液体脂肪酶的固定化方法及蔗糖-6-乙酸酯的制备方法

摘要

本申请提供一种液体脂肪酶的固定化方法，包括依次进行以下步骤：溶解步骤：将海藻酸盐加入去离子水中完全溶解，并在预设温度下，加入液体脂肪酶，得到混合溶液；固定步骤：将混合溶液与金属交联剂溶液混合，并保持预设时间，得到球状凝胶，以使液体脂肪酶固定；以及，螯合步骤：将球状凝胶洗涤后，加入缓冲液和有机络合剂溶液进行螯合反应后，采用缓冲液洗涤，即得到固定化的液体脂肪酶。本申请得到的凝胶物理强度极高，能在反应体系中更加稳定的存在，基本不会破碎分解；能够重复使用多次，更适合利用工业大规模连续性酯化生产蔗糖‑6‑乙酸酯；制作方法简单、成本低。

说明书

技术领域

本发明属于精细化工技术领域，具体涉及液体脂肪酶的固定化方法及蔗糖-6-乙酸酯的制备方法。

背景技术

三氯蔗糖是新鲜甜味剂，三氯蔗糖是由英国泰莱公司与伦敦大学共同研制，并于1976年申请专利的一种新型甜味剂,它是唯一一个以蔗糖为原料的功能性甜味剂。三氯蔗糖对酸味和咸味有淡化效果，对涩味、苦味、酒味等不快的味道有掩盖效果，对辣味、奶味有增效作用，应用范围十分广泛。因此，该产品是当今最理想的强力甜味剂，可供儿童、少年、青年、中年、老年和各种疾病患者食用，没有任何营养学疑问。

而蔗糖-6-乙酸酯是合成三氯蔗糖的重要中间体，合成蔗糖-6-乙酸酯的方法主要是传统的化学法，如乙酸酐酯化法、有机金属合成法、原酸酯法等，蔗糖酯的化学合成反应条件一般比较苛刻，合成的产品颜色比较深，而且由于其选择性差，容易产生副产物。

现有技术中，也有关于酶法合成蔗糖-6-乙酯的报道，如中国专利CN102618601A等，但目前市面上能够买到的制备蔗糖-6-乙酯固体化的液体酶催化剂重复使用率很差，大约重复使用三次后，固体化的液体酶催化剂大部分都已破碎，造成液体酶基本失活，液体酶的损失严重，蔗糖-6-乙酯的合成成本高。

发明内容

鉴于上述问题，提出了本申请以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种液体脂肪酶的固定化方法及蔗糖-6-乙酸酯的制备方法。

根据本申请的一方面，提供一种液体脂肪酶的固定化方法，依次进行以下步骤：

溶解步骤：将海藻酸盐加入去离子水中完全溶解，并在预设温度下，加入液体脂肪酶，得到混合溶液；

固定步骤：将混合溶液与金属交联剂溶液混合，并保持预设时间，得到球状凝胶，以使液体脂肪酶固定；以及，

螯合步骤：将球状凝胶洗涤后，加入缓冲液和有机络合剂溶液进行螯合反应后，采用缓冲液洗涤，即得到固定化的液体脂肪酶。

根据本申请的另一方面，提供了一种蔗糖-6-乙酸酯的制备方法，包括：将蔗糖与脂肪酸乙烯酯在混合有机溶液中，在上述的方法制得的固定化的液体脂肪酶催化作用下进行脱水酯化反应，获得蔗糖-6-乙酸酯溶液的步骤。

综上所述，本申请的有益效果在于：

1.本申请利用海藻酸盐作为载体通过与金属交联剂和有机络合剂进行二次交联，以固定液体脂肪酶，得到的凝胶物理强度极高，能在反应体系中更加稳定的存在，基本不会破碎分解；

2.由于凝胶强度高，固化酶能够重复使用多次，远高于现有报道的固化酶重复利用率，更利用工业大规模连续性酯化生产蔗糖-6-乙酯；

3.本发明制作方法简单、所需原材料来源广泛的材料，大幅度的降低了液体脂肪酶固定化的成本，进一步地，降低了蔗糖-6-乙酯的制备成本。

上述说明仅是本申请技术方案的概述，为了能够更清楚了解本申请的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本申请的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本申请的具体实施方式。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本申请的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1示出了根据本申请一个实施例的液体脂肪酶的固定化方法的流程示意图；

