基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的检测方法及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的检测试剂盒，包括适用于大西洋鲑快速核酸检测的CRISPR的荧光检测体系，所述CRISPR的荧光检测体系包括：针对大西洋鲑线粒体靶序列的特异性crRNA、高效等温扩增引物组合、CRISPR蛋白和ssDNA报告系统。本发明还公开一种基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的快速检测方法，其是采用所述的基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的检测试剂盒进行检测。本发明的检测试剂盒，既可利用酶标仪荧光检测，也可以利用荧光肉眼检测，具有良好的灵敏性和特异性。

说明书

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体地说，是关于一种基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

我国三文鱼养殖能力不足，而真正高品质的三文鱼数量有限、价钱高、需求大，大量依靠进口，因此才会出现众多商家和企业盯准三文鱼这块“肥肉”，和消费者玩起“偷换概念”的游戏。真正意义上的三文鱼（特指大西洋鲑，Salmon salar）是一种冷水鱼类，适宜生活在16至18摄氏度的水中，对水质的要求非常高，在养殖中稍有不慎就会导致死亡。由于成本原因，售价一直居高不下。大西洋鲑主要的物理替代物种为虹鳟（Oncorhynchusmykiss），鲑科大马哈鱼属（太平洋鲑属）的一种鱼类，英文名为rainbown trout。原产于北美洲北部和太平洋西岸，多数种群终身生活于低温淡水环境中。繁殖期的雄鱼上下颌变得弯曲，体侧从腮部至尾部的彩虹般桃红色纵带也越发艳丽，虹鳟的名字也由此而来。切片生食的虹鳟和大西洋鲑鱼物理性质十分相似，普通老百姓但从外表很难区分。

目前，中国三文鱼消费已进入快车道，到2018年我国三文鱼市场需求规模将接近90亿元，市场需求空前巨大，而我国目前现行标准均没有针对大西洋鲑鱼和虹鳟的物种鉴定方法或试剂盒进行区分，这就导致了严重的技术断层。这一技术断层使得相关食品安全，市场监督监管部门在面对大西洋鲑或虹鳟相关产品物种鉴定需求时拿不出现行有效的检测技术依据。在面对突然的舆情、巨大的市场需求、价格差异，相关检测技术缺失必将产生严重的食品安全监管漏洞。如何利用技术手段对相关动物源性制品进行生物监测将是业界面临的一个重大挑战。因此迫切需要建立精确、快速、高灵敏的大西洋鲑鱼特异性检测技术体系对大西洋鲑鱼及其产品进行物种鉴定。

目前，对于鱼类物种的鉴定技术主要依赖于传统形态学鉴定技术、蛋白质电泳法、实时荧光定量检测技术和基于扩增子测序和DNA条形码检测技术。形态学鉴定技术依赖于专业人士的长期研究积累，可以快速对物种进行区分，但是其鉴定严重依赖于完整的特征性形态，而对于相关制品，特别是加工过的样本，例如罐头类、肉类、血液等不具备形态学特征的样本则无法完成鉴定。蛋白质相关分析方法对于经过加热的导致蛋白变性的样本也无法完成检测鉴定。而基于DNA的分子生物学方法则体现出了明显的检测优势。但荧光定量PCR技术和基于扩增子测序和DNA条形码检测技术均严重依赖高级别分子生物学实验室和较为大型的仪器设备，且检测成本较高，检测周期也比较长，无法满足现场快速检测的实际场景需求。

CRISPR-Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs）是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-CRISPR属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。CRISPR酶识别富含胸腺嘧啶（Thymine, T）核苷酸的间隔区相邻基序（PAM），催化它们自身的指导CRISPR RNA（crRNA）成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当CRISPR-CRISPR蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA（ssDNA）反式切割活性。

发明内容

本发明的目的在于针对大西洋鲑物种特异性现场快速检测鉴定的难题，提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的用于大西洋鲑特异性快速核酸检测的CRISPR荧光可视试剂盒及其检测方法。为此，本发明基于CRISPR的特性，开发了一种快速准确的检测方法，用于对大西洋鲑特异性靶序列进行检测。首先，对样品进行核酸释放和富集，并在等温条件下同时进行重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR-crRNA复合物结合并切割靶标dsDNA，其激活ssDNA的反式切割，与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。这种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因的新方法，为快速准确检测大西洋鲑特异性核酸提供了强有力的平台。因此，本发明的第一个目的在于提供一种基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的检测试剂盒。本发明的第二个目的在于提供一种基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的检测试剂盒，包括适用于大西洋鲑快速核酸检测的CRISPR的荧光检测体系，所述CRISPR的荧光检测体系包括：针对大西洋鲑线粒体基因上靶序列的特异性crRNA、高效等温扩增引物组合、CRISPR蛋白和单链DNA (ssDNA)报告系统。

