呼吸道合胞病毒相关的蛋白标记物TPI1及检测试剂盒

摘要

本发明公开了TPI1蛋白作为检测样本中呼吸道合胞病毒感染的生物标记物的应用。本发明还提供了用于诊断呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，可快速、简便、特异性高检测样本中呼吸道合胞病毒感染情况，对早期、快速诊断呼吸道合胞病毒感染具有重要的临床诊断价值和临床意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒相关的蛋白标记物及其检测试剂盒。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respirtory syncytial virus，RSV)是一种单股负链RNA病毒，属副黏液病毒科肺炎病毒属，是婴幼儿急性下呼吸道感染(Acute lower respiratorytract infection，ALRTI)最常见的病毒病原体，尤其在2岁以下儿童中有很高风险，并与此后的喘息发作及哮喘关系密切。急性呼吸道感染患儿中，有12％～63％与RSV感染相关，RSV感染后在年长儿中可仅表现为轻度的上呼吸道症状，但在小婴儿中则较易进展为严重的下呼吸道感染，其中最常见的下呼吸道疾病为毛细支气管炎，另外也可引起肺炎、喉炎、气管炎等。西方国家研究报道因RSV感染住院的患儿在所有病毒性呼吸道感染住院患者中占19％～81％，其中有 2％-12％需要重症监护。另外有流行病学研究发现RSV感染与哮喘的发生可能存在因果关系，主要数据来自瑞典的Sigurs等人的一项前瞻性研究：他们追踪了47例1岁以内因RSV毛细支气管炎住院的患儿以及93例健康儿童，分别在患儿1岁、3岁、7岁、18岁时随访，最终的随访结果显示：随着患儿年龄的增长，RSV感染组的哮喘和反复发作的喘息发生率同健康对照组相比呈上升趋势，对常见过敏原的敏感性也更高。尽管RSV感染与哮喘之间的因果关系在病理学上尚未明确，且RSV也不是导致严重毛细支气管炎的唯一病毒性病原，其他呼吸道病毒如流感病毒和鼻病毒感染后也可表现为喘息症状，但RSV感染与哮喘的发作似乎存在着某些相关性。

RSV在全球范围内均有流行，据估计，2005年RSV在全球引起了66000～199000名儿童死亡，99％发生在发展中国家。感染发病率最高的5个国家依次为巴基斯坦、印度、尼日利亚、中国和印度尼西亚，这5个国家有全球近一半的RSV－ALRTI的患者例数。据估计，我国由于RSV－ALRTI的发病率约为31.0(18.7～50.8)/1 000，占儿童ALRTI的18.7％。Ning 等对我国5岁以下儿童社区获得性肺炎的病原进行分析，发现RSV占17.3％；在上海地区2013 年至2015年18岁以下儿童下呼吸道感染病原中，RSV占13.9％，在病毒病原中的检出率居第1位；在北京、山东等华北地区2012年至2015年2岁以下住院儿童中，RSV的检出率高达33.3％，在病毒病原中占第1位。新生儿RSV感染发病率也不低。基于3个社区的研究显示，每年每1000名新生儿中可发生40例RSV的感染，新生儿期RSV-ALRTI的住院率为15.9 (95％CI：8.8～28.9)/1 000。

此外，RSV不仅是儿童病毒性呼吸道感染的主要病原，其在老年人和免疫功能低下的高危人群中也有较高的发病率，并可引起严重的并发症导致住院时间延长和高死亡率。而且通常RSV感染后产生的保护性免疫仅为一过性，并不能持久保护机体，重复感染十分常见。第一次感染通常从上呼吸道疾病伴充血与发热进展至累及下呼吸道，最常导致细支气管炎，有时会导致肺炎伴咳嗽和呼吸困难。有些儿童，通常是年幼的婴儿，可能会发展成严重的呼吸窘迫，少数死亡。患有细支气管炎的孩子在成年后诊断出哮喘的发生率更高。大多数RSV感染的患儿能完全康复，不遗留后遗症。但有研究表明婴儿期RSV感染的患儿出现哮喘的概率约是健康婴儿的4倍。早产儿、合并先天性心脏病或有唐氏综合征、免疫功能缺陷等疾病的患儿，RSV感染后临床表现往往更重，出现呼吸系统后遗症的比例较高，如持续性喘息、运动耐量下降等，且这一后遗症持续时间可长达10年以上，给患儿带来很大的风险并严重的影响了患儿生物生活质量。尽管RSV的致死率不高，但其高致病性给我国患儿的健康带来很大的风险，从而带来巨大的社会负担。

