一株枯草芽孢杆菌JX-20菌株及其应用

摘要

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌JX‑20菌株及其应用，涉及微生物肥料技术领域。本发明所述JX‑20菌株已完成保藏，保藏编号为GDMCCNo:61546。本发明所述JX‑20菌株具有拮抗病原微生物、修复和优化土壤有益微生物组群生态和解磷、解钾、增加作物可利用性营养、提高作物免疫和抗逆性、促进作物健康生长、增产提质的有益效果，可将所述JX‑20菌株用于制备植物抗菌剂和抗线虫剂以及促进植物生长和提高植物抗性。本发明还提供了一种基于上述JX‑20菌株的微生物肥料，具有拮抗植物病原物、修复和改善环境有益微生物组群生态、合理提供和平衡植物可利用的营养元素、促进植物健康生长的作用，可用于各种类型的土壤和不同的农作物及生育期。

说明书

技术领域

本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌JX-20菌株及其应用。

背景技术

我国人口多、耕地少，为了满足人民的食品需求，不得不追求单位面积的高产。为了实现这个目标，保护地种植、提高复种指数、连作、加大化肥和农药的投入成为追求和保障农产品高产的重要措施。然而，土居病原物增加和土壤营养恶化等引起的连作障碍限制了农作物种植业可持续发展，以致化肥和农药用量继续增加，严重威胁着生态环境安全和食品品质安全。

化肥的长期大量使用，导致土壤板结、植物病原微生物积累、有益微生物生态群落改变、N、P、K大量营养元素流失，土壤固定的P和K等植物营养元素难以被植物吸收，以致进一步加大化肥用量，导致土壤环境持续恶化。随着对植物营养需求规律和营养吸收利用障碍及机制的认识，通过现代生物技术研发和使用微生物肥料，使土壤和植物叶围能够修复和保持良好微生物组群，并利用微生物的生命活动和代谢产物如多肽、氨基酸、寡糖或多糖、脂肪酸、生物素等为植物提供直接的生物营养成分，利用微生物的分泌产物如蛋白酶等及改变土壤理化性质，解离被土壤固定的植物营养元素，促进植物对营养的吸收和利用，利用微生物肥料所产生的抗菌肽等生物活性物质对植物病原微生物的拮抗作用和对植物防卫反应的诱导作用，减少病原物的侵染和增加作物的抗病性，已经成为改善微生物生态环境，提高植物对营养的吸收利用，促进健康生长，减少化肥农药用量的重大需求和研究热点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一株枯草芽孢杆菌JX-20菌株及其应用，所述JX-20菌株具有拮抗病原微生物、修复土壤微生物生态和解磷解钾、增加作物可利用性营养、提高作物免疫和抗逆性、促进作物健康生长、增产提质的生物效应，可应用于制备安全、高效的生物肥料和生物农药。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JX-20菌株，所述JX-20菌株的保藏编号为GDMCC No:61546。

优选的，所述JX-20菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述JX-20菌株或所述JX-20菌株的发酵物在制备植物抗菌剂和抗线虫剂中的应用。

优选的，所述植物抗菌剂的抗菌谱包括黄瓜角斑病菌(Xanthomonascampestris)、番茄青枯病菌(Pseudomons syringae)、大白菜软腐病菌(Erwiniacarotovora)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、小麦赤霉病菌(Fusarium spp.)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、茄黄萎病菌(Verticilliumdehliae)、甜瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)和小麦白粉病菌(Blumeriagraminis)；

所述抗线虫剂的抗虫谱包括南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)。

优选的，所述发酵物为将所述JX-20菌株在NB培养基中发酵48～72h制备得到，所述NB培养基包括以下浓度的组分：蔗糖15g/L，聚蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和牛肉膏3g/L。

本发明还提供了上述JX-20菌株或所述JX-20菌株的发酵物在促进植物生长和/或提高植物抗性中的应用。

本发明还提供了一种基于上述JX-20菌株的微生物肥料，所述微生物肥料中包括所述枯草芽孢杆菌JX-20菌株的发酵菌液，还包括大量元素和微量元素；

所述发酵菌液包括芽孢50亿～6000亿个/g微生物肥料和占所述微生物肥料质量0.3％～1.5％的次级代谢产物；

所述大量元素的总质量为所述微生物肥料质量的5％～50％，所述微量元素的质量为所述微生物肥料质量的0.1％～1％；

所述大量元素包括N、P和K；

所述微量元素包括钙、镁、锌、铜、硫、铁、硼、锰、氯和钠。

优选的，所述枯草芽孢杆菌JX-20菌株的次级代谢产物包括寡糖、脂肪酸、氨基酸、多肽和生物素中的一种或多种的混合。

优选的，所述微生物肥料中还包括存活载体和助剂，所述存活载体的质量为所述微生物肥料质量的10％～85％，所述助剂的质量为所述微生物肥料质量的2％～15％；

所述存活载体选自水、凹凸棒土、高岭土、轻质碳酸钙、硫酸铵、硼酸盐、乙二胺四乙酸盐、三聚氰胺、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、玉米粉、豆粕、腐殖质、厩肥、人粪尿、禽粪、堆肥和滑石粉中的一种或多种；

