利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法

摘要

本发明公开了一种利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，采用库德毕赤酵母异源表达新月柄杆菌木糖脱氢酶基因获得重组库德毕赤酵母，利用重组库德毕赤酵母进行发酵，在好氧发酵阶段经过36～48小时后转入厌氧发酵阶段。本发明可以极大地提高底物利用率和产品得率，从而减少能耗，降低污染物的排放。

说明书

技术领域

本发明涉及酵母技术领域，具体涉及一种利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法。

背景技术

化石燃料的日益枯竭以及使用所带来的环境污染和全球变暖等问题，促使人们寻找可再生能源来满足日益增长的能源需求。生物乙醇是目前最常用的可再生能源，可显著缓解能源短缺，减少二氧化碳排放。目前，生物乙醇生产中使用的碳源主要来自于作物如玉米、甘蔗和小麦，木质纤维素和藻类生物质。其中，来源丰富且价格低廉的纤维素材料是最有潜力的生物乙醇生产原料。纤维素材料经预处理后转化为葡萄糖和木糖以及糠醛，乙酸等抑制剂。在传统的生物乙醇生产中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)只能将葡萄糖代谢为乙醇，缺乏高效的木糖代谢途径，且与一些非传统酵母相比，酿酒酵母对纤维素水解液中的抑制剂缺乏足够的耐受性，严重影响生物乙醇的高效生产。解决这一问题的一种可能方案是利用对抑制剂具有高耐受性的非传统酵母对纤维素材料实现综合利用。如纤维素水解液中的木糖可用于生产高附加值的木糖酸，同时实现连续的葡萄糖向生物乙醇的转化。库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)是一种非传统微生物，它对高温、高糖、乙醇、低pH及纤维素水解抑制剂等具有高耐受性，可用于乙醇及有机酸的发酵，被认为是一种极具潜力的新型生物技术宿主。目前，利用重组库德毕赤酵母发酵分别生产乙醇和木糖酸已有报道，基于这些研究上如何利用重组库德毕赤酵母的多耐受性实现木糖酸和乙醇的联产极大地提高底物利用率和产品得率，从而减少能耗，降低污染物的排放成为了申请人亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法。本发明可以极大地提高底物利用率和产品得率，从而减少能耗，降低污染物的排放。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，采用库德毕赤酵母异源表达新月柄杆菌木糖脱氢酶基因获得重组库德毕赤酵母，利用重组库德毕赤酵母进行发酵，在好氧发酵阶段经过36～48小时后转入厌氧发酵阶段。

上述的利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，所述重组库德毕赤酵母的种子培养基包括以下质量浓度的成分：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L和酵母抽提物10g/L。

前述的利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，所述重组库德毕赤酵母的发酵培养基包括以下质量浓度的成分：玉米芯水解液1L，甘油5～10g/L，蛋白胨5～20g/L，酵母抽提物2～ 10g/L。

前述的利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，利用稀酸法对玉米芯进行预处理获得未脱毒的玉米芯水解液。

前述的利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，利用重组库德毕赤酵母进行摇瓶发酵，装液量为50～100mL每 250mL三角瓶，接种量为2～10％，培养温度为30～37℃，好氧阶段的摇床转速为180～250rpm，转入厌氧发酵阶段时摇瓶加软木塞隔绝氧气，摇床转速设为80～120rpm。

前述的利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，利用重组库德毕赤酵母进行5L发酵罐分批发酵时，装液量3～ 4L，接种量为5～10％，培养温度为30～37℃，搅拌速度为300～400 rpm，好氧阶段流加100～160g/L葡萄糖通入空气，通气量0.2～0.6vvm，转入厌氧发酵阶段时流加100～160g/L葡萄糖，通入氮气，通气量0.2～0.4vvm。

前述的利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，所述重组库德毕赤酵母的构建是在库德毕赤酵母中整合表达载体表达经密码子优化后的新月柄杆菌木糖脱氢酶基因xylB。

前述的利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，所述重组库德毕赤酵母的构建具体如下：

a、利用引物PDC1F和PDC1R，以库德毕赤酵母基因组DNA为模板扩展获得的DNA片段并连接入pMD19T载体；所述引物PDC1F和 PDC1R分别为CGCGGATCCGCGTTTAAGTGGTGGTTGTA和CGGGGTACCTGGTGAGATTGATGGATTGT；

b、利用引物FPDCF和FPDCR进行反向PCR；所述引物FPDCF和 FPDCR分别为ACAGATAAGTACCTAGGGAGATT和TGACATCTGAATGTAAAATGAAC；

c、利用引物1-F和1-R，以pGAPZB为模板扩增获得博来霉素抗性基因；所述引物1-F和1-R分别为 ACACAGCAAAACACAAAAATATGGCCAAGTTGACCAGTGC和 TATCGAAATCTAGCCCGCAAATTAAAGCCTTCGAGC；

