性切割以产生在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。该酶也称为果胶裂解酶、果胶反式消除酶(pectin trans-eliminase)；内切果胶裂解酶、聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶、果胶甲基反式消除酶、果胶裂解酶、PL、PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。

在本文中，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸聚糖的清除性切割以产生在其非还原末端具有4-脱氧-α-D-半乳糖-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。该酶也可以称为聚半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸反式消除酶、聚半乳糖醛酸酯裂解酶、内切果胶甲基反式消除酶、果胶酸酯反式消除酶、内切半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、α-1,4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶、PGA裂解酶、PPase-N、内切-α-1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶反式消除酶、聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。

在本文中，α鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。该酶也可以称为α-L-鼠李糖苷酶T、α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。

在本文中，外切半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够水解来自非还原末端的果胶，从而释放二半乳糖醛酸酯的任何多肽。该酶也可以称为外切-聚-α-半乳糖醛酸苷酶、外切聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切聚半乳糖苷酶(exopolygalacturanosidase)。

在本文中，外切半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)

在本文中，外切半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸根(即去酯化果胶)的还原末端清除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳糖-4-糖醛酰基)-D-半乳糖醛酸酯的任何多肽。该酶可被称为果胶二糖裂解酶、果胶外切裂解酶、外切果酸反式消除酶、外切果胶酸裂解酶、外切聚半乳糖醛酸反式消除酶、PATE、外切-PATE、外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端-二糖裂解酶。

在本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖酰-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳糖醛糖醛酸与吡喃鼠李糖基之间的键的任何多肽。

在本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够通过β-消除在鼠李半乳糖醛酸聚糖中以内切方式切割α-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。

在本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶是催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中具有交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基的骨架的去乙酰化的任何多肽。

在本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖酸酸水解酶是能够以外切方式从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。

在本文中，木糖基半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木糖聚半乳糖醛酸的任何多肽。该酶也可以称为木糖聚半乳糖醛酸水解酶。

在本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。该酶也可以称为α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。

在本文中，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中的1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解的任何多肽。该酶也可以称为内切阿拉伯糖酶、阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶、内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶、内切-α-1,5-阿拉伯糖苷酶；内切阿拉伯糖苷酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。

“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽与其他部分(诸如糖)之间的键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶根据EC 3.4进行了表征，并且适合用于如本文所述的方法中。蛋白酶的一些特定类型包括半胱氨酸蛋白酶，包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶；以及丝氨酸蛋白酶，包括糜蛋白酶、羧肽酶和金属内肽酶。

“脂酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯、脂蛋白、二酰基甘油等)的酶。在植物中，脂质被用作限制水分流失和病原体感染的结构组分。这些脂质包括来源于脂肪酸的蜡，以及角质和软木脂。

“木质素酶”包括能够水解或破坏木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酰酯酶，以及其他本领域所述的已知用于解聚或以其他方式破坏木质素聚合物的酶。还包括能够水解在半纤维素糖(特别是阿拉伯糖)与木质素之间形成的键的酶。木质素酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酰酯酶(EC3.1.1.73)。

“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但也能催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以使用的己糖基转移酶的示例是β-葡聚糖基转移酶。此类酶可能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。

“葡糖醛酸酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)的水解以产生醇的酶。许多葡糖醛酸酶已经被表征并且可适于使用，例如β-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、透明质酸-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.36)、葡糖醛酸基-二硫葡糖胺葡糖醛酸酶(3.2.1.56)、甘草酸β-葡糖醛酸基(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)。

扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素与其他细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质膨胀因子(Swollenin)含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。如本文所述，扩展蛋白样蛋白或膨胀因子样蛋白可包含此类结构域中的一者或两者和/或可破坏细胞壁的结构(例如破坏纤维素结构)，任选地不产生可检测量的还原糖。

纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(参见Foreman等人，J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)；纤维素/纤维素整合蛋白，例如cipA或cipC基因的多肽产物；或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，所述多功能整合亚基可以将纤维素分解亚基组织成多酶复合物。这是通过两个互补类别的结构域(即支架蛋白上的内聚结构域和每个酶单位上的停靠结构域)的相互作用来完成的。支架蛋白亚基还带有纤维素结合模块(CBM)，所述CBM可介导纤维小体与其底物的附着。支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含此类结构域中的一者或两者。