图2示出了根据本申请一个实施例的海藻酸钠与乳酸钙形成的凝胶的结构示意图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本申请的示例性实施例。虽然附图中显示了本申请的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本申请的构思在于，针对现有技术中，固定化的液体脂肪酶(下称固化酶)强度低，重复使用性差的现状，提供了一种采用海藻酸盐为载体，与金属交联剂和有机络合剂进行二次交联，制备含有液体脂肪酶的凝胶，该凝胶强度极高，重复使用率极高。

在本申请中，采用的原料和仪器均为市售产品。

图1示出了根据本申请一个实施例的液体脂肪酶的固定化方法，包括依次进行以下步骤：

溶解步骤S110：将海藻酸盐加入去离子水中完全溶解，并在预设温度下，加入液体脂肪酶，得到混合溶液。

本申请以海藻酸盐为载体，在本申请中，作为载体的海藻酸盐是可溶性的盐，如海藻酸钠，不包括像海藻酸钙等不溶性的盐。

下述以海藻酸钠为例，海藻酸钠(C

式(1)

将海藻酸盐完全溶解于去离子水中，为了加速海藻酸盐的溶解可采用高速的搅拌装置进行搅拌以及加热手段以促进溶解。待海藻酸盐完全溶解后，在预设温度下，将液体脂肪酶溶解于得到的海藻酸盐溶液中，液体脂肪酶在一定温度下才能保持活性，如果温度过高或过低，可能造成脂肪酶的失活，因此预设温度可以根据选择的液体脂肪酶的种类进行确定，预设温度为不是液体脂肪酶失活的温度。

固定步骤S120：将混合溶液与金属交联剂溶液混合，并保持预设时间，得到球状凝胶，以使液体脂肪酶固定。

金属交联剂为可溶性金属盐，可只配制成溶液使用，在本申请中，优选使用含有二价或三价金属离子的化合物作为金属交联剂，以乳酸钙和海藻酸钠为例，将海藻酸钠溶液加入到乳酸钙溶液中后，海藻酸钠会与乳酸钙中的钙离子发生离子交换形成海藻酸钙，而海藻酸钙中的钙离子与不同聚合物链上的羧酸根形成离子键，将不同的聚合物链连接在一起，也就是会发生交联反应，类似于在直链上加入更多的支链，使不同的聚合物链形成网状结构，其结构如图2所示，使溶液的黏稠度进一步增加，并且海藻酸钙的溶解度相对于海藻酸钠更低，形成凝胶。在海藻酸钠溶液中加入适量的钙离子，可影响凝胶的软硬程度，通常加入的钙离子越多，胶体越坚固。为了得到球状凝胶，可采用挤出机器，或者采用带有针头的注射剂将凝胶挤出。

以及，螯合步骤S130：将球状凝胶洗涤后，加入缓冲液和有机络合剂溶液进行螯合反应后，采用缓冲液洗涤，即得到固定化的液体脂肪酶。

将上述得到的球状凝胶进行洗涤以洗涤掉未反应的金属交联剂，洗涤可采用去离子水或生理盐水等缓冲液，为加快洗涤过程和促进洗涤程度，可采用减压抽滤的方式。

将球状凝胶洗涤后，再加入缓冲液和有机络合剂，与得到的球状凝胶进行二次交联，即进行螯合反应。在这里缓冲液的作用是为了球状凝胶与有机络合剂提供反应环境，因此对于缓冲液的用量不做限制，淹没球状凝胶即可。

在固定步骤中，海藻酸盐的可供交联的交联基团，即羧基，并未全部与金属交联剂进行交联，余下的未交联的羧基可与有机络合剂进行二次交联。通过两次交联过程，海藻酸盐的交联度被进一步的加深，形成的凝胶强度极强，不易破损。

