用于改善生长性能的动物饲料

摘要

浓缩的藻类残渣可溶物被证明是一种用于饲喂动物，特别是用于改善肉牛的生长性能的有益饲料成分。

说明书

浓缩的藻类残渣可溶物被证明是用于饲养动物，特别是用于提高肉牛的生长性能的有益饲料成分。

本发明是在美国农业部授予的2016-31100-06031和NA/NI18HFPXXXXXG045及NA/NI17HFPXXXXXG047的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定权利。

随着对于生产用于人类食品和动物饲料两者的藻类来源的ω-3脂肪酸的兴趣增加，藻类工业的副产物可能成为替代的用于牛的饲料成分。藻类生物质是蛋白质、纤维和脂肪的潜在来源，其可为牛膳食贡献必需的营养物质。由于生产用于动物饲料行业(主要是水产养殖和宠物食品)的ω-3脂肪酸，正在利用异养藻类商业生产浓缩的藻类残渣可溶物(CARS；Veraferm，Veramaris，Delft，Netherlands)。CARS是在不使用有机溶剂的情况下从藻类细胞中提取油脂后，将藻类葡萄糖发酵产生的残渣进行浓缩而产生的，并且具有糖浆的稠度。用于生产CARS的藻株是属于不等鞭毛类(Stramenopiles)群的微藻裂殖壶菌属(Schizochytrium)藻株。将脱脂Schizochytrid生物质浓缩至30-50wt％，优选约40wt％的干物质含量来生产CARS。因此，根据本发明，CARS也称作脱脂不等鞭毛类生物质悬浮液或脱脂Schizochytrid生物质悬浮液。

海洋藻类一般是光合自养型，已在动物膳食中利用了多年，并且能利用光合作用以用简单无机物作为能量和营养物(Lum等，2013)。使用复杂有机物质作为养料生长的异养藻类可导致改善的产量和生长效率，从而改善将藻类用作家畜饲粮的经济性(Ogbonna等，1997；Bryant等，2012)。Van Emon等(2015)用异养微藻粕(57％微藻、43％大豆皮)饲喂生长的牛。他们观察到随着替代湿玉米蛋白饲料的藻粉的量从膳食DM的0增加至45％，DMI更高，ADG趋于增加，G:F降低。将类似的藻粉(43％部分脱油的异养微藻和57％大豆皮)以膳食DM的0-42％的量替代玉米饲喂育肥牛(Stokes等，2016)。他们报道了随着在膳食中包含量增加，HCW无变化，并且计算出的膳食NEg含量线性下降。这些结果表明当与大豆皮混合时，藻类产品是合适的牛饲料。几乎没有关于藻类作为饲料成分进行的研究，也没有进行将CARS饲喂给牛的研究。因此，本研究的目的是评价CARS作为牛膳食中饲料成分的安全性以及对膳食中增加的包含量的性能反应。

出乎意料的是，根据本发明发现CARS与另外的饲粮成分的混合物对肉牛的性能具有显著的积极影响，特别是对干物质采食(DMI)、平均日增重(ADG)、增重饲料比(G:F)、维持净能(NEm)和生长净能(NEg)。

因此，本发明的第一主题是包含以下的动物饲料：

a)干物质的50-80wt％的谷物；

b)干物质的0.1-15wt％，优选0.5-10wt％，特别是1-6wt％的不等鞭毛类生物质；

选自以下的至少一种，优选至少两种、三种或四种另外的组分：

c)干物质的多达40wt％的量的来自酒糟/乙醇工业的副产物；

d)干物质的多达20wt％的量的草料；

e)干物质的多达20wt％的量的蛋白粉；

f)干物质的多达4wt％的量的另外的脂肪源；

g)干物质的多达10wt％的量的另外的液体副产物。

可使用计算机程序来计算不同组分的最优量，以确定用于实现对于待用该饲粮饲喂的动物而言优化且优选廉价的饲料膳食的组分及其最优量，其中所得饲料优选满足或更优选超过动物营养学家熟知的NRC表格中记录的相应动物的营养需求。

如果未另外明确指出，根据本发明，关于动物饲料的组分的wt％数字总是涉及动物饲料的干物质含量。

在本发明的优选实施方式中，特别是在用于饲养肉牛的饲料中，动物饲料具有大于干物质的20wt％，特别是20-40wt％，优选25-35wt％的粗蛋白含量和/或大于干物质的25wt％，特别是25-45wt％，优选30-40wt％的中性洗涤纤维(NDF)含量。

在根据本发明的饲粮中，谷物优选选自玉米、大麦、高粱、小麦以及它们的混合物，优选玉米。

进一步地，优选以0.5-40wt％，特别是2-40wt％，更优选5-30wt％，特别是10-25wt％或10-20wt％的量含有酒糟/乙醇工业的副产物(如果存在)，并且酒糟/乙醇工业的副产物优选选自玉米酒糟、大麦酒糟、高粱酒糟、小麦酒糟以及它们的混合物，优选玉米酒糟。

进一步地，优选以0.1-20wt％，更优选1-20wt％，特别是5-15wt％的量含有草料(如果存在)，并且草料优选选自禾本科干草、苜蓿干草、牧草青贮、玉米青贮、黑麦青贮以及它们的混合物。

在本发明的优选实施方式中，饲粮优选以0.5-20wt％，特别是2-20wt％的量包含蛋白粉，其中蛋白粉优选选自油菜籽粉、大豆粉以及它们的混合物。

在本发明的优选实施方式中，饲粮优选以0.5-4wt％，特别是1-4wt％的量包含另外的脂肪源，其中脂肪源优选选自油脂、家禽脂肪、植物油(例如玉米和菜籽油)以及它们的混合物。

在本发明的优选实施方式中，饲粮优选以0.5-10wt％，特别是1-10wt％的量包含另外的液体副产物，其中另外的液体副产物优选选自糖蜜产物、玉米浆、甘油以及它们的混合物。