目前对感染RSV的诊断包括临床指征、一般实验室检查、影像学检查、RSV病原学检查。临床上诊断呼吸道合胞病毒感染主要依靠患儿的临床表现，需待一系列的呼吸道症状出现以后，并排除了其他可能疾病之后方可诊断，时效性不佳。实验室检查方面，外周血常规检测提示白细胞计数和中性粒细胞比例正常，而淋巴细胞比例明显升高。这些指标是通过炎性指标来间接辅助诊断呼吸道合胞病毒的，故特异性和指向性不理想。许多其他疾病尤其是感染性疾病引起的呼吸道症状也会产生类似的炎性指标，故此法常与其他的感染性疾病相混淆，可能贻误治疗时机。RSV感染后的影像学表现无特异性，可表现为双肺纹理增多、小斑片状阴影、肺气肿，很容易与其他疾病混淆。因此，RSV病原学检查在诊断中具有特异性指导意义。

目前现有的诊断RSV感染的生物标记物灵敏度和特异性难以同时满足，且与检验者的取材手法、操作水平等相关，易造成误差，因此都未能得到较大临床队列的证实。到目前为止，仍未有一个公认指标和方法。因此，找到一种能快速准确诊断RSV感染的生物标记物是非常重要的，能为临床治疗指明方向，可以改善预后，减轻医疗卫生资源。

随着人类基因组计划的完成，生命科学研究已进入了后基因组时代.蛋白质组学的研究已成为当今生命科学研究领域中的一个重要分支。该技术可用于寻找和发现区别于正常生理状态下的疾病特异表达蛋白。我们利用蛋白质组学和生物信息学分析，发现了差异表达蛋白 TPI1(triosephosphate isomerase 1)在呼吸道合胞病毒感染时有统计学意义。

发明内容

为了解决现有实验室检测技术在呼吸道合胞病毒感染中的不足，本发明需要解决的技术问题是提供一种呼吸道合胞病毒相关的生物标记物，该标记物可以特异性地用于检测呼吸道合胞病毒的感染。

本发明的目的之一在于提供TPI1蛋白作为检测样本中呼吸道合胞病毒感染的生物标记物的应用。

本发明的目的之二在于提供TPI1蛋白作为监测或评估呼吸道合胞病毒感染急性期和/或恢复期的生物标记物的应用。

本发明的目的之三在于提供TPI1蛋白作为评估呼吸道合胞病毒感染治疗方案的生物标记物的应用。

本发明的目的之四在于提供一种检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒。

一种检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包括检测样本中TPI1蛋白含量或表达量的试剂。

在其中一些实施例中，样本为血清。

在其中一些实施例中，还包括检测BPGM蛋白含量或表达量的试剂。

在其中一些实施例中，还包括检测PRDX2蛋白含量或表达量的试剂。

在其中一些实施例中，还包括检测CFL1蛋白含量或表达量的试剂。

在其中一些实施例中，所述试剂盒包括检测样本中TPI1蛋白含量或表达量的试剂，以及还包括检测PRDX2、BPGM、CFL1中至少一种蛋白含量或表达量的试剂。

在其中一些实施例中，检测TPI1蛋白含量或者表达量，可以通过常规的免疫学检测或者基因检测方法实现，免疫学检测方法的原理基于抗原抗体结合反应，例如免疫检测方法中的酶联免疫检测方法或免疫层析技术，免疫组化法，或蛋白质印迹法(westernblot)、免疫渗滤法、蛋白芯片法等等。为了快速检测，优选地，选择酶联免疫检测方法或免疫层析技术，所述试剂盒包括通过酶联免疫检测方法或免疫层析技术检测TPI1蛋白含量的试剂。

