一种实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法

摘要

本发明属于甘蔗早期抗病选育技术领域，尤其是实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，解决了现有技术存在的防治媒介蚜虫和清除田间病株对甘蔗花叶病的控制效果并不明显，抗病育种年限长，占用大量试验用地和后期资金的问题，所述实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，包括以下步骤：S1、甘蔗实生苗材料准备，S2、甘蔗实生苗移栽前假植，S3、花叶病病毒接种液准备，S4、花叶病病毒接种，S5、抗花叶病实生苗单株选育，本发明提出的实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，缩短了抗病育种年限，提高了抗病育种选择效率，节约了试验用地和后期资金的投入。

说明书

技术领域

本发明涉及甘蔗早期抗病选育技术领域，尤其涉及实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法。

背景技术

甘蔗花叶病毒(Sugarcane Mosaic Virus，SCMV)是马铃薯Y病毒属的重要成员之一，它所引起的甘蔗花叶病(Sugarcane Mosaic Disease)是一种重要的世界性甘蔗病毒性病害。近年来，在我国福建、广东、广西、云南、浙江、四川等省的甘蔗种植地区均发生普遍，造成了严重的危害。主要靠蚜虫、带病蔗种和蔗刀等收砍工具传播。感病植株新叶呈浅黄色斑驳或轻微褪绿条纹，老叶呈长条褪绿条纹或花叶。甘蔗感病后一般造成10-40％的产量损失，糖份下降。

目前，对甘蔗病毒病的主要防治措施，一是在引种时，对境外种苗进行检验检疫，排除带病种苗的传播，但随着世界甘蔗种质资源的广泛交流，检疫体系尚待完善，病毒检疫的形势非常严峻；二是选育抗病品种，进而推广应用；三是生产脱毒健康种苗进行种植，但脱毒种苗在田间种植数年后由于介体昆虫的传毒作用，许多植株又会感染病毒，因此脱毒种苗的防病作用具有一定的时限性。而其它如防治媒介蚜虫和清除田间病株对甘蔗花叶病的控制效果并不明显。

国内外大量的研究表明：对甘蔗花叶病最经济有效的控制方法，就是选育抗病优良品种。一是通过常规的育种途径，将筛选出的抗病优良甘蔗种质材料进行有性杂交，“五圃”制筛选后获得的优良品种(系)鉴定为抗病品种后推广应用，所需时间较长；二是通过生物技术手段，将抗病的外源基因导入甘蔗材料中，获得抗病的转基因植株作为抗源材料用于常规杂交育种中或直接推广应用于生产，但还需解决转入的外源基因正常表达的问题。基于上述陈述，本发明提出了实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的防治媒介蚜虫和清除田间病株对甘蔗花叶病的控制效果并不明显，抗病育种年限长，占用大量试验用地和后期资金的问题，而提出的实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法。

一种实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，包括以下步骤：

S1、根据育种目标开展甘蔗亲本组合选配，后进行有性杂交获得杂交种子。将杂交种子播种于装有甘蔗实生苗培养基质的容器内。控制基质室内温度22-36℃，并保持基质潮湿，适时开展病虫害防治，即可获得甘蔗实生苗；

S2、甘蔗实生苗移栽前假植：当步骤S1的甘蔗实生苗生长至2 片真叶时，分单株移栽到营养袋中假植，继续培育；

S3、花叶病病毒接种液准备：摘取患有花叶病甘蔗的新鲜病叶，用剪刀将病叶剪碎，得到碎病叶组组织，配置缓冲液，量取碎病叶组织重量的2-3倍的缓冲液与碎病叶组织混合后，进行研磨，研磨成浆后用纱布进行过滤，得到的滤液即为病毒接种液，装入喷雾瓶中，备用；

S4、花叶病病毒接种：当步骤S2假植培育的甘蔗实生苗生长至七片真叶时，在无降雨天，沿土表剪去生长点以上部分叶片，将步骤 S3中的花叶病病毒接种液通过喷雾瓶，将其喷洒在叶片创口上，这种方法与花叶病的传播方式接近，使花叶病病毒接种体沿伤口侵入植株，继续再营养带中培育花叶病病毒接种后的甘蔗实生苗；

S5、抗花叶病实生苗单株选育：在花叶病病毒接种20天后，发现并清除病苗和死苗，以后每隔一周检查1次，直至发病单株和死苗完全清除干净为止，得到剩余甘蔗实生苗单株即为抗花叶病的株系。