动物饲料优选进一步优选以干物质的0.05-2wt％的量包含矿物质和维生素补充剂。

本发明的特别优选的实施方式是包含以下的动物饲料：

a)干物质的50-80wt％的谷物；

b)干物质的0.1-15wt％，优选0.5-10wt％，特别是1-6wt％的不等鞭毛类生物质；

c)干物质的多达40wt％的量，优选干物质的5-20wt％的量，更优选干物质的5-30wt％的量的来自酒糟/乙醇工业的副产物；

d)干物质的多达20wt％的量，优选干物质的5-15wt％的量的草料。

根据本发明的不等鞭毛类生物质优选为裂解的生物质或其水性悬浮液，更优选脱脂生物质或其水性悬浮液。可通过本领域技术人员已知的方法，通过对细胞施加机械应力和/或通过酶处理来获得裂解的不等鞭毛类生物质或其水性悬浮液。可如例如在WO 2018/011275和WO 2018/011286中公开的那样获得脱脂生物质或其水性悬浮液。

因此，“脱脂生物质”是指特别是如下文进一步公开的已进行油脂分离工艺后的不等鞭毛类生物质的残渣，特别是如WO 2018/011275和WO 2018/011286中所公开的。

因此，本发明的另外的特别优选的主题是包含以下的动物饲料：

a)干物质的50-80wt％的谷物；

b)干物质的0.1-15wt％，优选0.5-10wt％，特别是1-6wt％的脱脂不等鞭毛类生物质或其水性悬浮液；

选自以下的至少一种，优选至少两种、三种或四种另外的组分：

c)干物质的多达40wt％的量的来自酒糟/乙醇工业的副产物；

d)干物质的多达20wt％的量的草料；

e)干物质的多达20wt％的量的蛋白粉；

f)干物质的多达4wt％的量的另外的脂肪源；

g)干物质的多达10wt％的量的另外的液体副产物。

因此，本发明的另外的特别优选的主题还是包含以下的动物饲料：

a)干物质的50-80wt％的谷物；

b)干物质的0.1-15wt％，优选0.5-10wt％，特别是1-6wt％的脱脂不等鞭毛类生物质或其水性悬浮液；

c)干物质的多达40wt％的量，优选干物质的5-20wt％的量，更优选干物质的5-30wt％的量的来自酒糟/乙醇工业的副产物；

d)干物质的多达20wt％的量，优选干物质的5-15wt％的量的草料。

根据本发明，不等鞭毛类生物质的细胞优选选自以下微生物的群：Hamatores、Proteromonads、Opalines、Developayelle、Diplophrys、Labrinthulids、Thraustochytrids、Biosecids、卵菌纲(Oomycetes)、Hypochytridiomycetes、Commation、Reticulosphaera、Pelagomonas、Pelagococcus、Ollicola、Aureococcus、Parmales、硅藻类(Diatoms)、黄藻(Xanthophytes)、Phaeophytes(褐藻)、Eustigmatophytes、Raphidophytes、Synurids，Axodines(包括Rhizochromulinaales、Pedinellales、Dictyochales)、Chrysomeridales、Sarcinochrysidales、Hydrurales、Hibberdiales和Chromulinales。

根据本发明的生物质特别用于提供裂解和/或脱脂的生物质，优选包含并且优选基本上由分类单元网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)(盘蜷纲(Labyrinthulea)、网粘真菌(net slime fungi)、网粘菌(slime nets))的细胞，尤其是来自破囊壶菌科的那些细胞组成。破囊壶菌科(Thraustochytrids)包括Althomia属、不动茶菌属(Aplanochytrium)、Aurantiochytrium属、葡萄壶菌属(Botryochytrium)、Elnia属、日本壶菌属(Japonochytrium)、Oblongichytrium、Parietichytrium、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、Sicyoidochytrium、破囊壶菌属(Thraustochytrium)或吾肯氏壶菌属(Ulkenia)。生物质特别优选包含来自Aurantiochytrium属、Oblongichytrium、裂殖壶菌属或破囊壶菌属，最好是来自裂殖壶菌属的细胞。

因此，本发明的另外的特别优选的主题是包含以下的动物饲料：

a)干物质的50-80wt％的谷物；

b)干物质的0.1-15wt％，优选0.5-10wt％，特别是1-6wt％的脱脂Schizochytrid或Thraustochytrid生物质或其水性悬浮液；

选自以下的至少一种，优选至少两种、三种或四种另外的组分：

c)干物质的多达40wt％的量的来自酒糟/乙醇工业的副产物；

d)干物质的多达20wt％的量的草料；

e)干物质的多达20wt％的量的蛋白粉；

f)干物质的多达4wt％的量的另外的脂肪源；

g)干物质的多达10wt％的量的另外的液体副产物。

因此，本发明的另外的特别优选的主题还是包含以下的动物饲料：

a)占干物质的50-80wt％的谷物；

b)干物质的0.1-15wt％，优选0.5-10wt％，特别是1-6wt％的脱脂Schizochytrid或Thraustochytrid生物质或其水性悬浮液；

c)干物质的多达40wt％的量，优选干物质的5-20wt％的量，更优选干物质的5-30wt％的量的来自酒糟/乙醇工业的副产物；

d)干物质的多达20wt％的量，优选干物质的5-15wt％的量的草料。

根据本发明的生物质优选脱脂生物质或其水性悬浮液。脱脂生物质是优选通过如WO 2018/011275或WO 2018/011286中公开的工艺去除了大部分脂质的生物质。由于从生物质中非常有效地分离了油脂，生物质中的剩余油脂优选小于生物质中初始含有的油脂的20wt％，优选小于15wt％，更优选小于10wt％。但是，由于不能通过此类工艺完全除去油脂，在根据本发明的脱脂生物质中也仍然含有相当量的油脂。这意味着根据本发明的术语“脱脂生物质”是指优选通过如WO 2018/011275中公开的工艺或方法去除了大部分油脂，但仍然含有相当部分的脂质，特别是含有PUFA的脂质的裂解生物质。因此，根据本发明的“脱脂生物质”也可称作“部分脱脂生物质”或“基本上脱脂的生物质”。