所述助剂选自乙二醇、丙二醇、NNO-1、NNO-7、黄原胶、聚乙二醇、甘油、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、硫酸铵、尿素、烷基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯基醚磷酸酯、脂肪酸聚氧乙烯酯、苯甲酸、月桂酸、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素、聚乙烯醇和亚铁氰酸钾中的一种或多种。

本发明还提供了一种利用上述微生物肥料提高农作物产量和抗病虫害能力的方法，包括以下步骤：将所述微生物肥料作为基肥或追肥或叶面肥，按照15～450kg/公顷的用量施于田内；

或每100kg作物种子用10～3000g所述微生物肥料进行拌种或包衣。

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌JX-20菌株，所述JX-20菌株具有拮抗病原微生物、修复和优化土壤有益微生物组群生态和解磷、解钾、增加作物可利用性营养、提高作物免疫和抗逆性、促进作物健康生长、增产提质的有益效果，代谢产生的寡糖(胞外多糖，EPS)、脂肪酸、氨基酸、多肽、生物素不仅具有生物肥效，而且具有拮抗病原微生物、诱导作物抗病性和促进作物健康生长的生物效应，因此可将所述JX-20菌株用于制备植物抗菌剂和抗线虫剂以及促进植物生长和提高植物抗性。

本发明还提供了一种基于上述JX-20菌株的微生物肥料，所述微生物肥料突破了微生物在运储过程中容易死亡、导致生物效应降低或不稳定的技术障碍，大幅度提高了发酵产物中的芽孢和寡糖、脂肪酸、氨基酸、多肽、生物素的含量，确保了本微生物肥料拮抗植物病原物、修复和改善环境有益微生物组群生态、合理提供和平衡植物可利用的营养元素、促进植物健康生长的作用。本发明的枯草芽孢杆菌微生物肥料用途广，可用于各种类型的土壤和不同的农作物及生育期，施用方法多样，不仅可以在作物播种、移栽之前施用，也可以在生长期施用。

生物保藏信息

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JX-20，于2021年3月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO：61546。

具体实施方式

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JX-20菌株，所述JX-20菌株的保藏编号为GDMCCNo:61546。

本发明所述JX-20菌株的16S rDNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。本发明所述JX-20菌株及其代谢产物对病原物具有广谱抗生作用，降低土壤、叶面和种子中的病原真菌、细菌和线虫群体数量，修复和优化土壤环境微生物生态，抑制植物病原物的生长发育和侵染危害，诱导植物防卫反应，促进植物健康生长，尤其是对黄瓜角斑病菌(Xanthomonascampestris)、番茄青枯病菌(Pseudomons syringae)、大白菜软腐病菌(Erwiniacarotovora)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、茄黄萎病菌(Verticillium dehliae)和甜瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)等15种病原细菌和真菌能够产生直径在15.5mm～24.5mm之间的抑菌圈，其中对油菜菌核病菌和小麦纹枯病菌的拮抗能力最强，抑菌圈直径达20.3～24.5mm；对草莓灰霉病菌的拮抗能力最弱，但抑菌圈仍达到15.5mm。同时，JX-20的NB发酵物还对小麦白粉病菌具有预防和治疗作用，而且还能显著抑制番茄和黄瓜根结线虫(Meloidogyne incognita)卵囊孵化。本发明所述NB发酵物优选为将所述JX-20菌株在NB培养基中发酵48～72h，所述NB培养基中包括以下浓度的组分：蔗糖15g/L，聚蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和牛肉膏3g/L。本发明所述发酵的温度优选为28℃，在所述发酵优选在摇床上进行，所述摇床的震荡频率优选为150rpm。

本发明还提供了上述JX-20菌株或所述JX-20菌株的发酵物在制备植物抗菌剂和抗线虫剂中的应用。

本发明所述植物抗菌剂的抗菌谱优选包括黄瓜角斑病菌(Xanthomonascampestris)、番茄青枯病菌(Pseudomons syringae)、大白菜软腐病菌(Erwiniacarotovora)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum，F.asiaticum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、茄黄萎病菌(Verticillium dehliae)、甜瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)和小麦白粉病菌(Blumeria graminis)；所述抗线虫剂的抗虫谱优选包括南方根结线虫。本发明所述发酵液的制备方法优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了上述JX-20菌株或所述JX-20菌株的发酵物在促进植物生长和/或提高植物抗性中的应用。

本发明所述JX-20菌株的发酵物的制备方法优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述JX-20菌株具有解磷、解钾和固氮能力，其发酵物对小麦、油菜和黄瓜苗期的生长具有明显的促进作用，同时还能提高对病虫害等的抗性。