综上所述，本申请利用海藻酸盐作为载体通过与金属交联剂和有机络合剂进行二次交联，以固定液体脂肪酶，得到的凝胶物理强度极高，能在反应体系中更加稳定的存在，基本不会破碎分解；且能够重复使用多次，远高于现有报道的固体酶重复利用率，更利用工业大规模连续性酯化生产蔗糖-6-乙酸酯；本发明制作方法简单、所需原材料来源广泛的材料，大幅度的降低了液体脂肪酶固定化的成本，进一步地，降低了蔗糖-6-乙酸酯的制备成本。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，对液体脂肪酶的种类不做限制，脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以用来催化水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应等，如在有机相中可以酶促合成和酯交换。在本申请的另一些实施例中，液体脂肪酶可为Lipozyme TL IM、Lipozyme TL100L、Lipozyme RM IM中的任意一种。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，对海藻酸盐的种类不做限制，在另一些实施例中，海藻酸盐选自海藻酸钠。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，对海藻酸盐、去离子水、液体脂肪酶的用量不做限制，其中，去离子水的最少用量以能够完全溶解海藻酸盐为准；在另一些实施例中，海藻酸盐与去离子水和液体脂肪酶的总质量用量比为1:5～1:20；其中，去离子水与液体脂肪酶的质量用量比为0.1～10:1，在一些实施例中，去离子水与液体脂肪酶的质量用量比为3:1。若海藻酸盐的质量用量少于去离子水和液体脂肪酶的总质量用量的二十分之一，则用量过低，造成形成的凝胶不能够完全包埋液体脂肪酶；若海藻酸盐的质量用量多于去离子水和液体脂肪酶的总质量用量的五分之一，则用量过多，则形成的凝胶内，聚合物过多，液体脂肪酶过少，不利用后续的利用。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，对溶解步骤中预设温度不做限制，可以根据选择的液体脂肪酶的种类来确定，以使液体脂肪酶不失活为准。在另一些实施例中，预设温度可以为10～37℃，在又一些实施例中，预设温度可以为28℃。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，对金属交联剂的种类不做限制，可使海藻酸盐形成不可逆凝胶的金属可溶性金属化合物均可；在另一些实施例中，金属交联剂为钙的无机盐、锌的无机盐、铜的无机盐、镁的无机盐、铝的无机盐、铁的无机盐，锌离子、铜离子、镁离子、铝离子以及铁离子做的作用机理与钙离子一样，在此不作赘述；在另一些实施例中，金属交联剂为钙的无机盐，在又一些实施例中，金属交联剂为氯化钙或乳酸钙。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，对金属交联剂的用量和浓度不做限制，在另一些实施例中，金属交联剂的质量用量与海藻酸盐的质量用量比为1：1～1:20，在又一些实施例中，金属交联剂的质量用量与海藻酸盐的质量用量比为1:5，金属交联剂溶液的浓度为1wt％～5wt％。若金属交联剂的质量用量小于海藻酸盐质量用量的二十分之一，则用量过少，形成的凝胶强度过低，甚至不能有效形成凝胶；若金属交联剂的质量用量大于海藻酸盐质量用量的一倍，则用量过多，则交联程度过深，不利于二次交联的进行。若金属交联剂溶液的浓度小于1wt％，在金属交联剂溶液与海藻酸钠溶液混合后，形成的混合溶液体积过大，导致金属离子不易与海藻酸钠形成凝胶；若金属交联剂溶液的浓度大于5wt％，则金属离子的浓度过大，会造成海藻酸钠局部交联过度，形成的凝胶强度不均匀。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，对固定步骤中的预设时间不做限制，在另一些实施例中，该预设时间为0.5h～3h。如果该预设时间小于0.5h，则海藻酸钠与金属交联剂的交联时间过短，不能达到充分交联的目的；如果该预设时间大于3h，则海藻酸钠与金属交联剂的交联时间过长，在海藻酸钠与金属交联剂的用量都确定的情况下，在3h内已经能够交联完全，再延长时间也不能够加深交联程度，并且带不来其他有益效果。固定步骤中的固定温度为室温即可，无需特殊加热或冷却。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，缓冲液在本申请的中的作用是为固定化提供反应环境，本申请对缓冲液的种类不做限制，在另一些实施例中，缓冲液为生理盐水、磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、三羟甲基氨基甲烷中的任意一种，优选生理盐水。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，对有机络合剂的种类不做限制，可以与羧基形成化学键的物质即可，在另一些实施例中为甲醛、C2～C8直链或支链二醛中的任意一种，优选戊二醛。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，海藻酸盐与有机络合剂的质量用量比为1：1～1:20；在另一些实施例中，海藻酸盐与有机络合剂的质量用量比为1:3～1:5；有机络合剂溶液的质量溶度为0.1wt％～2wt％。若有机络合剂的质量用量小于海藻酸盐质量用量的二十分之一，则用量过少，导致形成的凝胶强度过低；若有机络合剂的质量用量大于海藻酸盐质量用量的一倍，则用量过多，会造成后续洗涤工序工作量大。若有机络合剂溶液的浓度小于0.1wt％，在有机络合剂溶液与海藻酸钠溶液混合后，形成的混合溶液体积大，导致有机络合剂不易与海藻酸钠形成凝胶；若有机络合剂溶液的浓度大于2wt％，则有机络合剂的浓度过大，会造成海藻酸钠局部交联过度，形成的凝胶强度不均匀等问题。

