一种基于多通道光纤共振谱仪检测牛奶中三聚氰胺和双酚A的方法

摘要

本发明公开了一种基于多通道光纤共振谱仪检测牛奶中三聚氰胺和双酚A的方法，S1.取牛奶标准溶液分别加入三聚氰胺抗体和双酚抗体，制成样品孵化标准溶液：使多通道光纤共振谱仪的SPR传感器表面羧基化；分别固定在光纤SPR传感器表面活化的BPA‑BSA和带有BSA的三聚氰胺包被原；将样品孵化标准溶液分别通入样品池中进样检测，得到偏移量‑三聚氰胺浓度及双酚A浓度的二元二次方程；取待检测样品前处理制成待检测样品溶液，通入样品池中进样检测，测定出偏移量带入的二元二次方程中计算得出待检测样本中三聚氰胺和双酚A的含量。利用多通道光纤共振谱仪，基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待检测样品中双酚A和三聚氰胺的浓度，实时快速检测多种物质。

说明书

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，尤其是涉及一种基于多通道光纤共振谱仪检测牛奶中三聚氰胺和双酚A的方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，消费的牛奶量显著提高。近年来，在奶粉或牛奶中发现化工原料三聚氰胺，三聚氰胺影响人身健康。双酚A是制造环氧树脂、聚碳酸树脂、聚苯乙烯树脂的主要原料，又是用于酚醛树脂、聚氯乙烯、抗氧化剂等的稳定剂，不少研究表明，暴露于双酚A环境中的三聚氰胺会引发多种健康问题，例如焦虑、短期失忆、肥胖、糖尿病和心血管疾病，为了保证人们的健康，需要对牛奶及其他饮食中三聚氰胺和双酚A的含量进行控制。

目前，三聚氰胺(Melamine,MEL)和双酚A(Bisphenol,BPA)的检测方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法、气质联用和液质联用，上述方法虽然检测准确，但需要复杂的前处理，检测仪器昂贵，检测成本高，难以满足大量样品的快速检测需求，并且无法同时检测出牛奶中的三聚氰胺和双酚A。

利用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)生物光学仪器检测牛奶中的三聚氰胺和双酚A残留物是一种快捷、灵敏的技术手段，国内外有多篇论文及专利报道了包括牛奶在内的不同体系下，三聚氰胺或双酚A的检测方法。但未见同时检测牛奶中三聚氰胺和双酚A的报道。目前公开的检测三聚氰胺和双酚A的方法中，是对待测样品的两步孵育，将对多种残留物的检测转化为对同一标记物的测量，孵育步骤复杂。

因此，为了解决上述技术问题，需要一种检测成本低，适用于大量且快速检测牛奶中三聚氰胺和双酚A的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速实时检测多种物质、检测成本低、检测结果准确的基于多通道光纤共振谱仪检测牛奶中三聚氰胺和双酚A的方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于多通道光纤共振谱仪检测牛奶中三聚氰胺和双酚A的方法，包括以下步骤：

S1.取牛奶标准溶液，加入磷酸缓冲盐溶液按质量百分比1:25、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000稀释，并向稀释后的混合液中分别加入20μg/mL的三聚氰胺抗体和双酚抗体，孵化5分钟，制成样品孵化标准溶液：

S2.将多通道光纤共振谱仪的SPR传感器一和SPR传感器二的表面清洗干净，使SPR传感器表面羧基化；

S3.使用固定在光纤SPR传感器一表面活化的羧基连接固定双酚A-牛血清蛋白溶液(BPA-BSA)，固定在光纤SPR传感器二表面活化的羧基连接带有BSA的三聚氰胺包被原；

S4.将所述步骤S1中制成的多个样品孵化标准溶液分别通入样品池中进样检测，进样中游离的双酚A和固定在光纤SPR传感器一表面上的BPA-BSA包被原竞争，进样中游离的三聚氰胺和固定在光纤SPR传感器二表面上的带有BSA的三聚氰胺包被原竞争，通过光纤SPR传感器一产生的共振波长计算出共振波长与入射波长的偏移量Δλ