本发明还提供了一种基于上述JX-20菌株的微生物肥料，所述微生物肥料中包括所述枯草芽孢杆菌JX-20菌株的发酵菌液，还包括大量元素和微量元素；所述发酵菌液包括芽孢50亿～6000亿个/g微生物肥料和占所述微生物肥料质量0.3％～1.5％的次级代谢产物；所述大量元素的总质量为所述微生物肥料质量的5％～50％，所述微量元素的质量为所述微生物肥料质量的0.1％～1％；所述大量元素包括N、P和K；所述微量元素包括钙、镁、锌、铜、硫、铁、硼、锰、氯和钠。

本发明对所述芽孢的制备方法并没有特殊限定，优选利用所述JX-20菌株在NB培养基中进行发酵即可。本发明在所述发酵过程中，还会产生次级代谢产物，所述次级代谢产物优选包括寡糖、脂肪酸、氨基酸、多肽和生物素中，所述寡糖优选包括黄原胶、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡糖醛酸。本发明所述生物素又称维生素H、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族，对植物生长具有调控作用。本发明所述微生物肥料中N、P和K的总质量为所述微生物肥料的5％～50％，且所述N、P和K的比值优选为(6～45)：(6～12)：6。本发明所述次级代谢产物能够固N和解离被土壤固定的P和K离子，增加植物对P和K营养元素的吸收和利用。

本发明所述微生物肥料中N、P和K的来源优选包括枯草芽孢杆菌JX-20发酵产物和选自于硝酸铵、氯化铵、碳酸氢铵、尿素、硫酸铵、三聚氰胺、磷酸钙、重过磷酸钙、富过磷酸钙、磷酸铵、磷矿粉、钙镁磷肥、磷酸钙、硫酸钾、氯化钾、硝酸钾、亚铁氰化钾、磷酸一钾、磷酸二氢钾、钾石烟、钾镁盐、亚铁氰酸钾、硝酸钙、硫酸铜、硫酸镁、硫酸锌、氯化锌、硝酸锰、氯化锰、硫酸铁、硼酸盐、氯化钠、乙二胺四乙酸盐、玉米粉、豆粕、草木灰、人粪尿、厩肥、堆肥、绿肥、饼肥、沼气肥、腐殖质中的1种或多种无机肥料和/或有机肥料。本发明所述微量元素优选来自磷酸钙、重过磷酸钙、富过磷酸钙、钾镁盐、亚铁氰酸钾、硝酸钙、硫酸铜、硫酸镁、硫酸锌、氯化锌、硝酸锰、氯化锰、硫酸铁、硼酸盐和氯化钠中的一种或多种的混合，且所述微生物肥料中，各微量元素等质量混合。

本发明所述微生物肥料中优选还包括存活载体和助剂，所述存活载体的质量优选为所述微生物肥料质量的10％～85％，所述助剂的质量优选为所述微生物肥料质量的2％～15％；所述存活载体优选选自水、凹凸棒土、高岭土、轻质碳酸钙、硫酸铵、硼酸盐、乙二胺四乙酸盐、三聚氰胺、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、玉米粉、豆粕、腐殖质、厩肥、人粪尿、禽粪、堆肥和滑石粉中的一种或多种；所述助剂优选选自选自乙二醇、丙二醇、NNO-1、NNO-7、黄原胶、聚乙二醇、甘油、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、硫酸铵、尿素、烷基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯基醚磷酸酯、脂肪酸聚氧乙烯酯、苯甲酸、月桂酸、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素、聚乙烯醇和亚铁氰酸钾中的一种或多种。

本发明对所述微生物肥料的剂型并没有特殊限定，优选包括片剂、粒剂、颗粒剂、水分散颗粒剂、粉剂、可湿性粉剂、干悬剂、悬浮剂、种衣剂或水剂。

本发明还提供了一种利用上述微生物肥料提高农作物产量和抗病虫害能力的方法，包括以下步骤：将所述微生物肥料作为基肥或追肥或叶面肥，按照15～450kg/公顷的用量施于田内；

或每100kg作物种子用10～3000g所述微生物肥料进行拌种或包衣。

本发明所述微生物肥料可在植物栽种前或栽种时或植物生长期按每公顷使用所述微生物肥料15～450kg，进行撒施、穴施、沟施，或按照1∶200～1∶20000兑水稀释后浇灌、滴灌或喷施；或在播前按每100kg作物种子用10～3000g所述微生物肥料进行拌种或包衣。

下面结合实施例对本发明提供的一株枯草芽孢杆菌JX-20菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

枯草芽孢杆菌JX-20菌株来源和鉴定

1、JX-20菌株来源与筛选

采用平板稀释法从日光温室种植番茄、黄瓜的土壤中分离、在固体培养基平板上与水稻白叶枯病原细菌和油菜菌核病菌对峙培养、在含难溶性磷酸盐Ca

2、JX-20菌株鉴定

(1)生理生化鉴定。参照细菌鉴定的传统方法，对照伯杰细菌鉴定手册(第八版)中有关枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的生理生化特征，测定了13项JX-20的生理生化特征，结果与Bacillus subtilis的生理生化特征完全相同(表1)。因此，JX-20可以鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