根据本发明的生物质优选总体上基本上不含非极性有机溶剂，更优选不含有机溶剂，并且优选总体上仅含有少量氯化钠，优选少量盐酸盐。其优选总体上以小于0.2wt％的量，更优选小于0.1wt％的量含有非极性有机溶剂，特别是有机溶剂(如果存在)。

根据本发明的脱脂不等鞭毛类生物质可以以不同的施用形式用作饲料成分，特别是作为干生物质或水性悬浮液。根据本发明的“干生物质”是指具有至少90wt％，优选至少95wt％的干物质含量的生物质。

如果将不等鞭毛类干生物质用作饲料成分，则干生物质优选以3-14wt％的量，特别是约4wt％至约14wt％，优选约4.5wt％至约12wt％的量，更优选约5wt％至约10wt％量的包含脂质(粗脂肪)。进一步地，脂质优选以10-70wt％的量，更优选以30-60wt％的量优选包含至少一种选自DHA和EPA的PUFA。在本发明的优选实施方式中，脂质含有DHA和EPA的混合物，其中DHA与EPA的比例优选为3:2-4:1，并且其中DHA的量优选为所含脂质总量的30-50wt％，且EPA的量优选为所含脂质总量的10-20wt％。

干生物质优选进一步以15-25wt％的量，更优选以17-23wt％的量包含氨基酸，并且优选具有25-35wt％的粗蛋白含量。生物质优选进一步具有小于5wt％，优选小于2wt％，更优选约0wt％的粗纤维含量。

在本发明的优选实施方式中，将脱脂不等鞭毛类生物质，特别是脱脂Schizochytrid或Thraustochytrid生物质的水性悬浮液用作饲料补充剂，其中水性悬浮液具有优选20-55wt％，更优选30-50wt％，特别是35-45wt％的干物质含量。此类悬浮液的生产优选从脱脂生物质开始进行，并且在WO 2018/011275中更详细地公开。

如果使用脱脂不等鞭毛类生物质，特别是脱脂Schizochytrid或Thraustochytrid生物质的水性悬浮液，则水性悬浮液优选2-10wt％，更优选3-8wt％，特别是4-6％wt的量包含脂质(粗脂肪)。进一步地，脂质优选以10-70wt％的量，更优选以30-60wt％的量优选包含至少一种选自DHA和EPA的PUFA。在本发明的优选实施方式中，脂质含有DHA和EPA的混合物，其中DHA与EPA的比例优选为3:2-4:1，并且其中DHA的量优选为所含脂质总量的30-50wt％，且EPA的量优选为所含脂质总量的10-20wt％。

水性悬浮液优选进一步以8-18wt％，更优选10-16wt％的量包含粗蛋白和/或以8-14wt％，更优选9-13wt％的量包含粗灰分和/或以小于1wt％，更优选小于0.2wt％，特别是约0wt％的量包含粗纤维。

可例如通过借助于流化床制粒对生物质进行喷雾制粒而将水性悬浮液转化为干生物质。在EP13176661.0中更详细地公开了借助于流化床制粒的喷雾制粒。

脱脂生物质的完整细胞优选产生多不饱和脂肪酸(PUFA)。优选的PUFA是ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸，尤其优选ω-3脂肪酸。非常优选的ω-3脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA，20:5ω-3)，特别是(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-5,8,11,14,17二十碳五烯酸，以及二十二碳六烯酸(DHA，22:6ω-3)，特别是(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸。

在本发明的非常优选的实施方式中，采用细胞，特别是裂殖壶菌属藻株用于获得脱脂生物质，其同时产生显著量的EPA和DHA，其中细胞以优选至少20wt％的量，优选至少30wt％的量，特别是30-50wt％的量产生DHA，并且以至少5wt％的量，优选至少10wt％的量，特别是10-20wt％的量产生EPA(分别与细胞中所含脂质的总量有关)。同时产生显著量的EPA和DHA的裂殖壶菌属微生物的优选种类，如以前所提及，以登记号PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211、PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215保藏于ATCC。

根据本发明的动物饲料可用作不同种类的动物的饲料，特别是用于饲养家禽；猪；水貂；反刍动物，特别是肉牛或犊牛；绵羊；山羊；伴侣动物或水产养殖动物。在本发明的非常优选的实施方式中，动物饲料用于饲养肉牛。

因此，本发明的另外的主题是饲喂以下动物的方法：家禽；猪；水貂；反刍动物，特别是肉牛或犊牛；绵羊；山羊；伴侣动物或水产养殖动物，其中用根据本发明的动物饲料饲喂动物。

本发明的非常优选的主题是饲养肉牛的方法，其中用根据本发明的动物饲料饲喂肉牛。

优选地，进行本发明的方法以改善动物的干物质采食、平均日增重、增重饲料比、维持净能和/或生长净能和/或增加动物的肉中的PUFA的含量。

本发明的另外的主题是提高动物的干物质采食、平均日增重、增重饲料比、维持净能和/或生长净能和/或增加动物的肉中的PUFA含量的方法，其中用根据本发明的含有生物质或生物质悬浮液的动物饲料饲喂动物。

材料与方法

以下实验是在东内布拉斯加研究与推广中心(ENREC；Mead，NE附近)、内布拉斯加大学动物科学园(Lincoln，NE)和内布拉斯加大学兽医诊断中心(UNL VDC；Lincoln，NE)进行的。实验的动物处理和空间符合农业研究和教学中农业动物的管理和使用指南(Guidefor the Care and Use of Agricultural Animals in Agricultural Research andTeaching)(FASS，2010)。

概述的作为本研究一部分的所有程序已得到内布拉斯加大学林肯分校机构动物管理与使用委员会的批准(方案号1517)。由于CARS目前尚未获得FDA的批准饲喂进入人食品链的牛，在进行组织集中采样后，在实验完成时将所有牛焚化。