d、利用引物2-F和2-R，基因组DNA为模板扩展获得pGAP启动子；所述引物2-F和2-R分别为 TCGAAGGCTTTAATTTGCGGGCTAGATTTCGATAGGAT和 GTAGATTGCGGAGGACATTTTTTGTGGTTGTGTTTGTTTGTGT；

e、密码子优化的木糖脱氢酶基因合成并克隆至PUC57质粒上；利用引物3-F和3-R，质粒DNA为模板扩展基因片段；所述引物3-F 和3-R分别为TTACAAAAAATGTCCTCCGCAATCTACCCA和 CATTTTACATTCAGA TGTCATTAACGCCAACCAGCATCG；

f、使用ClonExpress Multis One Step Cloning Kit对上述片段进行一步法连接，获得木糖脱氢酶表达载体pXYLB，利用醋酸锂法将经过酶切的重组质粒转入库德毕赤酵母，转化产物涂布至含 180ug/mL Zeocin的YPD平板上后，30℃下培养3d得到重组库德毕赤酵母转化子。

与现有技术相比，本发明通过采用前期好氧后期厌氧的两段发酵新工艺，在好氧发酵阶段消耗木糖生产木糖酸，再利用重组库德毕赤酵母对低pH和弱有机酸的高耐受性，在不调节pH值的情况下转入厌氧发酵生产乙醇，从而简化生产流程，降低生产成本。由此利用重组库德毕赤酵母的多耐受性实现木糖酸和乙醇的联产，可极大地提高底物利用率和产品得率，从而减少能耗，降低污染物的排放。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例：利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法，首先构建重组库德毕赤酵母，在库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii CCTCC M 2017759)中整合表达载体表达经密码子优化后的新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)木糖脱氢酶基因xylB。所述密码子优化后的xylB基因序列如SEQ ID No.1所示：

ATGTCCTCCGCAATCTACCCATCCTTGAAGGGTAAGCGTGTCGTTATCACTGGA GGTGGTTCTGGTATCGGTGCTGGTTTGACAGCTGGTTTCGCTCGTCAAGGTGCTGAGG TCATCTTCTTGGACATTGCTGACGAGGATTCCCGTGCTTTGGAGGCTGAATTAGCTGG TTCCCCTATCCCACCAGTCTACAAGCGTTGCGACTTGATGAACTTGGAGGCAATCAAG GCAGTCTTCGCAGAGATCGGAGATGTCGACGTCTTGGTCAACAACGCTGGTAACGACG ACAGACACAAGTTGGCTGACGTCACTGGTGCTTACTGGGACGAGCGTATTAACGTTAA CTTGAGACACATGTTGTTCTGCACTCAAGCAGTTGCACCCGGTATGAAGAAGAGAGGT GGTGGTGCTGTCATCAACTTCGGTTCCATCTCTTGGCACTTGGGATTGGAGGACTTGG TCTTGTACGAGACTGCAAAGGCTGGTATCGAGGGTATGACTAGAGCATTGGCTCGTGA GTTGGGTCCAGACGACATCCGTGTCACTTGCGTTGTCCCCGGTAACGTTAAGACTAAG CGTCAAGAAAAGTGGTACACACCAGAAGGAGAGGCACAGATTGTCGCTGCTCAGTGCT TGAAGGGTCGTATTGTCCCAGAGAACGTCGCAGCTTTGGTCTTGTTCTTGGCATCCGA CGACGCTTCCTTGTGTACTGGTCACGAGTATTGGATCGATGCTGGTTGGCGTTAA。

具体构建过程如下：

a、利用引物PDC1F和PDC1R，以库德毕赤酵母基因组DNA为模板扩展获得的DNA片段并连接入pMD19T载体；所述引物PDC1F和 PDC1R分别为CGCGGATCCGCGTTTAAGTGGTGGTTGTA和CGGGGTACCTGGTGAGATTGATGGATTGT；

b、利用引物FPDCF和FPDCR进行反向PCR；所述引物FPDCF和 FPDCR分别为ACAGATAAGTACCTAGGGAGATT和 TGACATCTGAATGTAAAATGAAC；

c、利用引物1-F和1-R，以pGAPZB为模板扩增获得博来霉素抗性基因；所述引物1-F和1-R分别为 ACACAGCAAAACACAAAAATATGGCCAAGTTGACC AGTGC和 TATCGAAATCTAGCCCGCAAATTAAAGCCTTCGAGC；

d、利用引物2-F和2-R，基因组DNA为模板扩展获得pGAP启动子；所述引物2-F和2-R分别为 TCGAAGGCTTTAATTTGCGGGCTAGATTTCGATAGGAT和 GTAGATTGCGGAGGACATTTTTTGTGGTTGTGTTTGTTTGTGT；

e、密码子优化的木糖脱氢酶基因合成并克隆至PUC57质粒上；利用引物3-F和3-R，质粒DNA为模板扩展基因片段；所述引物3-F 和3-R分别为TTACAAAAAATGTCCTCCGCAATCTACCCA和 CATTTTACATTCAGA TGTCATTAACGCCAACCAGCATCG；

f、使用ClonExpress Multis One Step Cloning Kit对上述片段进行一步法连接，获得木糖脱氢酶表达载体pXYLB，利用醋酸锂法将经过酶切的重组质粒转入库德毕赤酵母，转化产物涂布至含 180ug/mL Zeocin的YPD平板上后，30℃下培养3d得到重组库德毕赤酵母转化子。