表1 JX-20的生理生化特性实验结果与Bacillus subtilis特性比较

注：“+”为反应呈阳性或可以生长、利用；“－”为反应呈阴性或者不可以生长、利用。

(2)16S rDNA序列及其同源性鉴定。进一步采用现代分子生物学鉴定技术，以细菌的通用引物27F和1492R从菌株JX-20的基因组中扩增得到大小约为1500bp的16S rDNA片段，把该片段克隆到PMD19-T simple载体上，经测序获得该16S rDNA片段为1505bp的全序列。在NCBI上进行BLAST同源性比对，发现该序列与Bacillus subtilis种的20个菌株的16SrDNA的序列同源性达到100％，其中登陆号为DQ444283.1的Bacillus subtilis strainYJ001菌株的16S rDNA序列大小为1511bp，与JX-20的16S rDNA的大小最接近，它们的序列比对同源性也达到了100％，结果进一步鉴定JX-20菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

实施例2

枯草芽孢杆菌JX-20菌株的生物学特性

1、JX-20的抗生生物活性

对从不同作物上分离鉴定的病原物包括黄瓜角斑病菌(Xanthomonascampestris)、番茄青枯病菌(Pseudomons syringae)、大白菜软腐病菌(Erwiniacarotovora)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum，F.asiaticum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、茄黄萎病菌(Verticillium dehliae)和甜瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)等15种可培养植物病原细菌和真菌在固体培养基上进行对峙培养(病菌菌落边缘制取的5mm直径菌碟放置在PDA平板中央，然后在距离该菌碟两对角线3mm处放置4个牛津杯，再取100μL各发酵虑液加入到牛津杯中，置于25℃黑暗条件下培养72h，测量抑菌圈宽度)，结果表明，JX-20对上述病原细菌和真菌能够产生直径在15.5mm～24.5mm之间的抑菌圈。其中对油菜菌核病菌和小麦纹枯病菌的拮抗能力最强，抑菌圈直径达20.3mm～24.5mm；对草莓灰霉病菌的拮抗能力最弱，但抑菌圈仍达到15.5mm。

JX-20的NB发酵液(蔗糖15g，聚蛋白胨5g，酵母粉1g，牛肉膏3g，加ddH

表2 JX-20发酵液对小麦白粉病的保护和治疗作用

注：病情指数中的大写字母表示LSD比较差异极显著(P<0.01)，小写字母表示LSD比较差异极显著(P<0.05)，下同。

JX-20菌株接种NB培养液，150rpm摇培72h，经细菌滤器的滤液处理番茄和黄瓜根结线虫(Meloidogyne incognita)卵囊，28℃孵化72h，孵化率较自来水对照处理降低52.6％～64.3％；处理根结线虫二龄幼虫，48h幼虫死亡率达85％～96％。

该研究结果表明菌株JX-20对植物病原细菌、真菌和线虫具有广谱抗生活性和拮抗能力强的生物特性，具备一定的生防潜力。

2、JX-20解磷、解钾和固氮能力

在不含磷的NB液体培养基中添加0.5％(体积：重量比)磷矿粉(过700目筛)，接种JX-20菌株，在28℃和180r/min条件下摇培7天，采用钼锑抗比色法测定培养液中可溶性磷(可被植物吸收利用的P)含量，发现JX-20培养液中的可溶性磷含量达到5.43μg/mL，而对照枯草芽孢杆菌菌株只有2.25μg/mL，解磷能力增加2.4倍。

在含钾长石液体培养基中，接种JX-20菌株，在28℃和180r/min条件下摇培7天，原子吸收法测得培养液中可溶性钾含量为53.4μg/mL，而对照枯草芽孢杆菌菌株只有19.8μg/mL，解钾能力增加2.7倍。

JX-20菌株在Ashby培养基上形成光滑半透明褐色至深棕色菌落，显示具有自生固氮能力。测得JX-20菌株发酵液在单位时间内还原乙炔生成乙烯的物质量(微摩尔数)为0.25μmol/g·h，具有一定的固氮能力。

3、枯草芽孢杆菌JX-20菌株的代谢营养物质

(1)寡糖、脂肪酸

JX-20在NB培养基中28℃、180rpm摇培3天后，离心获取上清液。用NDJ-1粘度计25℃下测定培养液每毫克菌体干重的相对粘度值为1.55，约相当于15％～18％的葡萄糖。采用乙醇沉淀法提取，并用重蒸馏水重新溶解和盐饱和苯酚和氯仿：正丁醇(5:1)强烈震荡和离心，在水相中加入95％冰冷乙醇凝结、离心、无水乙醇洗涤获得白色纯化胞外多糖(EPS)，再经0.5mol/L盐酸水解和高效液相色谱分析，发现JX-20的胞外多糖主要含有黄原胶、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡糖醛酸和脂肪酸。

(2)氨基酸、蛋白质和多肽

利用氨基酸可以与衍生剂茚三酮发生化学反应，产生蓝色紫色化合物，经高效液相色谱法检测，JX-20在NB培养基中可代谢产生谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等，占菌体干重的2.5％～5.5％。