本发明的目的之五在于提供一种非疾病诊断方法的检测呼吸道合胞病毒感染的方法。

一种非疾病诊断方法的检测呼吸道合胞病毒感染的方法，对待检测样本中的TPI1蛋白含量进行检测。

本发明的发明人发现一种与呼吸道合胞病毒感染相关的生物标记物TPI1，其可高特异性地检测呼吸道合胞病毒感染。本发明还进一步提供了诊断呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，解决了现有的实验室检测技术和血清学检测技术的自限性，为快速诊断呼吸道合胞病毒提供依据。本发明检测样本为血清样本，是一种快速、简便、特异性高的检测方法，对早期、快速诊断呼吸道合胞病毒感染具有重要的临床诊断价值和临床意义。

相对于传统的RSV感染的诊断如病毒检测、抗体检测等，本发明所述检测呼吸道合胞病毒感染相关的生物标记物TPI1的试剂盒具有取材方便、操作简单、特异性强、时间花费少、快速准确、结果稳定等优点，能及时、快速、客观、准确诊断RSV患儿，尤其是可以通过一次实验将RSV患儿诊断出来，有传统诊断方法所不具备的优势。因此，本发明对于RSV患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在RSV患儿上使用的快速诊断试剂盒提供了方向性。

附图说明

图1为实验设计及工作流程示意图。

图2为RSV感染急性期和恢复期患儿的差异蛋白分析及蛋白分类。(A)RSV感染急性期(左边)和RSV恢复期(右边)鉴定到的差异蛋白，红色代表上调蛋白，蓝色代表下调蛋白，箭头所指的这几个蛋白就是我们候选的蛋白生物标记物。(B)RSV感染急性期和恢复期上调和下调差异蛋白的数量。Venn图显示了RSV急性期和恢复期共同出现的差异蛋白的数量。(C)RSV急性期(左饼图)和恢复期(右饼图)差异蛋白的分类。

图3为RSV感染急性期和RSV感染恢复期差异蛋白的GO和KEGG富集分析。A和B RSV感染急性期和RSV感染恢复期差异蛋白的GO富集分析，C和D RSV感染急性期和RSV 感染恢复期差异蛋白的KEGG通路富集分析。

图4为RSV感染急性期和RSV感染恢复期鉴定的差异蛋白的蛋白相互作用(Protein-protein interaction，PPI)网络与分子复合物预测组分的鉴定。A和C RSV感染急性期和感染恢复期差异蛋白的蛋白质相互作用网络；B和D RSV感染急性期和感染恢复期差异蛋白的蛋白质相互作用网络的分子复合物预测组分的鉴定；DEP：差异表达蛋白；RSV：呼吸道合胞病毒；MCODE：分子复合物检测。

图5为候选蛋白的选择和信号通路注释。(A)来自于RSV感染急性期和感染恢复期分子复合物预测组分1的节点蛋白的数量及在两期的分子复合物预测组分1共同出现的节点蛋白数量；(B)候选蛋白的相关信号通路注释；DEP，差异表达蛋白；RSV：呼吸道合胞病毒；MCODE：分子复合物检测。

图6为候选蛋白的免疫印迹分析。(A)RSV感染急性期、恢复期中4个候选蛋白(BPGMCFL1、PRDX2、TPI1)的Western blot验证；以GAPDH作为内参。(B)分析(A)中各候选蛋白的western blot条带强度，并比较这几组的表达变化。星号表示RSV感染组与对照组 (急性期与对照组、恢复期与对照组)蛋白表达差异的显著性。数据以平均值±SD表示。(C) 三组候选蛋白表达水平的变化趋势。