如WO 2018/011275的实施例1中所公开的，通过酶促裂解Schizochytrid生物质并随后浓缩裂解细胞混合物来生产CARS。如WO 2018/011275的实施例1中所公开的，在对裂解生物质进行破乳、中和并分离出粗油后，将剩余的细胞碎片在水相中重悬。经由蒸发将由此获得的水相浓缩至干物质含量约40wt％，得到根据本发明的用于动物试验的CARS。

实验设计

使用40头杂种牛(20头小公牛和20头小母牛，初始BW 255kg，SD＝14)进行试验。接收时，所有牛接种了溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)、牛鼻气管炎病毒、牛腹泻病毒(1型和2型)、3型副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒组合疫苗(Bovi-shield OneShot，Zoetis，Florham Park，NJ)；针对7种梭菌疾病和睡眠嗜血杆菌(Haemophilussomnus)的菌苗类毒素(Ultrabac-7，Zoetis)；含有牛鼻气管炎病毒、3型副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒的鼻内疫苗(Inforce 3，Zoetis)，用1％w/v多拉菌素(10mg/mL，Dectomax，Zoetis)驱虫，并接受10mL γ-氟氯氰菊酯浇泼剂(pour-on)(Elanco StandGuard，Elanco，Greenfield IN)。用一个4位数字的平板标签、具有相同4位数字标识的金属夹以及电子ID对牛进行标记。用Calan门系统(American Calan Inc.，Northwood，NH)在分隔开小公牛和小母牛的两个围栏内单独饲喂所有牛。在试验开始前，犊牛接受了3周训练期以适应Calan门系统。

每头动物具有大约46cm的线性槽空间(46linear cm of bunk space)。在研究设施内由经训练的动物管理人员饲喂后，记录每头动物的每日观察结果；持续记录每日观察表格。

在试验开始前5天，牛限制饲喂2％BW的50％甜麸(Cargill corn milling，Blair，NE)和50％苜蓿干草的普通膳食(Watson等，2013)。连续3天在饲喂前对牛称重以减少肠道填充造成的误差，并将平均值作为初始BW。将第1天和第2天的重量取平均值，并将牛通过初始BW层级分为10个区组，其中区组1、3、5、7和9代表最重至最轻的小公牛，区组2、4、6、8和10代表最重至最轻的小母牛，在各区组中表示各处理。在称重的第3天，额外用相应的槽ID号将牛进行耳标。

将4种膳食处理随机分配至区组内的动物。膳食包含增加的CARS(膳食DM的0％、2.5％、5％和7.5％；表1)，替代膳食中的干压制玉米(70.0％、67.5％、65.0％和62.5％)。所有膳食含有15％湿酒糟、10％禾本科干草和5％补充剂(以DM为基础计)。由于CARS的高Na含量(表2；DM的8.5％)，配制了2种补充剂，一种用于0％CARS处理，且另一种用于7.5％CARS处理。将两种补充剂混合在一起用于2.5％和5％CARS膳食中。配制了补充剂以将膳食Na含量限制为膳食DM的1％。补充剂包括石灰石、尿素、微量矿物质预混物、维生素ADE预混物、动物油脂、瘤胃素(每头动物每天330mg；Elanco Animal Health)和泰乐菌素(每头动物每天90mg；Elanco Animal Health)，以细磨玉米粉为载体。牛每天任意饲喂一次(07：00)。

每周收集拒食饲料，称重，然后在60℃的鼓风烘箱(forced air oven)中干燥48小时以计算每个个体准确的DMI。每周取样总混合口粮和各成分(CARS、干压制玉米、湿酒糟、禾本科干草和补充剂)大约各400克。将样品复合为3周期间的样品(4种膳食和各成分的每种的6个复合样品)，然后分析DM、OM、NDF、ADF)、CP、常量矿物质和微量矿物质(WardLaboratories，Inc.，Kearney，NE)和二十二碳六烯酸(DHA)及二十碳五烯酸(EPA；EurofinsScientific，Des Moines，IA；表3)。膳食中的DHA和EPA水平用于确认CARS的用量，因为CARS是膳食中DHA和EPA的唯一来源。净能计算是通过Vasconcelos和Galyean(2008)使用的二次方程求解来计算的。

血液和尿液分析

在第0、33、61、90天和收获日获得临时BW、尿液、血液和兽医观察结果。

在每个采集日，使牛经过斜槽、称重并由兽医进行肉眼评估以检查其正常行为和总体健康。然后给牛服用利尿剂呋塞米(每45kg BW 2mL，Lasix，Validus PharmaceuticalsLLC，Parsippany，NJ)以刺激排尿。使用50mL锥形管获得尿液样品。

在采集期间将尿液冷却，并将样品立即运送至UNL VDC(Lincoln，NE)进行尿液分析，包括蛋白质、pH、酮体、胆红素、尿胆原葡萄糖(Chemstrip 2GP，2LN，9，10和SG，RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)和显微镜检查。用2只Vacuette Tube 6mL K2E K2EDTA(Greiner Bio-One GmbH，Monroe，NC)和2只Corvac Integrated Serum Separator Tube(Covidien，Mansfield，MA)对每只动物通过颈静脉穿刺采集血样。采集后将血液样本冷却并立即运送至UNL反刍动物营养实验室(Lincoln，NE)。在实验室中，将血清试管样品在4℃冰箱中放置1小时，然后在4℃以1250×g离心10分钟。将血液和血清样品连夜送至爱荷华州立大学兽医病理实验室(Ames，IA)以进行常规血液学和血液生物化学检查。血液学包括白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、平均血球体积(MCV)、平均血球血红蛋白(MCH)、平均血球血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)、平均血小板体积(MPV)、血小板计数以及中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞，血浆蛋白、纤维蛋白原、血细胞比容和血红蛋白浓度。血液生物化学指标包括Na、K、Cl、Ca、P、Mg、血液尿素N(BUN)、肌酐、葡萄糖、总蛋白、白蛋白、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶、总胆汁酸、碳酸氢盐和胆固醇。