采用考马斯亮蓝测定方法，JX-20的NB培养液中胞外蛋白含量达28～35μg/mg干重菌体，胞外和胞内蛋白总含量达菌体干重的52.8％～59.5％。其中主要的蛋白酶和淀粉酶，分别具有降解蛋白质为氨基酸和降解淀粉为糖的生物活性，利于植物吸收利用。

(3)生物素测定

采用Difco生物素测试培养基和生物素Assay试剂盒(Colorimetric)测定，发现JX-20能够分泌生物素0.05～0.08μg/g干重菌体。

(4)JX-20培养液对植物防卫反应的诱导和抗病作用

JX-20菌株接种NB培养液中摇培72h，5倍、10倍、50倍稀释液喷雾处理拟兰芥，处理12h和24h测定叶片中的抗病性标志性物质活性氧和胼胝质，发现喷施50倍稀释液的活性氧和胼胝质产生最多，活性氧H

在喷施JX-20菌株发酵液50倍稀释液后12h喷雾接种丁香假单胞杆菌P.syringae，5d后检查病情指数较清水对照处理减少64％。进一步研究发现，JX-20菌株培养液50倍稀释液处理后24h，拟兰芥叶片中的PR1基因转录表达水平较清水处理上调2.6倍，表明JX-20菌株培养液能够诱导植物水杨酸途径的防卫反应。

(5)JX-20应用后的定殖动态

获得耐利福平标记的JX-20菌株培养液浸根处理油菜苗90min后，分别移载到装有无菌土和自然土的盆钵中。移栽1、4、7、10、15、20、25、30、35、40d后，随机从各处理中拔取10株，冲洗干净后将小苗剪成根、茎、叶三段，并称其重量，研碎，取其汁液涂布到含450μg/mL利福平的NA(NB培养基中加入20g琼脂/L)平板上，于28℃条件下培养24h，检查分离到菌落数，并测定分离到的细菌对油菜菌核病菌的抑菌活性。

从油菜体内分离到的JX-20菌落数(表3)显示，JX-20不但能够在移栽到自然土和灭菌土中的油菜体内定殖，而且能够从根部分布到叶部。栽培在自然土和灭菌土中油菜体内的JX-20定殖数量都是根部>茎部>叶部，而且在叶部定殖的时间要短于在根部定殖时间。除在灭菌土的根部外，JX-20在油菜各组织内的定殖数量都是先增加后下降的趋势，10d后在植株各组织内的数量变化较小，趋于稳定。

表3利福平标记的JX-20在接种后不同天数的油菜体内的定殖数量变化动态(×10

(6)JX-20对小麦、油菜和黄瓜苗期生长的促进作用

幼苗期的小麦经用JX-20发酵原液和100倍稀释液灌根处理15d后，小麦苗株高、鲜重及干重与对照相比均有显著变化，但对株高的促生作用较小，说明JX-20对幼苗期小麦的生长具有微生物肥料的促生作用(表4)。

表4 JX-20对小麦苗期生长的影响

幼苗期的油菜经用JX-20发酵原液及100倍稀释液灌根处理后，株高、鲜重及干重与对照相比均显著提高(表5)。其中对油菜株高的促生率分别为30.6％和13.9％，对鲜重的促生率分别为41.9％和6.5％，对油菜干重的促生率分别为52.2％和6.8％。说明JX-20对油菜具有显著的生物肥料促生作用。

表5 JX-20对油菜苗期生长的影响

幼苗黄瓜经用JX-20发酵原液和100倍稀释液灌根处理后，株高、鲜重及干重与对照相比均显著提高，其中株高的促生率分别为17.9％和7.5％，对鲜重的促生率分别为34.5％和16.8％，对黄瓜干重的促生率分别为28.8％和12.3％(表6)。说明JX-20对黄瓜也具有显著的微生物肥料的促生作用。

表6 JX-20对黄瓜苗期生长的影响

实施例3

枯草芽孢杆菌JX-20微生物肥料的使用效果

1、5500亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料粒剂的使用效果

取850g 6500亿枯草芽孢杆菌JX-20芽孢/g干粉，添加经粉碎过300目的尿素、硫酸铵、磷酸钙、磷酸钾，使N、P、K(6:2:2)最终含量为10％；添加硝酸钙、硫酸锌、氯化锰、四硼酸钠、有机硅季铵盐，使等量的混合微量元素最终含量为0.25％；添加5％的1:0.3:1聚乙二醇、乙二胺四乙酸二钠/钙、木质素磺酸钠，以高岭土为载体补充至总重量为1000克，加少量水湿润，加工制备成5500亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料片剂/粒剂。

取750克4000亿枯草芽孢杆菌JX-20芽孢/克干粉，添加经粉碎过300目的尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸钾、硝酸钾、氯化钾、硝酸钙、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锌、硝酸锰、硫酸亚铁，使N、P、K(6:2.5:1.5)最终含量为18％，等量混合微量元素最终含量为0.45％；添加脂肪酸聚氧乙烯酯、拉开粉、NNO-7、聚乙二醇、尿素、月桂酸、混合助剂总重量的12％，补充过300目的高岭土、糊精、碳酸氢钙、玉米粉、豆粕混合载体至总重量1000克，制备获得3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂。