根据本发明，所述特异性crRNA为从12条针对大西洋鲑线粒体基因设计的crRNA中筛选所得，为S158-cr1的序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明，所述高效等温扩增引物组合为经筛选后选择的针对序列如SEQ IDNO：1所示的大西洋鲑线粒体基因9439-9840位置的扩增引物S158-RPA-F2与S158-RPA-R3，扩增引物S158-RPA-F2与S158-RPA-R3的序列分别如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17所示。

根据本发明，所述ssDNA报告系统包含可用酶标仪荧光检测或荧光灯下肉眼直接判读的ssDNA FQ reporter，序列如SEQ ID NO：18所示。

作为本发明的第二个方面，一种基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的快速检测方法，其是采用上述所述的基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的检测试剂盒进行检测。

根据本发明，所述基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的快速检测方法，包括以下步骤：

步骤a：取样器取10mm直径左右待测肉样品，剪碎到样品管；

步骤b：利用快速核酸释放剂释放白细胞中的核酸；

步骤c：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤b获得的产物，和序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17所示的高效等温扩增引物组合加入到RPA等温扩增体系中，37 ℃下反应10 min，获得特异性产物；

步骤d：利用CRISPR检测体系识别切割大西洋鲑鱼特异性核酸片段时：将步骤c的特异性产物加入CRISPR检测体系，于37 ℃反应10min；

步骤e：利用荧光酶标仪或荧光灯肉眼直接检测判读待检测样品中是否存在大西洋鲑特异性核酸。

作为本发明的第三个方面，一种针对大西洋鲑线粒体基因上靶序列的特异性crRNA，其序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的检测试剂盒，其有益效果是：既可利用酶标仪荧光检测，也可以利用荧光肉眼检测，具有良好的灵敏性和特异性。

本发明的基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的快速检测方法，其有益效果是：

1、首次采用CRISPR荧光法特异性检测大西洋鲑，具有灵敏度较高、特异性强、用时短、操作难度低、不依赖大型实验仪器和昂贵试剂等优势，其检测结果可在荧光灯下进行肉眼直接判读。

2、公开了一套用于大西洋鲑特异性核酸检测的CRISPR反应体系和特异性crRNA，方便用于现场动物源性成分快速检测鉴定。

附图说明

图1为本发明的基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的快速检测方法的示意图。

图2不同crRNA检测特异性与有效性检测效果；

图3 筛选PRA高效扩增引物；

图4 CRISPR荧光检测大西洋鲑灵敏度测试；

图5 荧光检测CRISPR快速检测大西洋鲑特异性与其他物种特异性；

图6 肉眼直接检测CRISPR快速检测大西洋鲑特异性；

图7 检测现场采样的大西洋鲑核酸样品荧光检测结果；

图8 检测现场采样的大西洋鲑核酸样品肉眼直接检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

本发明中：RPA扩增试剂盒TwistAmp® Basic kit购自TwistAmp公司；常规试剂如Tris-Base, NaCl, Tris-HCl，MgCl

本发明的可用酶标仪荧光检测或荧光灯下肉眼直接判读的ssDNA FQ reporter，即被6-羧基荧光素（6-FAM）和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/5’6FAM/TTTATTT/3’BHQ1/（SEQ ID NO：18），命名为ssDNA FQ reporter。当使用酶标仪荧光检测时，设定检测激发光为485 nm-520 nm； 当使用肉眼直接检测时，选用可产生485nm波长光源的发光器进行检测。

在使用荧光检测时，当CRISPR检测体系中存在大西洋鲑特异性核酸，会由在大西洋鲑特异性crRNA介导下特异性激活CRISPR蛋白的核酸内切酶活性。激活后的CRISPR蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter, 从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数或肉眼可见绿色反应。相对应的，待检测样品中不存在大西洋鲑核酸时，不会有荧光读数或肉眼不可见荧光反应。

本发明基因生物信息学分析，将大西洋鲑线粒体基因序列与NCBI数据库中鲑科物种序列，设计针对大西洋鲑鱼的特异性检测crRNA。为保证检测特异性，对设计的crRNA序列与NCBI核酸数据库中包括哺乳动物、淡水海水鱼类、禽类、植物和微生物等物种的线粒体基因，确定没有较高同源性匹配。根据CRISPR识别特定PAM序列特点，在线粒体基因靶序列上设计9条特异性crRNA。通过检测筛选到S158-cr1,其序列为SEQ ID NO：2，能特异性识别大西洋鲑鱼线粒体基因，能准确高效完成检测。

