一种葡萄白粉病菌环介导等温扩增检测方法及应用

摘要

本发明公开了一种葡萄白粉病菌环介导等温扩增检测方法及应用，为葡萄白粉病的早期诊断和预测提供依据，最佳反应条件为以UNITF3‑3/UNITB3‑3为外引物，UNITFIP‑3/UNITBIP‑3为内引物，反应体系中Bst DNA聚合酶浓度为0.192 U·μL‑1，甜菜碱浓度为0.6mol·L‑1，dNTPs浓度为1.8mmol·L‑1，Mg2+浓度为1.6mmol·L‑1，内外引物配比比例为5:1，在63.8℃反应105 min，一步扩增完成，灵敏度为10 pg·μL‑1，适合于鲜食葡萄和酿酒葡萄样品检测，且反应稳定，本发明公开的葡萄白粉病菌检测方法高效、灵敏、特异性强，可以用于检测田间的葡萄白粉病菌，适宜于向生产企业和基地推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种葡萄白粉病菌环介导等温扩增检测方法及应用。

背景技术

环介导等温扩增(Loop-me diated isothermal amplification，LAMP)技术是由Notomi在2000年开发出的一种新型的核酸扩增方法，是一种在恒温条件下快速完成靶标基因扩增的新方法，葡萄白粉病是由葡萄钩丝壳菌Uncinula necator(Schw.)Burr.引起的真菌性病害，危害葡萄的叶片、新梢和果穗，以幼嫩组织最易感病。葡萄白粉病菌以菌丝体在被害组织内或芽鳞间越冬。次年在适宜环境条件下产生分生孢子由气流传播，落到寄主表面，如条件适合即萌发长出芽管，直接穿透寄主表皮侵入为害。葡萄白粉病在发生初期或越冬阶段往往处于潜伏状态，而此阶段病害菌源量的准确估计对病害流行预测预报十分重要，它是预测病害发展趋势的重要参数。但使用常规方法调查病害时，用肉眼无法观测到处于潜育状态的植物病害，而叶片培养法费工费时，且受环境干扰大，结果误差也比较大。因而如何利用现代分子生物技术，实现简单、快速、准确的对葡萄白粉病菌的检测，设计开发出一种葡萄白粉病菌高效的检测方法，对于控制葡萄白粉病的发生蔓延以及可能造成的重大损失的发生具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葡萄白粉病菌环介导等温扩增检测方法及应用，用以实现对葡萄白粉病菌的早期诊断和快速检测，对于控制葡萄白粉病的发生蔓延以及可能造成的重大损失的发生具有重要意义。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种葡萄白粉病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

(1)检测用引物，包括外引物和内引物；

(2)提取待测葡萄叶片DNA，于-20℃保存，备用；

(3)环介导等温扩增反应体系，所述待测葡萄叶片DNA，10×ThermoPol Buffer，1.6～8.0mmol.L

(4)利用所述反应体系进行环介导等温扩增，反应结果通过1％的琼脂糖凝胶电泳法检测以及加入SYBR Green I荧光染液在自然光和蓝光仪观察颜色变化；

(5)步骤(4)中颜色显示嫩绿色、有荧光为阳性，显示橙红色、无荧光为阴性。

进一步地，所述外引物为UNITF3-3/UNITB3-3，所述UNITF3-3序列为：TTGCAACCAGACTTGGGC，所述UNITB3-3序列为：ACGGGTCGCTTACAACCA，所述内引物为UNITFIP-3/UNITBIP-3，所述UNITFIP-3序列为：TCCAACGGCCTTTCTCCAGC-TTTTCGAGGGCACTCGGTA，所述UNITBIP-3序列为：TATAGCCAACGGTGCCATGCA-TACGCCAGCATCCTAGCC。

