一种远缘杂交创制棉花新种质的方法

摘要

本发明属于棉花遗传育种技术领域，公开了一种远缘杂交创制棉花新种质的方法，所述远缘杂交创制棉花新种质的方法包括：将棉花育种材料种子进行预处理，点播，移植，田间管理；将花粉置于冷等离子体处理机中进行冷等离子体处理；进行种间远缘杂交，获得远缘杂交后代；检测单倍体植株，进行染色体加倍，获得纯合的远缘杂交后代；确定亲缘关系及核心纯合杂交亲本；获得抗性植株；通过分子标记辅助选择手段筛选得到优良棉花杂交新种质。本发明采用远缘杂交和快速纯合相结合的育种方式，加快目标性状的稳定；通过应用先进的冷等离子体处理技术，可提高棉花花粉活性、增强配合力、提高远缘杂交亲和性和结实率，为多类型品种的选育创造条件。

说明书

技术领域

本发明属于棉花遗传育种技术领域，尤其涉及一种远缘杂交创制棉花新种质的方法。

背景技术

目前，棉花(Gossypium spp.)锦葵科棉属植物，属于常异花授粉作物。我国自从60年代开始自育品种以来，逐渐以自育良种取代由国外引进品种，改变了依赖引进外国品种的局面。育种方法由自然变异群体中系统育种，进入杂交育种。杂交育种方法由单交进入复交，以及系间互交。随着育种工作的深入发展，农作物栽培种的遗传资源利用日益不能满足育种需要。育种家们越来越多地把目光转向对其近缘种、属有益基因的挖掘与利用。

种质资源及其创新是新品种选育的基础工作。但由于占世界棉花产量90％的陆地棉栽培种遗传基础过于狭窄，导致目前棉花越来越难选育出突破性的优异品种。我国以往培育的棉花品种，追溯系谱来源，均来自美国引进品种，这些品种最早来源于墨西哥的一个陆地棉家系。因此，采取多种途径发掘优良种质资源基因来丰富我国棉花种质资源的遗传多样性已刻不容缓。但是，现有棉花育种方式繁琐，获得的棉花种质较差，却存在不亲和、结实差、后代生活力差以及后代不育等种间杂交问题。因此，急需一种新的远缘杂交创制棉花新种质的方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有棉花育种方式繁琐，获得的棉花种质较差，却存在不亲和、结实差、后代生活力差以及后代不育等种间杂交问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种远缘杂交创制棉花新种质的方法。

本发明是这样实现的，一种远缘杂交创制棉花新种质的方法，所述远缘杂交创制棉花新种质的方法包括以下步骤：

步骤一，将棉花育种材料种子进行预处理；将经过预处理的棉花育种材料种子点播于营养钵中，培育3-5天后，移植于大田中，并按大田普通棉花的田间管理模式进行管理；

步骤二，将棉花育种材料中用于授粉的将要开花的亲本花朵摘下，去掉花瓣露出花粉置于冷等离子体处理机中，进行冷等离子体处理；

步骤三，将冷等离子体处理的花粉分别与陆地棉、海岛棉、野生棉和中棉进行种间远缘杂交，获得远缘杂交后代F

步骤四，以远缘杂交后代F

步骤五，以半配合材料作母本，与步骤四得到的所述远缘杂交后代F

步骤六，确定纯合的远缘杂交后代中种质资源间的亲缘关系，并根据亲本组配和目标性状，确定核心纯合杂交亲本；

所述确定纯合的远缘杂交后代中种质资源间的亲缘关系，包括：

(6.1)从纯合的远缘杂交后代的任何组织器官中提取DNA，得到远缘杂交后代基因池DNA；

(6.2)以远缘杂交后代基因池DNA为模板，分别构建棉花纯合的远缘杂交后代的DNA指纹图谱以及标准DNA指纹图谱；

所述构建棉花纯合的远缘杂交后代的DNA指纹图谱包括：

基于提取的远缘杂交后代基因池DNA，设计和合成含限制性核酸内切酶，即同时含稀有切割酶和频繁切割酶酶切位点的人工合成的DNA双链接头，用稀有切割酶和频繁切割酶联合酶切远缘杂交后代基因池DNA，并与已设计相应的人工合成的DNA双链接头连接以制备AFLP模板DNA，根据人工合成的DNA接头碱基的序列，设计3′端带有3个选择碱基的引物作放射5′末端标记，进行PCR扩增，PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获取放射自显影DNA指纹图谱，经计算机图像扫描仪扫描，即可得到棉花纯合的远缘杂交后代的DNA指纹图谱；