过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”是指催化两个过氧化氢转换为氧气和两个水的过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)。过氧化氢酶活性可以通过基于以下反应监测240nm处的过氧化氢的降解来确定：2H

如本文所用的术语“淀粉酶”是指水解淀粉(直链淀粉和支链淀粉中)的α-1,4-葡糖苷键的酶，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖苷酶(EC 3.2.1.98)、葡聚糖1,4-α-麦芽三糖水解酶(EC 3.2.1.116)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133)；以及水解α-1,6-糖苷键(为支链淀粉中支链点)的酶，例如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和极限糊精酶(EC 3.2.1.142)。

用于本文所述的方法中使用的组合物可以由来自以下的酶组成：(1)商业供应商；(2)克隆的表达酶的基因；(3)培养液(例如由于微生物菌株在培养基中生长而产生的培养液，其中菌株将蛋白质和酶分泌到培养基中)；(4)如在(3)中所生长的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。本发明组合物中的不同酶可以从不同源获得。

酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并添加到例如木质纤维素材料中。或者，酶可以在使用(经预处理的)木质纤维素材料(例如玉米秸秆或小麦秸秆)的发酵中产生以向产生酶的生物体提供营养。以这种方式，产生酶的植物本身可以用作木质纤维素材料，并被添加到木质纤维素材料中。

在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以同时提供(即，本身作为单一组合物)或分开提供或顺序提供。

在一个实施方式中，酶组合物包含真菌的全发酵培养液，优选是丝状真菌的全发酵培养液，更优选是Rasamsonia的全发酵培养液。全发酵培养液可以由非重组和/或重组丝状真菌的发酵制备。在一个实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，所述重组丝状真菌包含可与所述丝状真菌同源或异源的一个或多个基因。在一个实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，所述重组丝状真菌包含与丝状真菌可为同源或异源的一个或多个基因，其中所述一个或多个基因编码能够降解纤维素底物的酶。全发酵培养液可包含上述多肽中的任一者，或它们的任何组合。

优选地，酶组合物是其中细胞被杀死的全发酵培养液。全发酵培养液可包含有机酸(用于杀死细胞)、被杀死的细胞和/或细胞碎片，以及培养基。

通常，丝状真菌在适于产生能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养。使用本领域已知的方法，在包含碳和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。适用于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶生产的合适的培养基、温度范围和其他条件是本领域中已知的。全发酵培养液可以通过使丝状真菌生长到固定相并使丝状真菌保持在有限的碳条件下达足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的时间段来制备。一旦丝状真菌将诸如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的酶分泌到发酵培养基中，就可以使用全发酵培养液。本发明的全发酵培养液可包含丝状真菌。在一些实施方式中，全发酵培养液包括在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。通常，全发酵培养液包括用过的培养基和在丝状真菌生长至饱和后存在的细胞碎片，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(特别是纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的表达)。在一些实施方式中，全发酵培养液包含用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。在一些实施方式中，存在于全发酵培养液中的丝状真菌可以使用本领域已知的方法进行裂解、透化或杀死，以产生细胞被杀死的全发酵培养液。在一个实施方式中，全发酵培养液是细胞被杀死的全发酵培养液，其中全发酵培养液含有被裂解或杀死的丝状真菌细胞。在一些实施方式中，通过化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀死细胞，以产生丝状真菌发酵的细胞被杀死的全发酵培养液。在一些实施方式中，通过用化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀死细胞，并将细胞被杀死的发酵混合物的pH调节至合适的pH。在一个实施方式中，全发酵培养液包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，所述第一有机酸组分包含至少一种1-5碳有机酸和/或其盐，所述第二有机酸组分包含至少6个或更多个碳有机酸和/或它们的盐。在一个实施方式中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、它们的盐或它们的任意组合，并且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷甲酸、4-甲基戊酸、苯基乙酸，它们的盐或它们的任意组合。

如本文所用的术语“全发酵培养液”是指通过细胞发酵产生的制备物，所述制备物不进行或仅进行最小的回收和/或纯化。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，宿主细胞对酶进行表达)并分泌到细胞培养基中时，会产生全发酵培养液。通常，全发酵培养液是未分级的，并且包含用过的细胞培养基、细胞外酶，以及微生物细胞，优选为非存活的细胞。