进一步地，所述MgSO

进一步地，所述Bst DNA polymerase的浓度为0.192U·μL

进一步地，所述甜菜碱的浓度为0.6mol·L

进一步地，所述dNTPs的浓度为1.8mol·L

进一步地，所述反应条件的扩增温度为63.8℃。

进一步地，所述反应条件的扩增时间为105min。

进一步地，所述内引物与外引物比例为5：1。

所述葡萄白粉病菌环介导等温扩增检测方法，应用于葡萄白粉病菌的检测。

本发明公开的检测方法，与常规PCR和实时荧光定量PCR检测反应相比，具有以下有益效果：一是扩增反应条件简单，一步完成，具有检测时间短、反应稳定、效率高、易于操作等特点；二是反应结果直观、可视化，同时具有很好的特异性与灵敏度；三是本发明公开的检测方法对仪器设备的要求低，不仅可以在实验室进行检测，还可以在田间地头进行检测，极大地提高了葡萄白粉病菌检测效率，适用性广，既适合于鲜食葡萄和酿酒葡萄样品检测，也可用于检测田间的葡萄白粉病菌，适宜于向生产企业和基地推广应用。

附图说明

图1：LAMP引物初筛示意图；

图2:图2LAMP引物特异性验证示意图；

图3：反应时间对LAMP检测的影响示意图；

图4：反应温度对LAMP检测的影响示意图；

图5：Bst DNA聚合酶对LAMP检测的影响示意图；

图6：甜菜碱对LAMP检测的影响示意图；

图7：dNTPs对LAMP检测的影响示意图；

图8：Mg

图9：内外引物比例对LAMP检测的影响示意图；

图10：引物灵敏度检测示意图；

图11：LAMP检测田间样品示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本专利的技术方案作进一步说明。

实施例1

引物设计与合成，使用Primer Premier 6.0，根据GenBank中葡萄白粉菌(登录号：LC028995和登录号：KJ539202)、葡萄霜霉病菌(登录号：DQ665668和登录号：DQ665666)和葡萄灰霉菌(登录号：KX443701)的rDNA-ITS的序列信息，通过序列比对，以葡萄白粉菌rDNA-ITS(登录号：LC028995)全长序列设计LAMP引物。

表1 本研究所用的LAMP引物

Table 1 LAMP primers used in this study

实施例2

LAMP引物初筛，LAMP反应体系：1μL DNA模板，10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mmol.L

以葡萄白粉病菌DNA为模板，对表1中4对引物进行筛选，如图1所示，A：LAMP引物初筛，B：自然光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，C：蓝光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，M：Marker，1～4：引物Un-LAMP-1～Un-LAMP-4。

只有引物Un-LAMP-3能够扩增出梯状条带，加入染色剂，反应底物颜色为嫩绿色，在蓝光仪下呈荧光。其它引物均无条带出现，反应底物颜色为橙红色，在蓝光仪下无荧光。

实施例3

样品DNA提取，使用

表2 供试菌株

Table2 Tested strains

实施例4

LAMP引物特异性检查，使用筛选出的引物对上述(表2)提取的14种真菌DNA进行LAMP扩增，以ddH

引物特异性检查，使用LAMP引物Un-LAMP-3分别对葡萄霜霉病菌、辣椒炭疽病菌和葡萄灰霉病菌等12种植物病原真菌基因组DNA进行扩增。

如图2所示，A：LAMP引物特异性检查，B：自然光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，C：蓝光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，M：Marker，U1～U2：葡萄白粉病菌，1～12：12种病原真菌见表2，CK1：健康葡萄叶片组织DNA，CK2：ddH

引物Un-LAMP-3能够检测来源于酿酒葡萄(霞多丽和赤霞珠)的葡萄白粉病菌(U1和U2)，加入染色剂，反应底物颜色为嫩绿色，在蓝光仪下呈荧光。而其它12种供试病原真菌DNA，健康葡萄叶片DNA以及ddH2O对照均不能扩增出梯状条带，反应底物颜色为橙红色，在蓝光仪下无荧光，引物Un-LAMP-3对葡萄白粉病具有特异性。因此，选择引物Un-LAMP-3进行后续实验。

实施例5

LAMP反应体系的优化，按照实施例2的方法，分别确定Bst DNA聚合酶浓度(终浓度变化为0.192～0.512U·μL

反应时间的优化，如图3所示，A：反应时间对LAMP检测的影响，B：自然光下SYBRGreenⅠ荧光染液检测，C：蓝光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，M：Marker，1：30min，2：45min，3：60min，4：75min，5：90min，6：105min，7：120min，CK：ddH