器官收获

在目标BW为454kg(419±22kg)时收获各区组，第1和第2区组在第97天，第3和4区组在第104天，第5和第6区组在第111天，第7和第8区组在第118天，并且第9和第10区组在第125天。

在每个收获日，饲喂前在ENREC对所有牛在06：30分别称重。

在斜槽中将当天待屠宰的8头牛从颈静脉取血样，然后将其关在分栏中。其余的牛也称重，然后回到其栏内。记录所有动物的兽医观察结果。然后将8头挑选出的动物运送至内布拉斯加大学动物科学园(Lincoln，NE)，将它们关在两个3.6×6m的栏中(小公牛与小母牛分开)，可以自由饮水。

将牛2头一组从动物科学园用拖车载运至UNL VDC进行收获。在区组内随机分配屠宰顺序以避免安乐死的时间偏差。在小母牛之前先对小公牛进行收获。给牛注射戊巴比妥钠(390mg/mL，每45kg体重1mL，Fatal-Plus，Vortech Pharmaceuticals，Dearborn，MI)以对动物实施安乐死并放血。

由对处理不知晓的病理学家监督尸体剖检并记录了肉眼发现。

从膝和肘处摘除脚。从寰椎处摘除头并从胸腔处剥皮。死亡后通过针头和注射器直接从膀胱进行尿液采集。取出内脏后，剥除剩余的皮。分离器官，取出，清洗，称重，然后一式两份取样(每个样品约10g)。评价的器官和组织包括：脑、脊髓(2个节段)、脾、肺、胰腺、骨骼肌、瘤胃、网胃、重瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、盲肠、结肠、肾、膀胱、垂体、甲状腺、肾上腺、肝、胆囊、心脏、肠系膜淋巴结、皮肤、前列腺、眼、骨和骨髓、骨髓涂片、回肠和胸腺。对于小母牛，还评价了卵巢、乳腺和子宫。整个组织采集和尸体剖检后，在UNL VDC将牛焚化。

由于在第一个收获日导轨和提升系统的机械故障，区组2的小母牛(4头动物)关在内布拉斯加大学动物科学园过夜。

小母牛单独关入栏中，并且允许自由饮水和采食分配给其的处理膳食(与前一天相同的量)。夜间修好了导轨和提升系统，并按相同程序在第二天对小母牛进行收获。其余日期按计划进行，每天对8只动物进行收获。

初步鼠实验

在进行牛饲喂研究前，使用细菌回复突变测定(Ames试验)和小鼠未成熟红细胞的体内微核试验以及大鼠重复剂量毒性研究评价了此新型饲料成分的安全性。由欧陆集团产品安全实验室(Dayton，NJ)按照美国FDA颁布的GLP法规(CFR第21篇，第58部分；1987年生效)进行所有研究，并遵循经济合作与发展组织(OECD)的化学和食品成分测试指南第4节，第471、474和408部分。

在Ames试验(Ames等，1973)中，根据使用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)菌株TA 98、TA 100、TA 1535、TA 1537和试验菌株大肠杆菌(Escherichiacoli)WP2 uvrA的平皿掺入试验研究了CARS诱导基因突变的潜力。在两个独立的实验中，使用数个浓度(至多5000μg/板)的测试物。

每个实验在经代谢活化和未经代谢活化的情况下进行。在5种试验菌株中均未观察到测试物的毒性作用。在任何浓度水平下用CARS处理后，在两个实验中代谢活化存在或不存在的情况下均未观察到回复突变菌落数的生物学相关增加，表明CARS无致突变潜力。

还通过14天的大鼠膳食毒性研究对CARS的安全性进行了评价，随后用Sprague-Dawley大鼠进行90天的亚慢性膳食研究。在90天的研究(OECD测试指南474)中，将试验材料以0.5％(5000ppm)、1.5％(15000ppm)和5.0％(50000ppm)的膳食水平添加至基础膳食中。每个实验组由每种性别的10只动物组成。通过基于膳食中二十二碳六烯酸(DHA)含量的分析确认了膳食中CARS的稳定性、均匀性和浓度(欧陆集团中央分析实验室，Metairie，LA)。在雄性和雌性大鼠中，BW、增重、饲料消耗或饲料效率无变化，可归因于测试物质的施用。在血液学、凝血、临床生物化学和尿液分析参数方面没有与受试物有关的变化。没有与CARS有关的宏观重量或器官重量变化。与测试物质有关的显微镜发现包括在高用量(50000ppm)雄性中观察到的胰腺腺泡细胞增生(在10只动物的3只中发现)。

因此，在研究条件下，根据评价的毒理学终点，确定了啮齿类膳食中CARS的无不利作用的施用水平为膳食的1.5％(15000ppm)，相当于雄性和雌性大鼠每日的总平均CARS采食为每千克BW 1071mg。这些初步实验在当前的牛饲喂试验前完成，并且表明CARS无毒性作用。

统计分析

使用SAS(SAS Inc.，Cary，NC)的混合程序作为随机化完全区组设计，以处理、性别和处理-性别交互作用为固定效应，BW区组为随机效应，并且个体动物为实验单位对性能数据(BW、ADG、DMI、G:F、HCW、NEm、NEg和器官重量)进行分析。如果交互作用不显著，则将其从模型中去除。正交对比用于测试由于CARS包含量引起的线性响应、二次响应和三次响应的显著性。用基于表明最佳模型拟合的最低赤池信息量准则评分选择的优化协变量结构，作为重复指标分析了血液和尿液数据(Littell等，1998)。对于尿液中测得的一些变量(上皮细胞、无定形结晶、三磷酸盐结晶、WBC、血液、蛋白质、红细胞大小不均、棘形红细胞和棘红细胞)，采集定性数据，然后转换为数字进行分析(0＝无、1＝少、2＝中等、3＝多)。