图7为RSV感染Hep-2细胞及RSV感染小鼠模型肺组织病理学(HE染色)。(A) 正常对照Hep-2细胞及RSV感染Hep-2细胞5天后。(B)RSV在不同感染阶段小鼠的人工单位比；(C)对照组小鼠、急性期肺组织和恢复期肺组织的病理变化；(D)RSV感染急性期、恢复期和对照组样品中4个候选蛋白(BPGM、CFL1、PRDX2、TPI1)的Western blot 验证；每组3个生物重复，以GAPDH作为内参；(E)D组中Western blot条带强度分析，数据以平均值±SD表示；(F)三组候选蛋白表达水平的变化趋势。

图8为50个RSV感染急性期、50个RSV感染恢复期患儿血清中TPI1候选蛋白的表达水平。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语"包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

除非特别说明或另有定义，本文所使用的“第一、第二…”仅仅是用于对名称的区分，不代表具体的数量或顺序。

免疫层析技术(ImmunochromatographicAssay，ICA)，免疫层析试纸条，荧光免疫层析技术，

酶联免疫检测法(ELISA)全过程包括病毒抗原的分离与纯化、病毒抗血清的制备和抗血清反应3个环节。抗血清反应实验步骤包括：抗原吸附在固相载体上，加待测抗体，再加相应酶标记抗体，生成抗原一待测抗体一酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。ELISA常用的有直接法测定抗原、竞争法测定抗原、双抗体夹心法测定抗原等方法。

TPI1：丙糖磷酸异构酶1(TPI1)，英文名称:Triosephosphate Isomerase 1(TPI1)。

BPGM：二磷酸甘油酸变位酶。

PRDX2：过氧化还原酶2。

CFL1：丝切蛋白1。

在本发明研究中，我们发现BPGM和TPI1在RSV感染样本中表达上调，在合胞病毒感染小鼠中验证了这一趋势，此外，我们又收集了更多合胞病毒感染患儿的临床样本，在这些样本中进行了BPGM和TPI1，结果显示与BPGM相比，TPI1在急性期表达显著升高，在恢复期表达明显降低，但TPI1急性期与恢复期的表达存在差异。因此，我们认为TPI1具有诊断合胞病毒感染患儿的潜力，可以作为诊断合胞病毒感染的生物标记物。

TPI1生物标记物及其TPI1检测方法通过应用抗TPI1蛋白抗体，制备成基于抗原抗体结合反应的免疫学检测方法的检测试剂，可用于呼吸道合胞病毒感染人群的血清样本检测。

本领域的技术人员，可以根据本发明公开的TPI1生物标记物，按照常规技术，制备相应出相应的检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，该试剂盒包括检测样本中TPI1蛋白含量或表达量的试剂，例如检测TPI1蛋白含量的ELISA盒或是试纸条。

本发明中，最初的RSV株(序列号20181224-218)由广州妇女儿童医疗中心实验室提供，并从患有支气管肺炎的儿童(2岁男性)的咽拭子中分离出来。HEp-2细胞在含10％胎牛血清(FBS)至75-90％融合的Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM；Gibco，美国)中培养。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞两次后，加入500μLRSV，并在35℃和5％CO2中孵育2小时。然后，加入病毒维持培养基(含有1％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM)，并将细胞在35℃和5％CO 2下孵育5天，然后测定细胞病变效应。

BALB/c小鼠购自南方医科大学实验动物中心(中国)，并饲养在实验动物中心的无特定病原体的环境中。所有动物实验均根据南方医科大学动物保护与使用委员会的指导原则进行批准和进行，并根据美国国立卫生研究院关于实验动物的护理和使用指南进行(NIH出版物No.8023，1978年修订)。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1