当反应时间为30～60min时无条带出现，加入染色剂，反应底物颜色为橙红色，在蓝光仪下无荧光，即30～60min不足以产生电泳能够检测到的目的条带；当反应时间为75、90、120min时有条带显现但条带亮度较差；当反应时间为105min时，条带的亮度与清晰度均佳，反应底物颜色为嫩绿色，在蓝光仪下荧光强度最强。因此，选取105min作为后续实验的反应时间。

反应温度的优化，如图4，A：反应温度对LAMP检测的影响，B：自然光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，C：蓝光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，M：Marker，1：49.0℃，2：50.1℃，3：52.1℃，4：55.1℃，5：58.7℃，6：61.7℃，7：63.8℃，8：65.0℃，CK：ddH

结果显示在49℃～65℃温度梯度下均出现条带，加入染色剂，反应底物颜色为嫩绿色，在蓝光仪下有荧光。且第七泳道条带亮度最明亮清晰，选取63.8℃作为后续实验的反应温度。

DNA聚合酶浓度优化，如图5，A：Bst DNA聚合酶对LAMP检测的影响，B：自然光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，C：蓝光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，M：Marker，1：0.192U·μL

结果显示在终浓度变化为0.192～0.512U·μL

甜菜碱浓度优化，如图6，A：甜菜碱对LAMP检测的影响，B：自然光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，C：蓝光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，M：Marker，1：0mol·L

结果显示在终浓度变化为0～1.6mol·L

dNTPs浓度优化，如图7，M：Marker，1：0mmol·L

结果显示在终浓度为0mmol·L

Mg

结果显示在终浓度为0和0.8mmol·L

内外引物配比比例优化，如图9，A：内外引物比例对LAMP检测的影响，B：自然光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，C：蓝光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，M：Marker，1：1:1，2：2:1，3：3:1，4：4:1，5：5:1，6：6:1，7：7:1，8：8:1，9：9:1，10：10:1，CK：ddH

结果显示当内外引物比例为1:1时无条带出现，加入染色剂，反应底物颜色为橙红色，在蓝光仪下无荧光。比例变化为2:1～10:1时均出现条带，且从第五泳道起往后泳道亮度均较亮且差异较小，为节约成本，选取5:1为最佳内外引物配比比例。

实施例6

LAMP体系灵敏度测定，将葡萄白粉菌DNA浓度分别十倍稀释浓度范围为1000ng·μL

如图10，A：LAMP灵敏度检测，B：自然光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，C：蓝光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，M：Marker，1:1000ng·μL

对优化后的LAMP体系进行灵敏度检测，结果表明优化后的LAMP体系的检测灵敏度为10pg·μL

实施例7

田间葡萄白粉病样品检测，在宁夏志辉源石酒庄、立兰酒庄、西鸽酒庄、新牛酒庄、宁夏农林科学院枸杞研究所共5个葡萄园采集病叶，以ddH

如图11，A：LAMP检测田间样品，B：自然光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，C：蓝光下SYBR GreenⅠ荧光染液检测，M：Marker，1:志辉源石酒庄病叶样本DNA，2:立兰酒庄病叶样本DNA，3:西鸽酒庄病叶样本DNA，4:新牛酒庄病叶样本DNA，5:宁夏农林科学院枸杞研究所病叶样本DNA，CK：ddH

从宁夏志辉源石酒庄、立兰酒庄、西鸽酒庄、新牛酒庄、宁夏农林科学院枸杞研究所共5个葡萄园采集病叶。提取叶片DNA,使用优化后的LAMP体系进行扩增提取叶片DNA，进行LAMP扩增。结果如图11所示，不同来源的葡萄白粉病叶均能使用所建立的LAMP体系扩增出梯状条带。加入染色剂，反应底物颜色为嫩绿色，在蓝光仪下有荧光，呈现出与电泳相同的结果。

以上实施例对本发明所公开的一种葡萄白粉病菌环介导等温扩增检测方法及应用，进行了进一步阐述和说明，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。