小于或等于0.05的概率被认为是显著的，小于或等于0.10的概率被认为有趋势。

结果与讨论

牛性能

对于性能数据，性别与处理之间不存在交互作用(P≥0.25)。

对于所有变量，性别是显著的(P≤0.04)，其中与小母牛相比，小公牛具有较大的DMI、初始BW、ADG、HCW和最终BW。CARS处理之间初始BW无差异(P≥0.27)。对于DMI观察到存在二次响应(P＝0.01；表4)，其中饲喂2.5％CARS的牛具有最大DMI(8.98kg/d)。对于ADG存在二次响应(P<0.01)，其中饲喂2.5％和5％CARS的牛具有最大数值(1.40kg和1.37kg)。对于活体最终BW存在二次响应(P<0.01)，其中饲喂2.5％和5％CARS的牛最大(分别为428kg和427kg)。饲喂7.5％CARS的牛具有最低的DMI和ADG(P≤0.01)；然而，此处理导致较大的G:F(0.186)，随着膳食中藻类包含量的增加而线性增加(P<0.01)。随着CARS包含量增加，NEm和NEg均线性增加(P<0.01)。相对于玉米对照膳食，饲喂含有2.5％、5％或7.5％CARS的膳食的牛的G:F改善了4.2％、11.4％和12.0％。

该试验中评价的CARS与给牛饲喂的其它基于藻类的饲粮不同，并且在先前研究中也进行了评价(Franklin等，1999；Drewery等，2014；Van Emon等，2015；Costa等，2016；Stokes等，2016)。由于初始藻类饲粮和CARS生产的加工方法两者，营养谱是独特的。先前的许多研究也将藻渣与其它饲料(如大豆皮)组合饲喂(Van Emon等，2015；Stokes等，2016)或饲喂给生长的牛(Drewery等，2014；Van Emon等，2015；Costa等，2016)。在育肥牛的试验中，以43％部分脱油的藻渣和57％大豆皮组成的粉料替代多达42％的膳食干压制玉米(Stokes等，2016)。作者报道了最终BW或ADG无差异，但由于藻粉替代了膳食中的玉米，G:F线性下降。这导致随着藻粉包含量增加，膳食ME和NEg均线性下降。当前试验的结果表明饲喂多达膳食DM的7.5％的藻渣线性提高了G:F和膳食NEg。这与Stokes等(2016)试验中藻粉的最低包含量(14％膳食DM)是类似的藻类包含量。藻渣根据生长的种类和用于生产的制造工艺而不同。在当前试验中评价的CARS产品似乎适合于以多达膳食DM的7.5％替代精膳食的玉米，改善了多达膳食DM包含量的5％中的ADG和G:F。

器官重量

以绝对器官重量和器官重量占调低的(shrunk)BW(SBW，考虑到肠道填充，最终BW调低4％)的百分比分析器官重量。

脾、肺、瘤胃、网胃、重瓣胃、回肠、盲肠、肾、垂体、肾上腺、眼、胸腺、子宫、卵巢、前列腺和精囊的器官重量在各处理之间不存在显著差异(P≥0.16)。

随着膳食中CARS包含量增加，胰腺重量线性增加(P＝0.02)；然而，这可归因于难以区分胰腺和与胰腺相连的脂肪。对于脑重量，观察到存在二次响应(P＝0.04)；饲喂5％CARS的牛具有最大的脑重量(387g)，与饲喂0和2.5％CARS的牛无差异(P≥0.10)但大于饲喂7.5％CARS的牛(356g)(P＝0.01)。随着膳食中CARS包含量增加，肝重量线性增加(P<0.01)。甲状腺重量具有二次响应(P＝0.02)，其中饲喂2.5％CARS的牛具有最大重量(31.8g)，与饲喂0％CARS的牛有统计学差异(P<0.01)，但与饲喂5％和7.5％CARS的牛无差异(P≥0.11)。对于皱胃重量，存在二次响应(P＝0.04)，其中饲喂0％CARS的牛具有最小重量(1.25kg)，且饲喂5％CARS的牛具有最大重量(1.41kg)。类似地，对于十二指肠重量，存在二次响应(P＝0.03)，其中饲喂0％CARS的牛具有最小重量(273g)，且饲喂5％CARS的牛具有最大重量(326g)。各处理之间的十二指肠重量差异可归因于十二指肠终结且空肠起始处判断的不同。对于膀胱重量，观察到存在三次响应，其中饲喂2.5％CARS的牛具有最大重量(116g)，且饲喂5％CARS的牛具有最小重量(96.4g)。膀胱重量的差异小，且三次响应表明差异是由于测量的变化和误差而非由于处理造成的生物学差异引起的。

对于空肠重量，存在性别×处理交互作用的趋势(P＝0.08)，其中饲喂7.5％CARS的小公牛具有最大重量(6.33kg)，且饲喂5％CARS的小母牛具有最大重量(5.69kg)。对于胆囊重量，存在性别×处理交互作用(P＝0.02)，其中有二次响应(P<0.01)。饲喂2.5％CARS的小公牛具有最大重量(81.6g)，且饲喂5％CARS的小母牛具有最大重量(107g)。心脏也具有性别×处理交互作用(P＝0.04)，其中饲喂7.5％CARS的小公牛具有最大心脏重量(2.21kg)，且饲喂5％CARS的小母牛具有最大心脏重量(2.07kg)。结肠也具有性别×处理交互作用(P＝0.02)，其中饲喂7.5％CARS的小公牛具有最大结肠重量(4.38kg)，且饲喂2.5％CARS的小母牛具有最大结肠重量(4.93kg)。

器官重量占SBW的％

脾、肺、瘤胃、网胃、重瓣胃、皱胃、十二指肠、回肠、盲肠、肾、膀胱、脑、垂体、肾上腺、胸腺、前列腺、精囊、子宫、卵巢和结肠的作为SBW的％的器官重量在各处理之间不存在显著差异(P≥0.07)。观察到作为SBW的％的肝重量有差异，其中有二次响应(P<0.01)；饲喂7.5％CARS的牛具有最大重量(2.05kg)。甲状腺也具有二次响应(P＝0.04)，但由于处理造成的差异小，为SBW的0.006％-0.008％。随着膳食中CARS包含量的增加，胰腺和眼的重量均线性增加(P≤0.01)。