优选的，所述营养袋可根据后期生长需要选择12cm×14cm、 13cm×15cm或14cm×16cm。

优选的，所述步骤S3中的缓冲液为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6.5-7。

优选的，所述步骤S5中，将室温控制在22-27℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明提出的实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，在甘蔗实生苗移栽大田前，进行花叶病接种胁迫，根据植株表现，在甘蔗选育程序的第一阶段就淘汰感病单株，从而筛选出抗病单株。缩短抗病育种年限，提高抗病育种选择效率，节约了试验用地和后期资金的投入；

2、本发明提出的实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，花叶病毒接种方式接近自然传播方式，接种后抗病性差的甘蔗花叶病发病显著、灵敏度高，且重演性好，通过此方法选育出来的抗病株系抵抗力强，病感率低，降低了后期甘蔗种植的护理难度，提高了甘蔗的存活率和产量；

3、本发明提出的实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，可操作性强、接种效率高。该方法可服务于甘蔗品种选育机构，用于甘蔗抗花叶病的良种选育。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例一

本发明提出的一种实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，包括以下步骤：。

S1、甘蔗实生苗材料准备：

根据育种目标开展甘蔗亲本组合选配，后进行有性杂交获得杂交种子。将杂交种子播种于装有甘蔗实生苗培养基质的容器内。控制基质室内温度22-36℃，并保持基质潮湿，适时开展病虫害防治，即可获得甘蔗实生苗；

S2、甘蔗实生苗移栽前假植：当步骤S1的甘蔗实生苗生长至2 片真叶时，分单株移栽到营养袋中假植，继续培育；

S3、花叶病病毒接种液准备：摘取患有花叶病甘蔗的新鲜病叶，用剪刀将病叶剪碎，得到碎病叶组组织，配置缓冲液，量取碎病叶组织重量的2-3倍的缓冲液与碎病叶组织混合后，进行研磨，研磨成浆后用纱布进行过滤，得到的滤液即为病毒接种液，装入喷雾瓶中，备用；

S4、花叶病病毒接种：当步骤S2假植培育的甘蔗实生苗生长至七片真叶时，在无降雨天，沿土表剪去生长点以上部分叶片，将步骤 S3中的花叶病病毒接种液通过喷雾瓶，将其喷洒在叶片创口上，这种方法与花叶病的传播方式接近，使花叶病病毒接种体沿伤口侵入植株，继续再营养带中培育花叶病病毒接种后的甘蔗实生苗；

S5、抗花叶病实生苗单株选育：在花叶病病毒接种20天后，发现并清除病苗和死苗，以后每隔一周检查1次，直至发病单株和死苗完全清除干净为止，得到剩余甘蔗实生苗单株即为抗花叶病的株系。

本发明中，所述营养袋可根据后期生长需要选择12cm×14cm、13cm×15cm或14cm×16cm，所述步骤S3中的缓冲液为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6.5。

实施例二

本发明提出的一种实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，包括以下步骤：

S1、甘蔗实生苗材料准备：

根据育种目标开展甘蔗亲本组合选配，后进行有性杂交获得杂交种子。将杂交种子播种于装有甘蔗实生苗培养基质的容器内。控制基质室内温度22-36℃，并保持基质潮湿，适时开展病虫害防治，即可获得甘蔗实生苗；

S2、甘蔗实生苗移栽前假植：当步骤S1的甘蔗实生苗生长至2 片真叶时，分单株移栽到营养袋中假植，继续培育；

S3、花叶病病毒接种液准备：摘取患有花叶病甘蔗的新鲜病叶，用剪刀将病叶剪碎，得到碎病叶组组织，配置缓冲液，量取碎病叶组织重量的2-3倍的缓冲液与碎病叶组织混合后，进行研磨，研磨成浆后用纱布进行过滤，得到的滤液即为病毒接种液，装入喷雾瓶中，备用；

S4、花叶病病毒接种：当步骤S2假植培育的甘蔗实生苗生长至七片真叶时，在无降雨天，沿土表剪去生长点以上部分叶片，将步骤 S3中的花叶病病毒接种液通过喷雾瓶，将其喷洒在叶片创口上，这种方法与花叶病的传播方式接近，使花叶病病毒接种体沿伤口侵入植株，继续再营养带中培育花叶病病毒接种后的甘蔗实生苗；