一、血清样本制备

分别采集健康孩子、RSV感染毛细支气管炎患儿1ml鼻咽分泌物，置于2ml生理盐水中。其中，将患儿分为2组：急性RSV感染期及恢复期各20例，健康儿童20例作为对照组。使用直接免疫荧光法检测RSV抗原。确定是合胞病毒感染后，取急性期或恢复期儿童及健康年龄/性别匹配儿童的外周血，于1000g离心10min，收集血清标本，-80℃保存。本研究涉及的所有儿童的监护人均提供了书面知情同意书，本研究经广州妇女儿童医疗中心伦理委员会批准[2015101501]，并按照世界医学协会伦理规范(赫尔辛基宣言)进行。

二、RSV感染患者的蛋白质组学分析

(1)DEP鉴定

对5个对照组、5个急性期和5个恢复期的这3组样本提取蛋白后，利用同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)确定急性期和恢复期RSV感染患者与健康对照组之间的DEPs。步骤如下：1)血清蛋白提取和定量：根据高丰度蛋白去除试剂盒ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit(Sigma，货号：PROTBA) 说明书步骤纯化蛋白，用Bradford方法进行蛋白定量。

2)蛋白FASP酶解：每个样本各取200ug蛋白，加入4μL TCEP Reducing Reagent，60℃反应1小时；再加入2μl MMTS Cysteine-Blocking Reagent(iTRAQ试剂盒自带)，室温30分钟。将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，4℃12000g离心20min，弃掉收集管底部溶液。分别加入100ul 8M尿素(PH 8.5)和100ul 0.25M TEAB(PH 8.5)，4℃12000g 离心20min，弃掉收集管底部溶液。按照胰蛋白酶与蛋白质量1:50的比例，加入胰蛋白酶， 37℃反应过夜；次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比1:100)，37℃反应4小时，12000g离心20min，收集管底部多肽。再向超滤管中加入50μl 0.5M TEAB，4℃12000g离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品。

3)iTRAQ试剂标记：向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底。取 50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中，将iTRAQ试剂填加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2小时，加入100μl水终止反应。混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底，真空冷冻干燥。

4)第一维高pH-RP液相分离：先用95％的A相，5％B相平衡柱子30min，然后将标记后抽干的混合多肽用100ul的A相复溶；进样，以0.2ml/min的流速进行梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0～5min，5％B；5～10min,5％-10％B；10～60min，10％-40％B；60～65min，40％-95％B； 65～75min，保持95％B；75min～85min，95％-5％B。整个洗脱过程在214nm吸光度下进行监测，从线性梯度开始根据峰型收取20个组分，每1管每60s接1次，梯度为85min，反复循环接样；根据峰型和时间共收取20个组分，真空干燥后，进行第二维LC-MS分析。

5)第二维反相液质联用RPLC-MS：肽段用样品溶解液(0.1％甲酸、5％乙腈)溶解，充分振荡涡旋，13500rpm，4℃离心20min，上清转移到上样管中，每个组分取3ug进行二维液相色谱分离。洗脱条件为：0～5min，5％B；5～8min，5％-10％B；8～40min，10％-30％B；40～45min， 30％-35％B；45～50min，35％-90％B；50～55min，保持90％B；55～56min，90％-5％B；56～65min，保持5％B。每个组分分析时间为65min，流速为300nL/min。分离后的肽段直接进入质谱仪 Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测。

6)数据检索：质谱仪获取RAW格式的原始质谱数据，利用Proteome Discoverer1.4(Version 1.4.0.288，Thermo Fisher)将RAW文件转换成MGF格式的质谱文件，将MGF格式的质谱文件和蛋白检索库输入ProteinPilot

以差异倍数≥1.50为上调阈值，折线变化≤0.67为下调阈值，确定了151个DEPs，它们的差异变化水平如图2A所示。RSV急性期与对照组相比，有97个DEPs，其中有54个和 43个分别上调和下调(图2B，表1)，恢复期RSV与对照组之间有111DEPs，其中72个和 39个分别上调和下调(图2B，表2)。在两个RSV感染阶段的151个DEPs中，有57个重叠，而在急性组和对照组比较中仅发现40个DEPs，在恢复期与对照组比较中发现54个DEPs (图2B)。