本发明的总体技术示意图如附图1所示，包括以下3大部分：待检测核酸样品制备、CRISPR检测和荧光检测。

实施例1 筛选针对大西洋鲑的特异性crRNA

1.1 核酸制备

本案例中大西洋鲑特异性的线粒体特异性靶点基因片段，是参考NCBI序列大西洋鲑鱼线粒体DNA（Salmo salar mitochondrial DNA, GenBank: LC012541.1）设计，由南京金斯瑞公司合成，命名为S158, SEQ ID NO：1。

ccacatggttgacccaagcccctgacccctaactggcgcaattgctgcccttctacttacatcaggcactgcagtctgatttcacttccactcacttacgctactaaccataggaaatattttattacttctcaccatatatcaatgatgacgagacattatccgagaaggcaccttccaagggcaccacacacctccagtccaaaaaggactacgctatggaataatct，（SEQ ID NO：1）。

1.2 针对大西洋鲑线粒体基因特异性crRNA的设计制备

针对大西洋鲑线粒体特异性crRNA制备按照如下方案进行：针对序列如SEQ IDNO：1所示的大西洋鲑特异性线粒体基因，寻找包含CRISPR识别序列（PAM）TTTN的靶向序列，设计23 bp长度的crRNA。命名为S158-cr1、S158-cr2、S158-cr3、S158-cr4、S158-cr5、S158-cr6、S158-cr7、S158-cr8，序列分别为SEQ ID NO：2 —SEQ ID NO：9。设计完成后，交由南京金斯瑞公司直接合成crRNA序列对应的RNA。

本发明提供的大西洋鲑线粒体特异性基因的crRNA具体序列信息如表1所示。

表1 大西洋鲑特异性核酸特异性crRNA

1.3 筛选特异性crRNA

利用PCR引物（SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，见表2）通过对大西洋鲑和虹鳟核酸样品进行PCR扩增，获得对应的核酸产物大西洋鲑S158和虹鳟O158片段，将经AxyPrep PCRClean-up Kit (Axygen, CA, USA)纯化的PCR产物用ddH

表2 PCR引物序列

1.4 本案例中，大西洋鲑CRISPR检测采用20 μL体系如表3所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整。

表3 大西洋鲑CRISPR检测体系

对于每一个crRNA，均设计检测样品分别为S158、O158和ddH

1.5 全波长酶标仪荧光检测

将反应后的产物用全波长酶标仪进行荧光检测。其中激发波长为485 nm，发射波长为520 nm，读取检测37°C下反应10 min时的荧光值。其反应检测结果如图2所示。

结果表明S158-cr1检测的特异性和灵敏度均较好，因此选择S158-cr1作为检测crRNA。

实施例2 筛选高效等温扩增的RPA引物

2.1 RPA引物设计与合成

本发明利用等温扩增技术对大西洋鲑检测靶点区域进行预扩增，用于后续的CRISPR荧光法检测反应。根据等温扩增引物设计的要求，设计出3条上游引物与3条下游引物，序列为SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：17（见表4），交由南京金斯瑞公司直接合成。将上游引物与下游引物两两搭配，筛选出最高效的引物组合。

2.2 RPA等温扩增反应

（1）大西洋鲑模拟质粒的构建：将载体PUC57以及序列如SEQ ID NO：1所示的大西洋鲑特异性线粒体基因进行生工全基因合成获得。

（2）以大西洋鲑模拟质粒为模板筛选RPA扩增引物。根据质粒大小和分子量计算拷贝数，以10倍梯度对质粒样品进行稀释，获得每微升含有1*e4拷贝的样品。具体操作步骤为：将2.5 µL S158-RPA-F，2.5 µL S158-RPA-R，1 µL模拟质粒样品和42µL 反应缓冲液在反应管中混匀，最后加入2µL 激活剂混匀，于37°C下反应10 min，获得RPA扩增反应产物。反应产物可直接用于下一步检测。

表4 针对大西洋鲑核酸特异性RPA引物序列

2.3 CRISPR荧光检测反应

本发明采用20µL检测体系，成分如表3，其中样品为实施例2的2.2的反应产物，取5µL检测。全波长酶标仪荧光检测结果如图3所示。

结果表明S158- RPA-F2与S158- RPA-R3引物组合的扩增效率最好，因此选择S158-RPA-F2与S158-RPA-R3作为后面样品扩增所用引物。