在本申请的一些实施例中，在上述的液体脂肪酶的固定化方法中，对螯合步骤中，对螯合反应的温度和时间不做限制，在另一些实施例中，螯合反应在温度为1℃～10℃，优选2℃～4℃；时间为8h～24h条件下进行。若温度低于1℃，则温度过低，螯合反应难以进行；若温度高于10℃，则温度过高，则造成螯合反应过快且交联程度过深。

在本申请的又一些实施例中，还提供了一种蔗糖-6-乙酸酯的制备方法，该方法包括：将蔗糖与脂肪酸乙烯酯在混合有机溶液中，在上述任一的方法制得的固定化的液体脂肪酶作为催化剂的作用下进行脱水酯化反应，以获得蔗糖-6-乙酸酯溶液的步骤。采用本申请的制得的固化酶来催化蔗糖和脂肪酸乙烯酯在混合有机溶剂中进行脱水酯化反应制备蔗糖-6-乙酸酯，该固化酶凝胶强度极高，能够多次回收重复使用；且蔗糖-6-乙酸酯的产率高，在首次使用固化酶催化酯化反应生成蔗糖-6-乙酸酯，其产率能够达到70％以上，在一些实施例中达到74.2～78.5％。

在本申请的一些实施例中，上述的蔗糖-6-乙酸酯的制备方法还包括：将固定化的液体脂肪酶回收并将其用于蔗糖与脂肪酸乙烯酯的脱水酯化反应，在反复使用7次后，产率仍然能够达到42.4～45.8％。

由于固化酶的凝胶强度极高，在一次反应中基本不会发生破碎，因此能够反复回收并利用，至少能够反复使用7次以上，由于固化酶的凝胶不会破碎，因此液体脂肪酶仍然能够保持很高的酶活性。

在本申请的一些实施例中，在上述的蔗糖-6-乙酸酯的制备方法中，对脂肪酸乙烯酯的种类不做限制，在另一些实施例中为脂肪酸乙烯酯为乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯中的任一种。

在本申请的一些实施例中，在上述的蔗糖-6-乙酸酯的制备方法中，对混合有机溶剂的种类不做限制，在另一些实施例中，混合有机溶剂是由DMF与叔丁醇和/或叔戊醇按照体积比为1:1～10组成。

测试手段或条件

由高效液相色谱检测出的数据计算得出，具体是，由蔗糖的反应结束浓度比蔗糖的初始浓度。

实施例1：固化酶1的制备

(1)取500kg海藻酸钠加4.4m3离子水，60℃蒸汽加热，开启搅拌至完全溶解。

(2)降至室温后(30℃以下)，加入600kg脂肪酶液，搅拌均匀静置直到气泡完全消失。

(3)配制0.9wt％生理盐水5m

(4)匀速泵入(2)中混合溶液，至CaCl

(5)固定结束后，用0.9wt％生理盐水洗涤球状凝胶两次，再加入淹没过球状凝胶液位的生理盐水和0.5wt％戊二醛20L，通入冷气控制温度在2～4℃环境下交联5h。