如果需要的话，可以将全发酵培养液分级，并且可以使用分级的内容物中的一种或多种。例如，可以从全发酵培养液中去除被杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

全发酵培养液还可包含防腐剂和/或抗微生物剂。此类防腐剂和/或试剂是本领域中已知的。

如本文所述的全发酵培养液通常是液体，但是可包含不溶性组分，例如被杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可以去除不溶性组分以提供澄清的全发酵培养液。

在一个实施方式中，可以向全发酵培养液中补充一种或多种酶活性，所述一种或多种酶活性不是内源性表达的，或者由丝状真菌以相对较低的水平表达，以改善将纤维素底物降解为例如可发酵的糖(诸如葡萄糖或木糖)。可以将一种或多种补充酶作为补充物添加到全发酵培养液中，并且所述酶可以是单独的全发酵培养液的组分，或者可以被纯化，或者最小地回收和/或纯化。

在一个实施方式中，全发酵培养液包括过表达一种或多种酶以改善纤维素底物降解的重组丝状真菌的发酵的全发酵培养液。或者，全发酵培养液可包含非重组丝状真菌和过表达一种或多种酶以改善纤维素底物降解的重组丝状真菌的发酵的全发酵培养液的混合物。在一个实施方式中，全发酵培养液包括过表达β-葡糖苷酶或内切葡聚糖酶的丝状真菌的发酵的全发酵培养液。或者，用于本发明方法和反应性组合物的全发酵培养液可包含非重组丝状真菌发酵的全发酵培养液和过表达β-葡糖苷酶或内切葡聚糖酶的重组丝状真菌的发酵的全发酵培养液的混合物。

如本文所用的纤维素材料包括任何含有纤维素的材料。优选地，如本文所用的纤维素材料包括木质纤维素材料和/或半纤维素材料。最优选地，如本文所用的纤维素材料是木质纤维素材料。适用于本文所述方法的纤维素材料包括生物质，例如原始生物质和/或非原始生物质，诸如农业生物质、商业有机物、构建和拆除碎片、城市固体废弃物、废纸和庭院废弃物。生物质的常见形式包括树木、灌木和草、小麦、黑麦、燕麦、小麦秸秆、糖料甘蔗、甘蔗秆、糖料甘蔗渣、柳枝稷、芒草、能源甘蔗、木薯、磨拉石、大麦、玉米、玉米秸秆、玉米纤维、玉米壳、玉米芯、芸苔茎、大豆茎、甜高粱、玉米粒(包括来自谷粒的纤维)、酒糟(DDGS)、来自谷物(例如玉米、小麦和大麦)的研磨(包括湿磨和干磨)的通常被称为“麸皮或纤维”的产物和副产物，以及城市固体废弃物、废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废弃木材(类型A、B和/或C)、废纸，以及制浆造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝、灌木、甘蔗、玉米和玉米壳、能源作物、森林、水果、花卉、谷物、草、草本作物、树叶、树皮、针叶、原木、根、树苗、短期轮种木本作物、灌木、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、蔓藤、甜菜糖、甜菜粕、小麦苗、燕麦壳，以及硬木和软木(不包括具有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括从包括农业和林业活动在内的农业过程中产生的有机废物材料，特别地包括林业木材废物。农业生物质可以是单独的任何上述，或者是它们的任意组合或混合物。

在水解步骤之前对所述纤维素材料进行预处理。预处理方法是本领域中已知的，并且包括但不限于加热、机械、化学修饰、生物修饰，以及它们的任意组合。通常执行预处理是为了增强纤维素材料对酶促水解而言的可及性和/或水解半纤维素和/或溶解纤维素材料中的半纤维素和/或纤维素和/或木质素。在一个实施方式中，预处理包括用蒸汽爆破、热水处理或稀酸或稀碱处理来处理纤维素材料。预处理方法的示例包括但不限于蒸汽处理(例如，在100-260℃、7-45巴的压力、中性pH下处理1-10分钟)、稀酸处理(例如，在存在或不存在蒸汽的情况下在120-200℃、2-15巴的压力、酸性pH下用0.1-5％的H