在日光温室番茄秋季移栽时用制备的上述5500亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料粒剂每穴施放1～2粒(1～2g)，0.5％阿维菌素颗粒剂2.5kg/亩拌细土撒施。穴施颗粒剂30天、90天、150天后分别再用3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂15kg/公顷滴灌。移栽30天时测得30株番茄苗平均鲜重比未施生物肥料的对照高24.6％～29.7％，株高平均增加2.7～3.6cm。翌年4月中旬检测根结线虫病控制效果达81.5％～90.4％(表7)。

表7 JX-20对番茄苗期生长的影响和根结线虫病的防治作用

在黄瓜春季播种时，每穴用制备的上述5500亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料粒剂每穴施放1～2粒，0.5％阿维菌素颗粒剂2.5kg/亩拌细土撒施。穴施颗粒剂30天后用3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂60kg/公顷对水浇灌。移栽30天时测得25株黄瓜苗平均株高较对照增加20.5％～24.6％，鲜重增加28.9％～34.1％。移栽60天时检测根结线虫病控制效果达68％～83.5％(表8)。

表8 JX-20对黄瓜苗期生长的影响和根结线虫病的防治作用

2、3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂的使用效果

3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂的制备方法同上。

在草莓移栽时用制备的上述3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂1:10000～20000倍稀释液，每穴浇灌100～200mL。30天后测得50株平均鲜重高于浇水对照30.2％～35.5％，花蕾较对照平均每株多1.1～1.3个(表9)。

在草莓开花结果期，使用上述3000亿芽孢/克的微生物肥料可湿性粉剂1:3000～5000倍喷施，间隔7天连喷4次。草莓植株生长比对照(喷水、施用常规化肥)明显健壮，灰霉病病果率较喷水对照减少78.1％～82.3％，略低于喷施嘧霉胺和咯菌腈杀菌剂混剂的防效；叶片白粉病较喷水减少71.9％～81.2％，较喷施嘧霉胺和咯菌腈杀菌剂混剂减少39％～48％(表9)。

表9 JX-20对草莓苗期生长的影响及对灰霉病和白粉病的防治作用

在日光温室黄瓜秋季移栽时用制备的上述3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂1:10000～20000倍稀释液，每穴浇灌100～200mL。30天后测得30株平均株高高于浇水对照17.8％～28.1％(表10)。同时在移栽后30天、60天、90天、120天、150天时滴灌1:10000～20000倍稀释液(每株约50～100mL)及滴灌间隔中期用1:5000倍液喷施，黄瓜总产量较常规施用化学肥料增加34.6％，根结线虫病控制效果达82.3％～89.5％。黄瓜白粉病和靶斑病控制效果可达75.3％和67.5％(表10)。

表10 JX-20作基肥对黄瓜苗的促生作用及滴灌的病害防治作用

按每100kg小麦种子用3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂100g、300g、1000g、3000g加水调成糊状拌种，晾干后播种。30天后(冬前)调查苗情，结果见表11。地上部分的鲜重较未用生物肥料的对照分别增加8.4％、17.3％、21.3％和31.6％；地下根部鲜重分别比对照增加11.4％、14.0％、18.9％和26.1％。翌年4月调查根腐病，发病率比对照分别低14.2％、25.7％、56.3％和86.3％。同时调查纹枯病的病情指数较对照分别降低26.3％、54.1％、73.3％和76.1％。随拌种的生物肥料增加，麦苗分蘖增加、叶色加深、长势更加健壮。

表11 JX-20对小麦苗的促生作用及土传病害的防效

按每100kg玉米种子用3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂100g、300g、500g、1000g加水调成糊状拌种，晾干后播种于直径15cm的盆钵中，20天后调查苗情30株，平均株高较未用生物肥料的对照分别增加5.4％、12.2％、19.5％和28.8％；地下根部鲜重分别比对照增加8.1％、16.2％、21.6％和29.7％(表12)。

表12 JX-20种子处理对玉米苗的促生作用

按每1kg黄瓜种子用3000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂1g、3g、10g、30g加水调成糊状拌种，晾干后播种于15cm直径盆钵中，35天后调查30株苗情(表13)。平均蔓长较对照分别增加4.5、6.6、17.1和19.2cm；3g、10g和30g拌种处理的瓜蕾多0.45、1.3和1.8个。

表13 JX-20种子处理对黄瓜苗的促生作用

3、1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂的使用效果

取200克5000亿枯草芽孢杆菌JX-20芽孢/克干粉，添加经粉碎过300目的尿素、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、碳酸氢铵、磷酸钙、磷酸二氢钾、钾镁盐、硫酸铜、硝酸锰、硼酸盐、硅酸盐，使N、P、K(7.5:1.5:1.0)最终含量为32％，钙(Ca)、镁(Mg)、锌(Zn)、铜(Cu)、硫(S)、铁(Fe)、硼(B)锰(Mn)、氯(Cl)、钠(Na)等微量元素等量混合最终含量为0.4％；添加1：0.5：0.1：0.5木质素磺酸钠、拉开粉、月桂酸和羧甲基纤维素混合助剂最终含量为7.5％，以高岭土、豆粕、玉米粉、腐殖质、厩肥、堆肥、滑石粉混合载体补充至总重量为1000克，制备获得1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂。