实施例3 基于CRISPR荧光法高灵敏度检测大西洋鲑特异性核酸

本案例中，为测定CRISPR荧光法对大西洋鲑特异性核酸的检测灵敏度，进行以下检测。

首先，根据大西洋鲑的线粒体基因片段对应DNA样品，计算检测片段分子量，并进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2*e7、2*e6、2*e5、2*e4、2*e3、2*e2、2*e1和2*e0拷贝数（copy/μL）的测试样品。使用数字PRC进行定量检测。

利用荧光法，对上述稀释样品进行CRISPR特异性反应，参照实施例1中检测步骤进行检测和荧光结果判读。操作简述如下：2 μL 梯度稀释样品，加入到50 μL RPA等温扩增反应体系进行扩增。取10 μL等温扩增产物，加入到20 μL CRISPR荧光核酸检测体系，混合均匀，37℃反应10 min进行荧光结果判读。

本案例中，应用CRISPR荧光法检测大西洋鲑特异性，通过酶标仪检测（图4），可实现对2拷贝的高灵敏度检出。

实施例4 基于CRISPR荧光法高特异性检测大西洋鲑核酸

本实施案例中，为检测CRISPR荧光法能否对大西洋鲑进行高特异反应，能否有效区分哺乳动物、禽类、淡水鱼类、海水鱼类和多种鲑科鱼类的线粒体核酸，进行以下检测。

首先，使用测序技术对多种淡水海水和鲑科鱼类的代表物种遗传信息进行采集和分析，并在这些数据的基础上建立核酸样本库。

其次，参照实施案例1，通过RPA反应，分别扩增制备大西洋鲑和其它物种样本。

在荧光检测中，在CRISPR检测体系中，依次加入2 μL Buffer、1 μL RnaseInhibitors（核糖核酸酶抑制剂）、1 μL CRISPR、 1 μL ssDNA FQ reporter、1 μL crRNA和10 μL 检测样品。各组分混合均匀，在37℃反应10 min。本检测体系中，Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，CRISPR浓度为200ng/μL，ssDNA DB reporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1nM/μL。

本实施案例中，利用荧光检测判定CRISPR检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，其中激发波长为485 nm，发射波长为520 nm，取检测10 min时荧光数值为反应值。检测结果如图5。本发明中CRISPR荧光法可高特异性检测大西洋鲑核酸，而对其他物种核酸没有反应。

荧光显示肉眼直接判读。同时，将上述CRISPR检测反应10 min后产物，置于在485nm激光灯下，可由肉眼直接进行结果判读。当crRNA特异性识别靶核酸片段后，反应产物颜色由无色变为荧光绿；对应的，如果待检测无对应靶核酸，反应产物颜色仍未无色。在CRISPR检测反应10 min后，在荧光下进行肉眼判读，并拍照记录。如图3所示，该检测体系能高效特异的对大西洋鲑检测靶点序列进行快速可视化检测。

本实施案例中，在CRISPR检测体系反应5 min后，同样可以在485 nm激光灯下，用肉眼对检测产物荧光反应进行判读。检测结果如图6，本发明中CRISPR荧光法可高特异性检测大西洋鲑核酸，而对其它物种没有反应。

实施例5 CRISPR荧光法现场快速检测大西洋鲑样本

本实施案例涉及现场大西洋鲑组织样品的快速检测。

本案例中，首先，进行现场（冷冻集装箱、口岸查验点、菜市场等）样本采集。然后利用快速核酸释放试剂盒对样本进行核酸释放处理。本实施例使用购自苏州先达基因公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。步骤如下：取约20mg的鱼肉样品加入150μl 20mg的固体样品，65℃水浴1分钟，简短轻微震荡混匀后取裂解物直接进行恒温扩增。在CRISPR检测中，每个待检测样品取5 μL进行RPA预扩增，步骤与实施案例1中相同，获得CRISPR检测样品。

在CRISPR检测体系中，依次加入2 μL Buffer、1 μL Rnase Inhibitors、1 μLCRISPR、 1 μL ssDNA FQ reporter、10 μL RPA sample 、1 μL crRNA。各组分混合均匀，在37 ℃反应10 min。

本实施案例中，可通过酶标仪或荧光灯下肉眼直接判定CRISPR检测结果。如图7所示，本发明中CRISPR荧光法可通过酶标仪检测可有效对现场采集的动物制品中大西洋鲑鱼成分进行快速判定。同样的，在荧光灯下肉眼可有效对动物制品中大西洋鲑鱼成分进行快速判定（图8）。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 基于CRISPR荧光法检测大西洋鲑核酸的检测方法及其检测试剂盒

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