(6)交联结束后，采用生理盐水洗涤，得到固化酶，并保存备用。

实施例2：采用固化酶1制备蔗糖-6-乙酯

a.配制混合有机溶液，DMF：叔戊醇体积比为1:4，总体积为6m

b.投入蔗糖123kg(0.06mol/L)于反应釜中，开启搅拌完全溶解后，泵入乙酸乙烯酯310kg(0.6mol/L)于6m

c.随后投入480kg实施例1中制备得到的固化酶1于反应釜中，在30℃保温反应，200rpm的搅拌速度反应9h。

d.反应结束后，经压滤机过滤过滤出反应体系中的没有破损的固化酶1，肉眼观察到，绝大部分球状凝胶没有破损，使用生理盐水初次清洗后，于生理盐水中室温浸泡放置。

e.取反应后的母液，采用0.22um滤膜过滤至液相小瓶，并采用高效液相色谱HPLC定量分析蔗糖的转化率，结果列于表1。

f.使用步骤d.中回收的固化酶1(在每次反应过程中会有一定的损失，每次将回收后的固化酶1反复使用，不再额外添加)作为催化剂重复步骤a～d7次，并在每次回收后称取固化酶1的质量，并采用高效液相色谱测定蔗糖的转化率，结果列于表1。

表1采用固化酶1制备蔗糖-6-乙酯的结果

实施例3：固化酶2的制备

(1)取400kg海藻酸钠加3.8m

(2)降至室温后(30℃以下)，加入500kg脂肪酶液，搅拌均匀静置直到气泡完全消失。

(3)配制0.9wt％生理盐水6m

(4)匀速泵入(2)中混合溶液，至CaCl

(5)固定结束后，用0.9wt％生理盐水洗涤球状凝胶两次，再加入淹没过球状凝胶液位的生理盐水和0.5wt％戊二醛50L，通入冷气控制温度在2～4℃环境下交联8h。

(6)交联结束后，采用生理盐水洗涤，得到固化酶2，并保存备用。

实施例4：采用固化酶2制备蔗糖-6-乙酯

a.配制混合有机溶液，DMF：叔戊醇体积比为1:4，总体积为6m

b.投入蔗糖123kg(0.06mol/L)于反应釜中，开启搅拌完全溶解后，泵入乙酸乙烯酯310kg(0.6mol/L)于6m

c.随后投入450kg实施例2中制备得到的固化酶2于反应釜中，在30℃保温反应，200rpm的搅拌速度反应10h。

d.反应结束后，经压滤机过滤过滤出反应体系中的没有破损的固化酶2，使用生理盐水初次清洗后，于生理盐水中室温浸泡放置。

e.取反应后的母液，采用0.22um滤膜过滤至液相小瓶，并采用HPLC定量分析蔗糖的转化率，结果列于表2。

f.使用步骤d.中回收的固化酶2(在每次反应过程中会有一定的损失，每次将回收后的固化酶2反复使用，不再额外添加)作为催化剂重复步骤a～d7次，并在每次回收后称取固化酶2的质量，并采用高效液相色谱测定蔗糖的转化率，结果列于表2。

表2采用固化酶2制备蔗糖-6-乙酯的结果

通过表1和表2可以看出，本申请提供的固化酶能够反复使用至少7次，每一次固化酶的损失均很小；且蔗糖的转化率很高，在首次反应时，可达74％以上，在第7次反应时，蔗糖的转化率仍然可以达到40％以上。

综上所述，本申请的有益效果在于：

1.本申请利用海藻酸盐作为载体通过与金属交联剂和有机络合剂进行二次交联，以固定液体脂肪酶，得到的凝胶物理强度极高，能在反应体系中更加稳定的存在，基本不会破碎分解；

2.由于凝胶强度高，固化酶能够重复使用多次，远高于现有报道的固化酶重复利用率，更利用工业大规模连续性酯化生产蔗糖-6-乙酯；

3.本发明制作方法简单、所需原材料来源广泛的材料，大幅度的降低了液体脂肪酶固定化的成本，进一步地，降低了蔗糖-6-乙酯的制备成本。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。