在番茄移栽时用制备的上述1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料可湿性粉剂每公顷用225kg撒施作基肥后起垄。30天后测得50株平均鲜重107.1g，较浇水对照82.6g高29.7％。同时在移栽后30天、60天、90天、120天、150天时滴灌1:10000倍稀释液(每株约50mL)及滴灌间隔中期用1:500～1000倍液喷施，单株番茄果实平均重量222.0g/个，较常规施用化学复合肥料的果实平均重量180.4g增加23％，JX-20处理的50株番茄畸形果实(开裂等)平均0.26个/株，比对照0.32个减少18.75％，根结线虫病控制效果达88.4％％，早疫病控制效果达88.0％，晚疫病控制效果83.9％，并减少化学杀菌剂用量36％(表14)。

表14 JX-20滴灌对番茄病害的控制效果

在黄瓜春季播种时，每穴用制备的上述1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料撒施1勺(5克)。30天后测得25株平均株高52.9cm和鲜重293g，较对照株高42.7cm，鲜重219g蔓长增加24％，鲜重增加34％。自开花结瓜每7～10天用1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料1:500-1000倍喷施5次，黄瓜总产量2.3kg/株，较常规施用化学复合肥料1.8kg/株，增加27.8％，根结线虫病控制效果达83.6％，黄瓜白粉病和靶斑病控制效果达76.6％和72.9％，并减少化学杀菌剂用量(表15)。

表15 JX-20穴施+喷雾处理对黄瓜病害的防控作用

在草莓开花结果期，使用上述用1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料1:800-1200倍喷施，间隔7天连喷4次。草莓灰霉病病果率较喷水对照减少74.5％，较喷施嘧霉胺和咯菌腈杀菌剂混剂减少42.4％；叶片白粉病较喷水减少82.6％(结果见表16)。

表16 JX-20喷施对草莓灰霉病和白粉病的控制作用

在小麦播种前每公顷用1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料150～450kg撒施做基肥，30天后麦苗鲜重较对照未施肥高8.9％～37.9％，调查100株分蘖平均增加0.3～1.1个，越冬抗寒抗性强，长势好。4月15日调查纹枯病时，施用本生物肥料的小区纹枯病较对照减轻46.6％～71.5％(表17)。

表17 JX-20基肥对小麦苗的促生和纹枯病的控制作用

4、1000亿芽孢/mL的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂的使用效果

取200克5000亿枯草芽孢杆菌JX-20芽孢/克干粉，添加尿素、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、碳酸氢铵、磷酸二氢钾、钾镁盐、硼酸盐、微量元素，使N、P、K(2:1:1)最终含量为20％(重量百分比，下同)，钙(Ca)、硅(Si)、镁(Mg)、锌(Zn)、硫(S)、铁(Fe)、锰(Mn)、氯(Cl)等微量元素最终含量为0.5％；添加1：0.5：0.3：0.3：0.5黄原胶、乙二醇、NNO-1、聚乙二醇、甘油最终含量为10.4％，以水补充至总体积为1000mL，制备获得1000亿芽孢/mL的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂/水剂。

在辣椒移栽时用1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂1:1500～3000倍稀释液浇灌，21天后调查50株株高25.7cm，比施复合肥对照株高23.3cm平均增加2.4cm；JX-20处理鲜重128.8g/株，较对照112.4g/株，增加14.6％。

在辣椒生长期1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂1:800～1500倍稀释液每隔7天喷施一次，连喷5次，早疫病和白粉病分别减少56％和71％，减少25％嘧菌酯1000倍液喷施2次；鲜果产量增加38％(表18)。长势与施用复合肥300公斤/公顷接近。

表18 JX-20对辣椒的促生和病害控制作用

在水稻秧苗期、分蘖期和孕穗期每公顷用1.5～7.5公斤1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂1:300～100倍稀释液喷施3次，其长势及生物量与苗期1次撒施尿素150～225公斤/公顷相近。

自水稻分蘖后期，用1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂1:1000-1500倍喷施，或1:3000-5000倍液泼浇，防治水稻纹枯病的效果达79％，与喷施爱苗77％的防效相近，高于井冈霉素72％的防效。

在水稻抽穗前7天用1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料1:1000-1500倍稀释液喷施，控制稻曲病和稻瘟病的效果分别达到79.4％和75.6％，分别与常用杀菌剂爱苗和稻瘟灵的效果相似，千粒重增加2.9％和9.2％(表19)。

表19 JX-20防治稻曲病的田间效果

在小麦抽穗期用1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂1:800～1500倍稀释液喷施，增加小麦千粒重6.8％，对白粉病和赤霉病的控制效果为56.3％和47.8％(表20)。