本实施例中，所述重组库德毕赤酵母的种子培养基包括以下质量浓度的成分：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L和酵母抽提物10g/L；将获得的重组库德毕赤酵母单菌落划线接种于YPD培养基中，30℃培养 48h形成单菌落，挑去单菌落接种于YPD液体培养基中，35℃，250rpm下培养24h得到种子液。

再制备所述重组库德毕赤酵母的发酵培养基，该发酵培养基包括以下质量浓度的成分：玉米芯水解液1L，甘油5～10g/L，蛋白胨5～ 20g/L，酵母抽提物2～10g/L，其中玉米芯水解液的制备是取600g 粒径小于0.9mm的玉米芯，加入2％(v/v)稀硫酸2L，50℃下浸泡1h 后于灭菌锅中121℃处理1h，经真空抽滤后调节pH至5.5备用。

在一种实施例中，以2％的接种量接种至含50ml发酵培养基的三角瓶中，35℃，250rpm条件下发酵48h后，加入50ml葡萄糖溶液(100g/L)并调节摇床转速至100rpm，同时三角瓶加软木塞，继续发酵24h。利用高效液相色谱法检测发现发酵液中含木糖酸43.5g/L，得率0.83g/g，乙醇30.5g/L，得率0.35g/g，终pH为3.23。

在另外一种实施例中，将获得的重组库德毕赤酵母单菌落划线接种于YPD培养基中，30℃培养48h形成单菌落，挑去单菌落接种于 YPD液体培养基中，35℃，250rpm下培养24h得到种子液。使用5L发酵罐进行分批发酵，装液量为3.7L，接种量为5％，控制发酵温度为35℃，通气量0.2vvm通入空气，搅拌速度400rpm，发酵 36h后转入厌氧发酵阶段流加100g/L葡萄糖，通入氮气，通气量 0.2～0.4vvm，24h后终止发酵，检测发现发酵液中含木糖酸48.3 g/L，得率0.92g/g，乙醇38.6g/L，得率为0.39g/g，终pH为2.92。

以上结果表明，本发明通过采用前期好氧后期厌氧的两段发酵新工艺，在好氧发酵阶段消耗木糖生产木糖酸，再利用重组库德毕赤酵母对低pH和弱有机酸的高耐受性，在不调节pH值的情况下转入厌氧发酵生产乙醇，从而简化生产流程，降低生产成本。由此利用重组库德毕赤酵母的多耐受性实现木糖酸和乙醇的联产，可极大地提高底物利用率和产品得率，从而减少能耗，降低污染物的排放。

序列表

<110> 温州大学

<120> 利用重组库德毕赤酵母发酵连续生产木糖酸和乙醇的方法

<130> 2021.03.25

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcctccg caatctaccc atccttgaag ggtaagcgtg tcgttatcac tggaggtggt 60

tctggtatcg gtgctggttt gacagctggt ttcgctcgtc aaggtgctga ggtcatcttc 120

ttggacattg ctgacgagga ttcccgtgct ttggaggctg aattagctgg ttcccctatc 180

ccaccagtct acaagcgttg cgacttgatg aacttggagg caatcaaggc agtcttcgca 240

gagatcggag atgtcgacgt cttggtcaac aacgctggta acgacgacag acacaagttg 300

gctgacgtca ctggtgctta ctgggacgag cgtattaacg ttaacttgag acacatgttg 360

ttctgcactc aagcagttgc acccggtatg aagaagagag gtggtggtgc tgtcatcaac 420

ttcggttcca tctcttggca cttgggattg gaggacttgg tcttgtacga gactgcaaag 480

gctggtatcg agggtatgac tagagcattg gctcgtgagt tgggtccaga cgacatccgt 540

gtcacttgcg ttgtccccgg taacgttaag actaagcgtc aagaaaagtg gtacacacca 600

gaaggagagg cacagattgt cgctgctcag tgcttgaagg gtcgtattgt cccagagaac 660

gtcgcagctt tggtcttgtt cttggcatcc gacgacgctt ccttgtgtac tggtcacgag 720

tattggatcg atgctggttg gcgttaa 747

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcggatccg cgtttaagtg gtggttgta 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggggtacct ggtgagattg atggattgt 29

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acagataagt acctagggag att 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgacatctga atgtaaaatg aac 23

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acacagcaaa acacaaaaat atggccaagt tgaccagtgc 40

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tatcgaaatc tagcccgcaa attaaagcct tcgagc 36

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcgaaggctt taatttgcgg gctagatttc gataggat 38

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtagattgcg gaggacattt tttgtggttg tgtttgtttg tgt 43

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttacaaaaaa tgtcctccgc aatctaccca 30

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cattttacat tcagatgtca ttaacgccaa ccagcatcg 39