空肠具有性别×处理交互作用(P＝0.04)，并且随着膳食中CARS包含量的增加而线性增加(P<0.01)。结肠重量存在性别×处理交互作用(P＝0.04)，其中饲喂2.5％和5％CARS的小公牛具有最小结肠，且饲喂2.5％和5％CARS的小母牛结肠重量增加(P≤0.04)。作为SBW的％的结肠重量存在小母牛大于小公牛的趋势(P＝0.07)。作为SBW的％的膀胱重量存在性别×处理交互作用(P＝0.01)，其中饲喂2.5％CARS的小公牛具有最大膀胱重量，且饲喂5％的CARS的小母牛具有最大膀胱重量。作为SBW的％的心脏重量存在性别×处理交互作用(P＝0.03)。

随着膳食中CARS包含量增加，小公牛的心脏重量从SBW的0.444％线性增加至0.554％，且小母牛的心脏重量从0.454％线性增加至0.515％(P＝0.01)。

绝对器官重量和作为SBW的％的器官重量与文献(Hersom等，2004；McCurdy等，2010)中公开的值类似。由于CARS包含量造成的差异相对较小，并且很可能是由于营养物负荷造成。各处理之间肝、胰腺和胆囊重量的差异最明显。这些器官的功能是消化营养物和排泄过剩的营养物。随着CARS包含量增加，膳食中的一些矿物质(主要是Na)增加，并通过肝进行处理。

血液学

随着CARS包含量增加，血红蛋白和血细胞比容浓度均二次下降(P＝0.05)。对于两个指标，均观察到饲喂2.5％CARS的牛的浓度最低。随着CARS包含量增加，红细胞体积分布宽度(RDW)从20.9％线性增加至22.0％(P＝0.02)。随着膳食中CARS包含量增加，单核细胞浓度存在线性增加趋势(P＝0.09)，但所有处理落入预期的实验室参考范围内。对于单核细胞浓度，不存在性别差异(P＝0.80)以及处理×性别交互作用(P＝0.48)。

对于WBC、RBC、血红蛋白、血细胞比容、MCHC、RDW、血小板计数、MPV以及淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和纤维蛋白原浓度，性别是不显著的(P≥0.16)，并且不存在处理×性别交互作用(P≥0.42)。对于MCV，性别是显著的(P＝0.02)，其中小母牛具有40.8fl的平均体积，并且小公牛具有38.6fl的平均体积，但未观察到处理×性别交互作用(P＝0.38)。

对于中性粒细胞浓度，性别是显著的(P＝0.02)，其中小母牛具有较大的中性粒细胞浓度(3.57×10

在牛中测得的血液学变量的实验室参考区间在预期范围内(VeterinaryPathology，2011)。几乎所有变量在规定的预期范围内。RDW高于预期，所有处理的平均值为21.4％，预期范围估计为8.0％-15％。饲喂0％和2.5％CARS的牛的纤维蛋白原浓度略高于实验室参考范围，分别为516mg/dL和582mg/dL。实验室参考范围的最高上限为500mg/dL。饲喂2.5％CARS的牛的MCV值略小于预期，为38.9fl，预期范围的下限为40.0fl。饲喂7.5％CARS的牛的MPV大于预期，为8.27fl，预期范围的上限为8.0fl。所有处理的血浆蛋白浓度高于预期，平均8.22g/dL，且预期范围的上限为7.7g/dL。这些预期范围可能是使用不同的动物群建立的，其可能不代表精膳食饲养的正常饲育场动物。每天的牛观察结果和目视健康观察结果都表明牛是健康的，并且对任何膳食处理无不良反应。

血液化学

不存在由于性别造成的差异(P≥0.11)和处理×性别交互作用(P≥0.29)，并且未观察到各处理之间血Na、血K、血P、血Ca、BUN、血糖、总胆汁酸和AST浓度的差异(P≥0.10)。随着CARS包含量增加，ALT浓度存在线性下降趋势(P＝0.06)。

ALT浓度不存在处理×性别交互作用(P＝0.46)和由于性别造成的差异(P＝0.47)。存在随着膳食中CARS包含量增加血Cl浓度的线性下降(P≤0.01)以及由于性别造成的差异(P≤0.01)，其中小母牛具有101mEq/L的浓度，并且小公牛具有100mEq/L的浓度。Cl浓度不存在处理×性别交互作用(P＝0.45)，并且血Cl浓度在牛的预期范围内。随着膳食中CARS增加，存在血液碳酸氢盐浓度的线性增加(P<0.01)以及由于性别造成的差异(P＝0.03)，其中小母牛具有低于小公牛的浓度，分别为27.7mEq/和28.5mEq/L。血液碳酸氢盐浓度不存在处理×性别交互作用(P＝0.55)，并且测量值在牛的预期范围内。血Mg存在三次响应(P＝0.03)，其中饲喂5％CARS的牛具有最高的血Mg浓度(2.07mg/dL)。对于血Mg浓度，不存在由于性别造成的差异(P＝0.11)和处理×性别交互作用(P＝0.50)。Stokes等(2016)报道对于血浆Mg水平不存在由于膳食中包含藻粉造成的差异；他们报道的值与当前试验的平均值2.36mg/dL类似。

血白蛋白浓度存在三次响应趋势(P＝0.09)，其中饲喂5％CARS的牛具有最高浓度(3.27g/dL)；所有处理在牛的预期范围内。随着膳食中CARS包含量增加，血肌酐浓度从1.07mg/dL线性增加至1.16mg/dL(P<0.01)。总蛋白浓度存在处理×性别交互作用趋势(P＝0.09)；然而，各处理之间不存在差异(P≥0.10)，并且测量值在牛的预期范围内。对于血肌酸激酶浓度，性别是不显著的(P＝0.50)；然而，存在处理×性别交互作用趋势(P＝0.10)，并观察到二次降低(P＝0.02)，其中饲喂7.5％CARS的牛具有最高浓度(217IU/L)。