(2)DEP功能评估

利用PANTHER数据库对DEPs所代表的蛋白质进行了分类。急性期与对照期比较，DEPs 中最具代表性的前5类(图2C，补充表1)分别是酶调节剂(16.3％)、水解酶(16.3％)、信号分子(13.0％)、转录因子(8.7％)和受体(6.5％)。恢复期与对照比较(图2C，补充表1)，前5类蛋白分别为水解酶(15.6％)、酶调节剂(12.8％)、信号分子(12.8％)、核酸结合蛋白(8.3％)和转移酶(6.4％)。此外，在恢复期与对照组的DEPs中，仅发现了细胞粘附分子(3.7％)、细胞连接蛋白(1.8％)和裂解酶(0.9％)。为了鉴定RSV感染急性期和恢复期中DEPs的GO富集和KEGG通路，我们进行了相关分析。图3显示了富集的细胞成分、分子功能和生物过程。急性期与对照组比较(图3A)和恢复期与对照组比较(图 3B)的DEPs中，细胞成分为血液微粒、细胞质囊泡腔内、囊泡腔内和免疫球蛋白复合物。在分子功能方面，显示抗原结合、免疫球蛋白受体结合和肽酶内抑制活性。在生物过程中，显示蛋白活化级联反应、补体活化、体液免疫应答和循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答。涉及DEPs的显著富集的KEGG通路包括补体和凝血级联反应、金黄色葡萄球菌感染、胆固醇代谢、百日咳、局灶黏附和细胞外基质-受体相互作用(图3C-D)。

(3)网络分析与枢纽蛋白鉴定

为了检测DEPs之间相互作用的可能性，并鉴定其中重要的枢纽蛋白，我们构建了PPI 网络并鉴定了MCODE复合物。急性期比对照组和恢复期比对照里组DEPs组成的复合物如图4所示，各复合物中hub蛋白前三GO富集项和KEGG通路列于补充表2中。急性期与对照组比较，Hub蛋白与血小板脱颗粒、分泌颗粒腔内、血液凝固相关；恢复期与对照组比较， Hub蛋白与血液微粒、过氧化氢分解过程、过氧化氢代谢过程相关。对比的151DEPs和 MCODE复合物的完整PPI网络如图1所示，详细情况见表2。这5种MCODE复合物的顶部GO/KEGG富集项显示了它们与血液微粒、蛋白活化级联和胞浆囊腔的关联。有趣的是，一些中心蛋白在两组比较中重叠。三个中心蛋白(热休克蛋白90α家庭类成员(HSP90AA1) PRDX2,和TPI1)之间的重叠MCODE1复合物形成基于急性期比对照组,恢复期比对照组,这两组合并后比较,和另外三个中心蛋白质(热休克蛋白90αB类家庭成员1(HSP90AB1) BPGM,和CFL1)之间的重叠MCODE1复合物形成比较(图5)。这6个枢纽蛋白在急性期均上调，PRDX2、TPI1、BPGM、CFL1的差异变化为>1.7,HSP90AB1和HSP90AA1的差异变化分别为1.528和1.514，仅略超过上调阈值。差异倍数越高的蛋白验证性越好，因此我们对PRDX2、TPI1、BPGM和CFL1进行了进一步的分析。对PRDX2、TPI1、BPGM和CFL1 进行富集分析(图5B)。BPGM和TPI1主要与糖酵解途径相关；PRDX2与活性氧(ROS) 解毒途径相关，CFL1与ephrin信号通路相关。基于这些结果，我们选择PRDX2、TPI1、BPGM 和CFL1作为候选蛋白进行进一步验证。

(4)用蛋白质印迹法验证候选蛋白

为了验证蛋白组学结果，通过western blotting检测BPGM、CFL1、PRDX2和TPI1的表达水平(图6)。与对照组相比，四种蛋白的表达水平在急性期和恢复期均显著上调。4种候选蛋白在急性期表达量最高，恢复期表达量相对较低。这些结果与蛋白质组学定量结果高度一致。

