一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法

摘要

本发明公开了一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法，包括制备血小板裂解液、人脐带MSCs分离及培养、人脐带MSCs移植和疗效评定。本发明的有益效果是：确保制备细胞的活性，保证细胞存活数量可以用于实验研究，且防止部分细胞残余在培养瓶内，提高细胞计数的准确性，确认了MSCs治疗能明显改善膝骨关节炎患者疼痛，且效果优于传统的透明质酸治疗法，根据实验数据，可以选出最佳治疗次数，为今后在人脐带间间充质干细胞治疗膝骨关节炎提供科学依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种间充质干细胞制剂研究方法，具体为一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法，属于化学医疗技术领域。

背景技术

骨关节炎是一种严重危害人类健康的慢性骨关节疾病，细胞治疗骨关节炎近年来发展较快，并得到了广泛关注，脐带来源的间间充质干细胞治疗骨关节炎既具有其他来源间间充质干细胞扩增分化容易，具有抗炎和招募作用等优势，又具有细胞年轻化、获得量大、无伦理问题、取材过程无痛苦、高增殖特性、多能分化特性、低免疫源性、无致瘤性等特点，是目前临床细胞治疗最常用的种子细胞。

间间充质干细胞 中间间充质干细胞治疗骨关节炎的优势在于具有组织来源广泛、扩增分化容易、分化的细胞具有组织特异性、具有抗炎和招募作用、低成瘤风险、免疫原性低等特点，但目前的临床随机对照试验数量有限，尚需要进一步的临床研究证实其疗效。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法，包括以下步骤：

步骤A：制备血小板裂解液，取患者静脉血300ml后，离心获取血小板裂解液，-80℃低温保存，备用；

步骤B：人脐带MSCs分离及培养，在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净，剪成小于1mm

步骤C：人脐带MSCs移植，将受试者随机分为治疗组和对照组各10例，两组在性别构成、年龄及病程等方面无显著学差异，治疗组每月注射2×10

步骤D：疗效评定，进行WOMAC总评分和膝关节lequesne指数评分。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤B中，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，开始进行传代操作，轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来，将含有组织块的培养上清液弃掉，用PBS冲洗培养瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×10

作为本发明再进一步的方案：所述步骤C中，每次移植前1周关节腔注射4ml解冻后激活的血小板裂解液，移植前选择存活率不低于90%，且无EBV、HBV、HCV、HIV污染的细胞进行复苏且临用前行胰蛋白酶收集、激活的血小板裂解液重悬处理后混匀分装。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤C中，在进行膝关节注射时，常规消毒、铺洞巾，持5ml无菌注射器进入关节腔后抽出适量关节液，保留针头，拔出针筒，连接上装有混匀MSCs的针筒，缓慢注4ml，术毕无菌纱布压迫覆盖针眼，仰卧20min，期间间断屈伸膝关节数十次，MSCs移植1晚后再次注射4ml解冻后激活的血小板裂解液。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤D中，利用SPSS17.0统计软件进行数据分析，治疗前后均在医生指导下完成10mm的VAS24项WOMAC量表评分，但不得替代患者做评分，详细记录各项分数，且治疗前后分别进行膝关节Lequesne指数评分，用于膝关节骨关节炎的严重程度、疾病活动及膝关节功能的判断。

本发明的有益效果是：该用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法设计合理，步骤B中，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，开始进行传代操作。轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来，将含有组织块的培养上清液弃掉，用PBS冲洗培养瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×10

附图说明

图1为本发明结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法，包括以下步骤：

步骤A：制备血小板裂解液，取患者静脉血300ml后，离心获取血小板裂解液，-80℃低温保存，备用；

步骤B：人脐带MSCs分离及培养，在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净，剪成小于1mm

步骤C：人脐带MSCs移植，将受试者随机分为治疗组和对照组各10例，两组在性别构成、年龄及病程等方面无显著学差异，治疗组每月注射2×10

步骤D：疗效评定，进行WOMAC总评分和膝关节lequesne指数评分。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤B中，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，开始进行传代操作，轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来，将含有组织块的培养上清液弃掉，用PBS冲洗培养瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×10

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤C中，每次移植前1周关节腔注射4ml解冻后激活的血小板裂解液，移植前选择存活率不低于90%，且无EBV、HBV、HCV、HIV污染的细胞进行复苏且临用前行胰蛋白酶收集、激活的血小板裂解液重悬处理后混匀分装，方便区分分装的激活的血小板裂解液，且保证移植细胞的活性，提高实验研究数据的准确性。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤C中，在进行膝关节注射时，常规消毒、铺洞巾，持5ml无菌注射器进入关节腔后抽出适量关节液，保留针头，拔出针筒，连接上装有混匀MSCs的针筒，缓慢注4ml，术毕无菌纱布压迫覆盖针眼，仰卧20min，期间间断屈伸膝关节数十次，MSCs移植1晚后再次注射4ml解冻后激活的血小板裂解液，减少整个抽取关节液和注射血小板裂解液过程中的杂质干扰，保证无菌操作，避免偶然误差。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤D中，利用SPSS17.0统计软件进行数据分析，治疗前后均在医生指导下完成10mm的VAS24项WOMAC量表评分，但不得替代患者做评分，详细记录各项分数，且治疗前后分别进行膝关节Lequesne指数评分，用于膝关节骨关节炎的严重程度、疾病活动及膝关节功能的判断，方便根据前后评分的对比，判断该间充质干细胞制剂对于治疗膝骨关节炎是否有效，使得整个数据更加有说服力。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。