表20 JX-20在小麦扬花期喷雾增加千粒重和病害控制的作用

按每10kg大豆和玉米种子用1000亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂200g和300g拌种，20天后调查50株豆苗和玉米苗鲜重分别增加8.5％和14.2％，根腐病和立枯病分别减轻46％～63.4％和63.2％～76.9％(表21)。

表21 JX-20拌种对大豆和玉米的促生作用及土传病害的控制效果

5、100亿芽孢/g的枯草芽孢杆菌微生物肥料颗粒剂的使用效果

取40克2500亿枯草芽孢杆菌JX-20芽孢/克干粉，添加经粉碎过300目的硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、磷酸铵、重过磷酸钙、富过磷酸钙、磷矿粉、钙镁磷肥、硫酸钾、氯化钾、硝酸钾、硝酸钙、磷酸一钾、磷酸二氢钾、钾镁盐、硼酸盐、微量元素，使N、P、K(7:2:1)最终含量为45％，镁(Mg)、锌(Zn)、铜(Cu)、硫(S)、铁(Fe)、硼(B)锰(Mn)等量混合微量元素最终含量为0.2％；添加2：1：0.5烷基酚聚氧乙烯醚、木质素磺酸钠和羧甲基纤维素最终含量为7.5％，以高岭土、轻质碳酸钙、豆粕、玉米粉、腐殖质、厩肥、堆肥补充至总重量为1000克，制备获得100亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料颗粒剂。

在番茄移栽时用制备的上述100亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料颗粒剂1:10000倍稀释液，每穴浇灌200mL。30天后测得40株平均鲜重高于浇水对照26.3％。同时在移栽后30天、60天、90天、120天、150天时滴灌1:10000倍稀释液(每株约50mL)及滴灌间隔中期用1:800～1000倍液喷施，根结线虫病控制效果达66％～83.1％，早疫病控制效果达62.3％，晚疫病控制效果71.5％(表22)。

在黄瓜春季播种时，每穴用制备的上述100亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料撒施1勺(约5克)。30天后测得25株平均株高较对照高22.4％，鲜重增加31％。自开花结瓜每7～10天用100亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料1:1000～1500倍喷施5次，黄瓜总产量较常规施用化学肥料增加25.8％，根结线虫病控制效果达61.1％～73.6％，黄瓜白粉病和靶斑病控制效果达66.8％和61.8％(表22)。

表22 JX-20基肥+喷施对番茄和黄瓜的促生作用及病害防控效果

在西瓜生长期用100亿芽孢/mL的枯草芽孢杆菌微生物肥料颗粒剂1:500-1000喷施，间隔7天喷施5次，西瓜长势与施用450kg复合肥和300kg硫酸镁相似。

在水稻移栽前每公顷用180～450公斤100亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料撒施，其长势及生物量与撒施尿素225～330公斤尿素相近。

在水稻生长期用75～150公斤100亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料颗粒剂1:1000倍液间隔7天喷施1次，连续喷5次，其长势及生物量与撒施尿素225～300公斤尿素相近。

6、50亿芽孢/g的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂的使用效果

取20克2500亿枯草芽孢杆菌JX-20芽孢/克干粉，添加硫酸铵、尿素、过磷酸钙、硫酸钾、氯化钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化锰、硼砂、微量元素，使N、P、K(1:1:1)最终含量为15％，钙(Ca)、镁(Mg)、锌(Zn)、硫(S)、硼(B)锰(Mn)等微量元素最终含量为0.25％；添加2：1：1聚乙二醇、甘油、黄原胶最终含量为3.5％，以水补充至总体积为1000mL，制备获得50亿芽孢/mL的枯草芽孢杆菌微生物肥料悬浮剂。

在草莓开花结果期，使用上述用50亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料1:200-500倍喷施，间隔7天连喷4次，中间喷施1次嘧霉胺咯菌腈。草莓灰霉病病果率较喷水对照减少56.4％，较4次喷施嘧霉胺和咯菌腈杀菌剂混剂减少23.3％；叶片白粉病较喷水减少43.1％，较喷施嘧霉胺和咯菌腈杀菌剂混剂减少11.2％(表23)。

在油菜初花期，使用上述用50亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料1:200-500倍喷施，间隔7天连喷3次，油菜荚籽粒饱满，较未施肥对照增产17.8％，菌核病较未用药防治减少72.5％，与喷施菌核净50g/亩防效74.3％没有显著性差异(表23)。

表23 JX-20喷施对草莓和油菜的促生作用及病害控制作用

在冬小麦冬前苗期每公顷用225公斤和450公斤50亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌微生物肥料兑水泼浇，麦苗冬季长势好于撒施复合肥450公斤腊肥，提高了越冬麦苗抗旱和抗寒性，春天返青快，拔节期地上+地下麦苗生物量较未施肥对照增加58％和110.8％，分蘖增加(表24)。

表24 JX-20腊肥对麦苗的促生作用

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京吉星生物技术开发有限公司

<120> 一株枯草芽孢杆菌JX-20菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1505

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

taccttgtta cgacttcacc ccaatcatct gtcccacctt cggcggctgg ctccataaag 60

gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag 120

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caaac 1505