(5)合胞病毒感染小鼠模型中候选蛋白的验证

接下来，我们研究了BPGM、CFL1、PRDX2和TPI1在RSV感染小鼠中的表达水平。 RSV感染5天后，HEp-2细胞表现出明显的细胞病变效应(CPE)(图7A)。接下来，用 RSV对小鼠进行鼻内饲喂，随后检测了RSV在不同感染阶段小鼠中的表达变化(图7B)。此外，RSV小鼠肺组织病理学结果显示，对照组无炎症反应，急性期组有明显炎症反应，恢复期炎症反应相对减轻(图7C)。与对照组相比，RSV急性期感染小鼠BPGM、CFL1、PRDX2 和TPI1的表达水平均显著上调，RSV恢复组感染小鼠与对照组相比，BPGM、CFL1、PRDX2 和TPI1的表达水平有上调。这些趋势与基于蛋白组学分析和Western blot分析观察到的趋势一致(图7D-F)。

三、RNA提取

(1)根据制造商说明书(Takara，中国)，使用TRIzol进行RNA提取。

(2)小鼠肺样品用TRIzol匀浆，氯仿、异丙醇和乙醇处理，并在4℃离心。

(3)提取的RNA溶解于无RNA的双蒸馏水中，使用PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara，中国)反转录成cDNA。

四、用蛋白质印迹法验证候选蛋白

为了验证iTRAQ结果，通过western blotting检测BPGM、CFL1、PRDX2和TPI1的表达水平(图6)。与对照组相比，四种蛋白的表达水平在急性期和恢复期均上调。4种候选蛋白在急性期表达量最高，恢复期表达量相对较低。其中，呼吸道合胞病毒急性期感染的儿童TPI1蛋白水平与恢复期及对照组儿童有显著差异。这些结果与蛋白质组学定量结果高度一致。

五、RSV感染小鼠模型中候选蛋白的验证

(1)RSV感染5天后，HEp-2细胞表现出明显的细胞病变效应(CPE)(图7A)。

(2)用RSV对小鼠进行鼻内饲喂，发现RSV在感染的不同阶段都有显著变化(图7B)。此外，小鼠肺组织病理学观察显示，对照组无炎症反应，RSV感染急性期组有明显炎症反应，RSV 感染恢复期炎症反应相对减轻(图7C)。这些结果表明，RSV感染小鼠模型的建立是成功的。

(3)与对照组相比，RSV感染小鼠急性组BPGM、CFL1、PRDX2和TPI1的表达水平均显著上调，RSV感染小鼠恢复期组与对照组相比，BPGM、CFL1、PRDX2和TPI1的表达水平上调。这些趋势与基于蛋白组学结果和Western blot分析观察到的趋势一致(图7D-F)。

六.大样本的RSV感染患儿中BPGM和TPI1的表达检测

分别收集50个RSV感染急性期、50个RSV感染恢复期患儿血清样本，我们选择了与正常组相比，急性期变化最大的两个蛋白BPGM和TPI1，用western blotting进一步检测BPGM 和TPI1的表达情况，参见图8，结果显示TPI1在三组中进行两两比对都有显著差异，而BPGM 在急性期与恢复期的比较中，没有差异，故我们选择TPI1蛋白做诊断合胞病毒感染患儿的生物标记物。

表1急性期RSV感染儿童的DEP(DEPs in children with RSV infection inacute-phase)

表2恢复期RSV感染儿童的DEP(DEPs in children with RSV infection inconvalescence)

本发明提供的差异表达蛋白TPI1可用于快速准确诊断呼吸道合胞病毒患儿，与目前的各种临床诊断方法相比，它是一种客观的评价方法，具有取材方便、操作简单、特异性强等优点，因此本发明有极大的临床应用可能。故可以制备一种可定量检测TPI1的试剂盒，即可用于呼吸道合胞病毒的诊断。可为患儿的快速诊断及后续的诊治以及预后带来福音。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。