可以洗涤纤维素材料。在一个实施方式中，可以在预处理之后洗涤纤维素材料。洗涤步骤可用于去除可充当发酵和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。洗涤步骤可以以技术人员已知的方式进行。除了洗涤，还存在其他解毒方法。纤维素材料也可以通过这些方法中的任何一种(或任何组合)进行解毒，这些方法包括但不限于固/液分离、真空蒸发、萃取、吸附、中和、加灰过量(overliming)、添加还原剂、添加解毒酶(例如漆酶或过氧化物酶)、添加能够使水解产物解毒的微生物。

如本文所述的酶组合物可以极其有效地水解纤维素材料，例如玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗秆和/或糖料甘蔗渣，所述水解产物可以随后进一步转换为产物，例如酶组合物。

在一个实施方式中，在酶促水解中以4.5mg至15mg蛋白质/克干物质重量的纤维素材料中葡聚糖的量使用酶组合物。在一个实施方式中，在酶促水解中以5mg至14mg蛋白质/克干物质重量的纤维素材料中葡聚糖的量使用酶组合物。在一个实施方式中，在酶促水解中以6mg至12mg蛋白质/克干物质重量的纤维素材料中葡聚糖的量使用酶组合物。

可根据如本文所述的TCA-缩二脲分析来测量蛋白质。

在一个实施方式中，水解中的干物质含量为10％(w/w)至40％(w/w)。在一个实施方式中，所水解的经预处理的纤维素材料具有10％(w/w)至40％(w/w)的干物质含量。在一个实施方式中，酶促水解中的纤维素材料的干物质含量为10％(w/w)至40％(w/w)、11％(w/w)至35％(w/w)、12％(w/w)至30％(w/w)、13％(w/w)至29％(w/w)、14％(w/w)至28％(w/w)，并且优选15％(w/w)至25％(w/w)。

在一个实施方式中，在40-90℃，优选45-70℃，更优选55-65℃的温度下进行水解步骤。

在一个实施方式中，在反应器中进行发酵。在一个实施方式中，也可以在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个反应器中进行发酵。因此，术语“反应器”不限于单个反应器，而是可以意指多个反应器。

在一个实施方式中，在体积为1-5000m

在一个实施方式中，进行发酵的反应器的高度与直径之比为2:1至8:1。

在一个实施方式中，由如上文已经描述的真菌进行发酵。所述真菌发酵所述水解产物以产生所述酶组合物。

本发明还涉及一种水解产物，所述水解产物包含500-900g糖/kg干物质的水解产物和0.5-3.5％(w/w)的碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物。在一个实施方式中，所述水解产物包含500-900g糖/kg干物质的水解产物和1.0-3.0％(w/w)的碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物。在一个优选的实施方式中，所述水解产物包含500-900g糖/kg干物质的水解产物和1.5-2.5％(w/w)的碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物。本文已经描述了合适的碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物。

本发明还涉及一种水解产物，所述水解产物包含500-900g糖/kg干物质的水解产物和0.5-3.5％(w/w)的强碱。本文已经描述了合适的强碱。在一个实施方式中，所述水解产物包含500-900g糖/kg干物质的水解产物和1.0-3.0％(w/w)的强碱。在一个优选的实施方式中，所述水解产物包含500-900g糖/kg干物质的水解产物和1.5-2.5％(w/w)的强碱。

在一个优选的实施方式中，如本文所述制备水解产物。在一个优选的实施方式中，通过以下方式来制备水解产物：预处理纤维素材料并酶促水解经预处理的纤维素材料以获得水解产物。可以通过以下方式来制备水解产物：执行如本文所述的方法的步骤(a)和(b)。

本发明还涉及一种发酵混合物，所述发酵混合物包含水解产物、真菌和0.02-20g碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物/kg所述发酵混合物。在一个实施方式中，所述发酵混合物包含水解产物、真菌和0.03-18g碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物/kg所述发酵混合物。在一个实施方式中，所述发酵混合物包含水解产物、真菌和0.04-16g碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物/kg所述发酵混合物。在一个优选的实施方式中，所述发酵混合物包含水解产物、真菌和0.05-15g碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物/kg所述发酵混合物。所述水解产物可以是如上所述的水解产物。所述水解产物可以是如本文所述制备。可以通过以下方式来制备水解产物：预处理纤维素材料并酶促水解经预处理的纤维素材料以获得水解产物。可以通过以下方式来制备水解产物：执行如本文所述的方法的步骤(a)和(b)。所述真菌可以是如本文所述的真菌。所述发酵混合物还可包含纤维素酶、半纤维素酶和/或果胶酶。本文已经描述了合适的纤维素酶、半纤维素酶和/或果胶酶。所述发酵混合物可以是如本文所述制备。在一个实施方式中，通过以下方式来制备发酵混合物：预处理纤维素材料；酶促水解经预处理的纤维素材料以获得水解产物；以及发酵所述水解产物。