S5、抗花叶病实生苗单株选育：在花叶病病毒接种20天后，发现并清除病苗和死苗，以后每隔一周检查1次，直至发病单株和死苗完全清除干净为止，得到剩余甘蔗实生苗单株即为抗花叶病的株系。

本发明中，所述营养袋可根据后期生长需要选择12cm×14cm、 13cm×15cm或14cm×16cm，所述步骤S3中的缓冲液为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6.8。

实施例三

本发明提出的一种实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，包括以下步骤：。

S1、甘蔗实生苗材料准备：

根据育种目标开展甘蔗亲本组合选配，后进行有性杂交获得杂交种子。将杂交种子播种于装有甘蔗实生苗培养基质的容器内。控制基质室内温度22-36℃，并保持基质潮湿，适时开展病虫害防治，即可获得甘蔗实生苗；

S2、甘蔗实生苗移栽前假植：当步骤S1的甘蔗实生苗生长至2 片真叶时，分单株移栽到营养袋中假植，继续培育；

S3、花叶病病毒接种液准备：摘取患有花叶病甘蔗的新鲜病叶，用剪刀将病叶剪碎，得到碎病叶组组织，配置缓冲液，量取碎病叶组织重量的2-3倍的缓冲液与碎病叶组织混合后，进行研磨，研磨成浆后用纱布进行过滤，得到的滤液即为病毒接种液，装入喷雾瓶中，备用；

S4、花叶病病毒接种：当步骤S2假植培育的甘蔗实生苗生长至七片真叶时，在无降雨天，沿土表剪去生长点以上部分叶片，将步骤 S3中的花叶病病毒接种液通过喷雾瓶，将其喷洒在叶片创口上，这种方法与花叶病的传播方式接近，使花叶病病毒接种体沿伤口侵入植株，继续再营养带中培育花叶病病毒接种后的甘蔗实生苗；

S5、抗花叶病实生苗单株选育：在花叶病病毒接种20天后，发现并清除病苗和死苗，以后每隔一周检查1次，直至发病单株和死苗完全清除干净为止，得到剩余甘蔗实生苗单株即为抗花叶病的株系。

本发明中，所述营养袋可根据后期生长需要选择12cm×14cm、 13cm×15cm或14cm×16cm，所述步骤S3中的缓冲液为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为7。

实验

1)实施例一、二、三选育得到的甘蔗实生苗和未经过选育的甘蔗实苗移栽大田种植后进行花叶病感抗观察实验

随机选取实施例一、二、三选育的甘蔗实生苗各15株，将它们移栽到同一块大田中进行种植，并用剪刀剪去甘蔗实生苗部分叶片的 1/3，并用棉条蘸取花叶病病毒液体涂抹在甘蔗实生苗的剪切口处，适时进行施肥维护管理，观察甘蔗是否感染花叶病，直到甘蔗成熟；感染花叶病的判断标准为：甘蔗叶片产生花叶现象，甘蔗花叶病抗性分级评价标准见表2(引用专利申请号为200810058994.7)，各组实验结果见表1。

表1：

表2：甘蔗花叶病抗病性分级评价标准

根据表1所示，实施例组选育的得到的甘蔗实生苗移栽大田种植后对花叶病病毒的抗病性级别为高抗或免疫，未经过选育的甘蔗对花叶病病毒的抗病性级别为感病，实施例组远优于未经过选育的甘蔗实生苗的抗病性，表明本发明提出的实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法选育得到的甘蔗实生苗具有较高的花叶病病毒抗病性级别。

综上所述，本发明提出的实生苗培育阶段花叶病抗性筛选方法，在甘蔗实生苗移栽大田前，进行花叶病接种胁迫，根据植株表现，在甘蔗选育程序的第一阶段就淘汰感病单株，从而筛选出抗病单株。缩短抗病育种年限，提高抗病育种选择效率，节约了试验用地和后期资金的投入，花叶病毒接种方式接近自然传播方式，接种后抗病性差的甘蔗花叶病发病显著、灵敏度高，且重演性好，通过此方法选育出来的抗病株系抵抗力强，病感率低，降低了后期甘蔗种植的护理难度，提高了甘蔗的存活率和产量，可操作性强、接种效率高。该方法可服务于甘蔗品种选育机构，用于甘蔗抗花叶病的良种选育。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。