(6.3)将棉花纯合的远缘杂交后代的DNA指纹图谱与标准DNA指纹图谱进行对比，通过AFLP-PCR指纹图谱检测技术以评价、鉴定创新的种质资源，确定种质资源间的亲缘关系；

步骤七，将所述核心纯合杂交亲本与抗性品种杂交，将得到的子代再与核心纯合杂交亲本杂交，后代再自交、回交，将回交得到的后代种植后，进行基因表达与抗性筛选，获得抗性植株；

步骤八，通过分子标记辅助选择手段筛选目标基因已经导入的抗性植株，选出性状优良的自交系作为父母本，杂交测配得到棉花杂交组合，通过抗性鉴定试验及品比试验，最终得到优良棉花杂交新种质。

进一步，步骤一中，所述棉花育种材料为LZ169、LZ158、LZ122、LZ120、LZ319、LZ347、LZ75、LZ32中的任一品种。

进一步，步骤一中，所述将棉花育种材料种子进行预处理，包括：

(1)将棉花育种材料种子经硫酸脱绒后，选择籽粒饱满成熟的棉花种子；

(2)对所有选择出的棉花种子先利用5％的次氯酸钠溶液浸泡10-15min，然后用纯水冲洗干净；

(3)用无菌水对消毒后的棉花种子进行浸泡，解除种子休眠并催芽处理。

进一步，步骤一中，所述移植包括：

1)在准备移栽的大田当中，挖出25-35cm的深坑，坑大小以能够将营养钵完全放入为宜，于白天温度为18-27℃进行移栽；

2)去除营养钵周围的胶带，将营养钵放入深坑中，将营养钵四周的土壤填埋好，进行滴灌，再覆上薄膜；

3)移植2-4天后，子叶显露后及时进行放苗处理；

进一步，步骤二中，所述冷等离子体处理花粉的方法为：在50-350W的处理剂量下对棉花花粉进行8-16s的非电离辐射处理。

进一步，步骤五中，采用秋水仙碱以使所述染色体加倍，所述秋水仙碱的浓度为0.1％-0.3％。

进一步，步骤七中，所述抗性植株的筛选，包括：

幼苗期，采用浓度阈值为1200-1500ppm的卡那霉素处理，去除不抗性植株；幼苗长大时，采用浓度阈值为2200-2500ppm的卡那霉素处理，选出20％-25％的抗性植株。

进一步，步骤八中，所述通过分子标记辅助选择手段筛选目标基因已经导入的抗性植株，包括：

(1)提取亲本DNA；

(2)合成NAU1167与NAU5467引物；

(3)利用引物同时扩增抗性植株群体；

(4)扩增产物电泳检测分析基因型；

(5)将抗性植株群体中与目标基因型一致的拟定为抗性目标株系。

进一步，所述扩增产物电泳检测分析基因型包括：

取5μLPCR扩增产物采用琼脂糖浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，Maker6μL，电压为100V条件下电泳30-40min，在凝胶成像仪下分析扩增产物基因型。

本发明的另一目的在于提供一种所述的远缘杂交创制棉花新种质的方法在创制棉花新种质中的应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法，采用远缘杂交和快速纯合相结合的育种方式，加快目标性状的稳定；通过应用先进的冷等离子体处理技术，选择合适剂量冷等离子体处理花粉，可提高棉花花粉活性、增强配合力、提高远缘杂交亲和性和结实率、提高远缘杂交F

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的将棉花育种材料种子进行预处理的方法流程图。

图3是本发明实施例提供的移植方法流程图。

图4是本发明实施例提供的确定纯合的远缘杂交后代中种质资源间的亲缘关系的方法流程图。

图5是本发明实施例提供的通过分子标记辅助选择手段筛选目标基因已经导入的抗性植株的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种远缘杂交创制棉花新种质的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法包括以下步骤：

S101，将棉花育种材料种子进行预处理；将经过预处理的棉花育种材料种子点播于营养钵中，培育3-5天后，移植于大田中，并按大田普通棉花的田间管理模式进行管理；

S102，将棉花育种材料中用于授粉的将要开花的亲本花朵摘下，去掉花瓣露出花粉置于冷等离子体处理机中，进行冷等离子体处理；

S103，将冷等离子体处理的花粉分别与陆地棉、海岛棉、野生棉和中棉进行种间远缘杂交，获得远缘杂交后代F

S104，以远缘杂交后代F

S105，以半配合材料作母本，与所述远缘杂交后代F

S106，确定纯合的远缘杂交后代中种质资源间的亲缘关系，并根据亲本组配和目标性状，确定核心纯合杂交亲本；

S107，将所述核心纯合杂交亲本与抗性品种杂交，将得到的子代再与核心纯合杂交亲本杂交，后代再自交、回交，将回交得到的后代种植后，进行基因表达与抗性筛选，获得抗性植株；