玉米秸秆酶促水解中的pH控制

在本实施例中显示了在经预处理的碳水化合物材料的酶促水解期间使用不同滴定剂将pH值调节和保持在恒定值的效应。

根据如在WO 2011/000949中所述的方法产生踝节菌属埃默森蓝状菌纤维素酶混合物(即全发酵培养液)。此外，在实验中使用如在WO2012/000890中所述的踝节菌属埃默森蓝状菌β-葡糖苷酶。

使用缩二脲方法确定纤维素酶混合物的蛋白质浓度。将混合物样本基于重量用水稀释，并以>14000xg离心5分钟。制备牛血清白蛋白(BSA)稀释液(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml和15mg/ml)以生成校准曲线。将每种稀释的蛋白质样本(即BSA和混合物的稀释的蛋白质样本)的200μl上清液转移到1.5ml反应管中。加入800μl的BioQuantBiuret试剂并充分混合。将来自相同的经稀释的蛋白质样本的500μl加入至装有10KD过滤器的反应管中。将200μl流出物转移到1.5ml反应管中，加入800μl的BioQuant Biuret试剂并充分混合。接下来，将所有混合物(与BioQuant混合的在10KD过滤之后的经稀释的蛋白质样本和在10KD过滤之前的经稀释的蛋白质样本)在室温下孵育至少30分钟。在546nm处测量混合物的吸收，并且将水样本用作空白测量。将在校准线范围内在546nm处具有吸收值的混合物稀释液用于经由BSA校准线计算纤维素酶混合物样本的总蛋白浓度。

使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物，在37℃和pH 4.4下测定酶促β-葡萄糖苷酶活性(WBDG)。pNP-β-D-吡喃葡萄糖苷的酶促水解导致了对硝基苯酚(pNP)和D-葡萄糖的释放。在碱性条件下测定的定量释放的对硝基苯酚是酶促活性的量度。在孵育10分钟后，通过加入1M碳酸钠来终止反应，并在405nm的波长下测定吸光度。利用对硝基苯酚的摩尔消光系数计算β-葡萄糖苷酶的活性。通过将10mM pNP储备溶液用100mM pH 4.400.1％BSA乙酸盐缓冲液稀释至pNP浓度为0.25mM、0.40mM、0.67mM和1.25mM，来制备对硝基苯酚校准线。底物是5.0mM pNP-BDG在乙酸盐缓冲液(100mM，pH 4.4)中的溶液。向3ml底物中加入200μl校准溶液和3ml 1M碳酸钠。使用乙酸盐缓冲液(100mM)作为空白测量在405nm下测量混合物的吸收。使用本领域已知的标准计算方案通过以下方式来计算pNP含量：绘制OD

浓缩的经预处理的碳水化合物材料是通过将玉米秸秆在186℃下孵育6.7分钟制成的。在热处理之前，将玉米秸秆用H

在工作体积为1升的被搅拌、pH受控并且温度受控的封闭反应器中进行酶促水解反应。在pH 4.5和62℃下进行每次水解。用水稀释所述浓缩的经预处理的碳水化合物材料，以获得最终浓度为17％(w/w)干物质的经预处理的碳水化合物材料。随后，用以下物质将pH调节至pH 4.5：

实验1：10％(w/w)NH

实验2：4M氢氧化钾溶液；

实验3：4M氢氧化钠溶液；

实验4：5M氢氧化钙溶液。

对于每次实验，在酶促水解期间使用相同的溶液来将pH维持在4.5。

将用于酶促水解的反应器以150rpm搅拌18小时，与此同时在62℃下通过氮气流(100ml/min)持续刷新顶部空间。随后，通过以下步骤开始水解反应：加入2.5mg踝节菌属埃默森蓝状菌纤维素酶混合物+300WBDG/g干物质。在水解24小时后，用空气流(100ml/min)交换氮气流(100ml/min)，并将搅拌速度提高到250rpm，从而导致反应混合物中的溶解氧(DO)水平≥70％(即0.111mol/m