所有处理的肌酸激酶浓度在牛的预期范围内。

随着膳食中CARS包含量增加，碱性磷酸酶浓度从65.4IU/L线性降低至43.7IU/L(P<0.01)，但在牛的预期范围内。GGT存在由于性别造成的差异的趋势(P＝0.08)，并且观察到二次响应(P<0.01)，其中饲喂0％和7.5％CARS的牛分别具有46.8IU/L和45.1IU/L的最高浓度。总胆红素浓度具有三次响应(P<0.01)，其中饲喂5％的CARS的牛具有最高浓度(0.366mg/dL)。对于总胆红素，性别是显著的(P＝0.04)，其中小母牛具有0.351mg/dL的较高浓度，小公牛为0.323mg/dL。所有处理的浓度高于牛的预期浓度，上限为0.18mg/dL。小公牛和小母牛的总胆汁酸存在差异的趋势(P＝0.08)；小公牛具有38.8μmol/L的浓度，且小母牛具有29.4μmol/L的浓度，但各处理之间无差异(P≥0.10)。对于胆固醇存在处理×性别交互作用趋势(P＝0.09)，但不存在由于性别造成的差异(P＝0.70)。随着膳食中CARS包含量增加，胆固醇具有线性增加的趋势(P＝0.07)。LDH水平存在由于性别造成的差异(P＝0.02)；小母牛具有4390IU/L的LDH水平，且小公牛具有4120IU/L的水平。对于LDH，观察到存在三次响应(P＝0.04)，其中饲喂7.5％CARS的牛具有最高的LDH浓度(4494IU/L)，其高于预期范围的上限410IU/L。饲育场牛由于饲喂的高能量膳食而具有强的代谢活动。这可能导致更强的肝细胞肿胀和渗漏，这是LDH的主要来源。同样，较小的幼畜通常具有更高的LDH含量。

预期范围从混合的牛得出，其很可能是饲喂基于草料的膳食的奶牛，因为所有处理的牛具有高于预期范围的LDH浓度。

在牛中测得的血液化学变量的实验室参考区间在预期范围内。几乎所有变量都在规定的预期范围内。然而，这些预期范围可能是使用不同的动物群建立的，这些群可能不代表精膳食饲喂的正常饲育场动物。总胆红素高于预期，平均0.338mg/dL，而预期范围的上限为0.18mg/dL。血液中Ca和P的浓度也高于预期，平均10.3mg/dL和8.17mg/dL，而预期范围的上限为10.1mg/dL和7.9mg/dL。平均血Mg浓度为2.00mg/dL，低于2.10mg/dL的预期值。每日的牛观察结果和目视健康观察结果均表明牛是健康的，且未显示出任何处理的不利效果。

尿液分析

性别未影响尿液的pH(P＝0.45)或比重(P＝0.95)。尿液pH不具有处理×性别交互作用(P＝0.21)，但存在随着膳食中CARS增加的二次响应(P<0.01)，其中饲喂5％CARS的牛具有最高的pH值(8.70)。

各处理之间的比重不存在差异(P≥0.96)。

在尿液分析中测得的上皮细胞、无定形结晶、WBC、蛋白质或血液不存在各处理之间的差异和处理×性别交互作用(P≥0.17)。所有处理中测定的上皮细胞计数极少(1-10个细胞/视野)。对于所有处理，不存在无定形结晶、WBC、蛋白质和血液。三磷酸盐结晶具有数值差异，饲喂0％CARS的牛为无，且饲喂2.5％、5％或7.5％CARS的牛为极少(1-10个结晶/视野)，但处理之间无统计差异(P＝0.10)。

组织病理学

比较了两种处理(饲喂0％和7.5％CARS的牛)以进行所有组织病理分析。病理学家不知晓处理，并将饲喂0％和7.5％CARS的牛的组织切片评价为0＝正常或1＝异常。以下组织不存在由于处理造成的显著差异(P≥0.24)：脑(评价了5片切片)、脊髓(2片)、眼、脾、左上肺叶、右下肺叶、胰腺、最长肌(骨骼肌)、胸部(骨骼肌)、瘤胃(3片)、网胃、重瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠(3片)、盲肠、回肠、胸腺，结肠(2片)、右肾、左肾、膀胱、垂体、甲状腺、肾上腺、左肝、右肝、胆囊、心脏左侧、心脏右侧、肠系膜淋巴结(2片)、前列腺、卵巢(2片)、皮肤、蹄c带、蹄壁、蹄底和骨髓。假设在CARS的两个极限包含量之间(0和7.5％)无差异，则中间的处理也不受影响。0和7.5％CARS的组织学表明无论膳食中是否包含CARS，牛的组织健康不存在差异。

启示

饲粮CAR被证明是牛膳食中安全且有效的饲料成分。用CAR饲喂育肥牛随着膳食中包含量增加至膳食DM的7.5％而改善了G：F。HCW、ADG和DMI均二次增加，并且在用2.5％或5％CARS饲喂牛时被最大化。在血液学、血液生物化学或组织病理学中无饲喂CARS的不利效果。当饲喂CARS后，观察到肝、甲状腺、胆囊、胰腺、空肠和心脏的器官重量增加，但未观察到对健康的影响且未发现组织差异。需要进行进一步的研究以根据在整个饲喂周期饲喂时的性能和屠宰性状确定CARS的最优包含量，以及将CARS用于生长牛膳食的可能性。

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表1含有包含量增加的浓缩可溶藻渣(CARS)并分别饲喂给小公牛和小母牛的膳食的组成

表2浓缩的藻类残渣可溶物(CARS)的营养成分

表3含有包含量增加的浓缩的藻类残渣可溶物(CARS)膳食的干物质组成(总体±SD)

表4分别饲喂含有包含量增加的浓缩的藻类残渣可溶物(CARS)的小公牛和小母牛的性能