S108，通过分子标记辅助选择手段筛选目标基因已经导入的抗性植株，选出性状优良的自交系作为父母本，杂交测配得到棉花杂交组合，通过抗性鉴定试验及品比试验，最终得到优良棉花杂交新种质。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法如图1所示，作为优选实施例，本发明实施例提供的棉花育种材料为LZ169、LZ158、LZ122、LZ120、LZ319、LZ347、LZ75、LZ32中的任一品种。

实施例2

本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法如图1所示，作为优选实施例，如图2所示，本发明实施例提供的将棉花育种材料种子进行预处理，包括：

S201，将棉花育种材料种子经硫酸脱绒后，选择籽粒饱满成熟的棉花种子；

S202，对所有选择出的棉花种子先利用5％的次氯酸钠溶液浸泡10-15min，然后用纯水冲洗干净；

S203，用无菌水对消毒后的棉花种子进行浸泡，解除种子休眠并催芽处理。

实施例3

本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法如图1所示，作为优选实施例，如图3所示，本发明实施例提供的移植，包括：

S301，在准备移栽的大田当中，挖出25-35cm的深坑，坑大小以能够将营养钵完全放入为宜，于白天温度为18-27℃进行移栽；

S302，去除营养钵周围的胶带，将营养钵放入深坑中，将营养钵四周的土壤填埋好，进行滴灌，再覆上薄膜；

S303，移植2-4天后，子叶显露后及时进行放苗处理。

实施例4

本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法如图1所示，作为优选实施例，本发明实施例提供的冷等离子体处理花粉的方法为：在50-350W的处理剂量下对棉花花粉进行8-16s的非电离辐射处理。

实施例5

本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法如图1所示，作为优选实施例，本发明实施例提供的采用秋水仙碱以使所述染色体加倍，所述秋水仙碱的浓度为0.1％-0.3％。

实施例6

本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法如图1所示，作为优选实施例，如图4所示，本发明实施例提供的确定纯合的远缘杂交后代中种质资源间的亲缘关系，包括：

S401，从纯合的远缘杂交后代的任何组织器官中提取DNA，得到远缘杂交后代基因池DNA；

S402，以远缘杂交后代基因池DNA为模板，分别构建棉花纯合的远缘杂交后代的DNA指纹图谱以及标准DNA指纹图谱；

S403，将棉花纯合的远缘杂交后代的DNA指纹图谱与标准DNA指纹图谱进行对比，通过AFLP-PCR指纹图谱检测技术以评价、鉴定创新的种质资源，确定种质资源间的亲缘关系。

本发明实施例提供的构建棉花纯合的远缘杂交后代的DNA指纹图谱包括：

基于提取的远缘杂交后代基因池DNA，设计和合成含限制性核酸内切酶，即同时含稀有切割酶和频繁切割酶酶切位点的人工合成的DNA双链接头，用稀有切割酶和频繁切割酶联合酶切远缘杂交后代基因池DNA，并与已设计相应的人工合成的DNA双链接头连接以制备AFLP模板DNA，根据人工合成的DNA接头碱基的序列，设计3′端带有3个选择碱基的引物作放射5′末端标记，进行PCR扩增，PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获取放射自显影DNA指纹图谱，经计算机图像扫描仪扫描，即可得到棉花纯合的远缘杂交后代的DNA指纹图谱。

实施例7

本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法如图1所示，作为优选实施例，本发明实施例提供的抗性植株的筛选，包括：幼苗期，采用浓度阈值为1200-1500ppm的卡那霉素处理，去除不抗性植株；幼苗长大时，采用浓度阈值为2200-2500ppm的卡那霉素处理，选出20％-25％的抗性植株。

实施例8

本发明实施例提供的远缘杂交创制棉花新种质的方法如图1所示，作为优选实施例，如图5所示，本发明实施例提供的通过分子标记辅助选择手段筛选目标基因已经导入的抗性植株，包括：

S501，提取亲本DNA；

S502，合成NAU1167与NAU5467引物；

S503，利用引物同时扩增抗性植株群体；

S504，扩增产物电泳检测分析基因型；

S505，将抗性植株群体中与目标基因型一致的拟定为抗性目标株系。

本发明实施例提供的扩增产物电泳检测分析基因型包括：

取5μLPCR扩增产物采用琼脂糖浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，Maker6μL，电压为100V条件下电泳30-40min，在凝胶成像仪下分析扩增产物基因型。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。