在水解结束时，取出样本进行分析，所述样本立即以4000xg离心8分钟。将上清液经0.2μm尼龙滤器(Whatman)过滤，并在4℃下贮存，直至如下所述分析糖含量。

根据2008年1月的NREL技术报告NREL/TP-510-42623，使用配备有Aminex HPX-87H柱的HPLC测量稀释样本中的糖浓度。结果呈现于表1中。

表1中的结果清楚地表明，当在酶促水解之前和/或期间通过向经预处理的碳水化合物材料中加入碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物(例如氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钙)来控制经预处理的碳水化合物材料的pH时，葡萄糖和木糖的浓度较高。

木材酶促水解中的pH控制

在本实施例中显示了在用于制备对发酵酶生产过程有用的水解产物的酶促水解过程期间使用不同的滴定剂来将pH调节和保持在恒定值的效应。

根据如在WO 2011/000949中所述的方法产生踝节菌属埃默森蓝状菌纤维素酶混合物(即全发酵培养液)。此外，在实验中使用如在WO2012/000890中所述的踝节菌属埃默森蓝状菌β-葡糖苷酶。如实施例1所述测定纤维素酶混合物的蛋白质浓度和酶促β-葡糖苷酶活性(WBDG)。

经预处理的碳水化合物材料是从杨木通过实验室规模的蒸汽爆破设备在180℃下用H

在酶促水解之前，如下所述使用两种不同的滴定剂(实验1和实验2)将经预处理的碳水化合物材料(含有30％(w/w)干物质)的pH调节至pH 4.5。用水稀释所述经预处理的碳水化合物材料，以获得最终浓度为10％(w/w)干物质的经预处理的碳水化合物材料。在工作体积为1升的被搅拌、pH受控并且温度受控的封闭反应器中进行酶促水解反应。在pH 4.5和62℃下进行每次水解。

实验1：10％(w/w)NH

实验2：4M氢氧化钠溶液。

通过以下步骤开始水解反应：加入10mg/g干物质的踝节菌属埃默森蓝状菌纤维素酶混合物+1200WBDG/g干物质。总酶促水解时间为72小时。

在水解结束时，将所获得的水解产物用板式HS2000深层过滤器过滤，并在50℃下使用旋转蒸发器浓缩，直至浓度为约500g总糖/kg浓缩的水解产物。此后，将浓缩的水解产物杀菌以使它们准备好用于发酵过程，以产生真菌纤维素分解酶混合物。所述杀菌是通过在110℃下对水解产物进行高压灭菌10分钟完成的。结果呈现于表2中。

表2中的结果清楚地表明，在酶促水解之前和/或期间通过加入氨控制经预处理的碳水化合物材料的pH而制备的水解产物由于沉淀问题而无法在发酵过程中用于制备真菌纤维素分解酶混合物，而在酶促水解之前和/或期间通过加入碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物(例如氢氧化钠)控制经预处理的碳水化合物材料的pH而制备的水解产物适用于在发酵过程中制备真菌纤维素分解酶混合物。

当通过在120℃下将水解产物杀菌15分钟来进行杀菌时，也发现了类似的结果。

当废弃木材被用作浓缩的经预处理的碳水化合物材料时，也发现了类似的结果。

木材酶促水解中的pH控制

如实施例2中所述进行实验，但是在类似的苛刻条件下以中试规模进行预处理，在工作体积为4m

表3表明，当在水解之前和/或期间通过向经预处理的碳水化合物材料中加入碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物来控制经预处理的碳水化合物材料的pH时，大规模实验的结果类似于实施例2的结果，没有遇到沉淀问题。当在水解之前和/或期间通过向经预处理的碳水化合物材料中加入碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物来控制所述经预处理的碳水化合物材料的pH时，所获得的水解产物被在发酵过程中用于制备真菌纤维素分解酶混合物，并被发现易于发酵。

表1：在使用用于pH控制的不同溶液水解120小时后葡萄糖和木糖的浓度。

表2：用水解产物生产真菌纤维素分解酶混合物。

表3：用水解产物大规模生产真菌纤维素分解酶混合物。

*水解产物被成功地用于酶混合物生产中