S5.取待检测样品进行前处理，制成待检测样品溶液；

S6.重复上述步骤S2-S3，将所述步骤S5中的待检测样品溶液通入样品池中进样检测，通过光纤SPR传感器一测定出的偏移量Δλ

在上述技术方案中，在所述步骤S2中，对光纤SPR传感器的处理包括以下步骤：

S201.将体积比为的3:7H

S202.将光纤SPR传感器的金属膜浸入2.2mg/mL的巯基十一烷酸乙醇溶液12-18小时，使金属膜表面连接羧基，而后将光纤SPR传感器浸入浓度比为0.4mol/L:0.1mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺：N-羟基硫代琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液中(体积比为1:1)，浸入45分钟活化羧基，活化羧基后用超纯水清洗，并用氮气吹干光纤SPR传感器的金属膜。

在上述技术方案中，在所述步骤S5中，对待检测样品溶液进行前处理，包括以下步骤：

S501.向牛奶中加入磷酸缓冲盐溶液稀释，再分别加入浓度为20μg/mL的三聚氰胺和BPA抗体溶液，混合得到A液；

S502.向所述步骤S501中的A液滴加冰乙酸，调节pH值为4.6，得到B液；

S503.将所述步骤S502中的B液放入离心机，离心20分钟，转速为10000r/min，得到分为三层的混合液；

S504.取所述步骤S503中混合液的中层清液放入离心管中，加入NaOH溶液调节其pH值至7.0，并将调节后的混合溶液放入离心机内离心20分钟，转速为10000r/min，得到C液；

S505.取所述步骤S504中的C液的上层清液，用0.45μm的有机膜过滤，过滤后使用分子量为3000的超滤管在10000r/min的条件下超滤15分钟，得到前处理的待检测样品溶液，并将待检测样品溶液保存在4℃的冰箱。

在上述技术方案中，所述光纤SPR传感器的金属膜为金膜。

在上述技术方案中，在所述步骤S3中固定BPA-BSA的方法为：将活化羧基的光纤SPR传感器装入多通道光纤共振谱仪，通入浓度为20μg/mL的三聚氰胺抗原的PBS溶液中，利用羧基与氨基的脱水缩合反应将BPA抗原连接到光纤表面，并用乙醇胺作为封闭液反应5-20分钟，封闭微反应的羧基结合位点。

本发明具有的优点和积极效果是：

1.通过本发明的方法，利用多通道光纤共振谱仪，基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待检测样品中双酚A和三聚氰胺的浓度，能够实时快速检测多种物质，有效降低检测成本。

2.本发明的方法前处理简单，灵敏度高，性能稳定，易于再生；通过扩增光纤通道数，可实现高通量大样本检测。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明，决不限制本发明的保护范围。

实施例1

本发明的一种基于多通道光纤共振谱仪检测牛奶中三聚氰胺和双酚A的方法，包括以下步骤：

S1.取牛奶标准溶液，加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)(10nmol/L，pH＝7.4)按质量百分比1:25、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000稀释，并向稀释后的混合液中分别加入20μg/mL的三聚氰胺抗体(MEL-mAb)和双酚抗体(BPA-mAb)，孵化5分钟，制成样品孵化标准溶液：

S2.将多通道光纤共振谱仪的光纤SPR传感器一和光纤SPR传感器二的表面清洗干净，使光纤SPR传感器表面羧基化并活化羧基；

S3.使用固定在光纤SPR传感器一表面活化的羧基连接固定双酚A-牛血清蛋白溶液(BPA-BSA)，固定在光纤SPR传感器二表面活化的羧基连接带有BSA的三聚氰胺包被原；

S4.将所述步骤S1中制成的多个样品孵化标准溶液分别通入样品池中进样检测，进样中游离的双酚A和固定在光纤SPR传感器一表面上的BPA-BSA包被原竞争，进样中游离的三聚氰胺和固定在光纤SPR传感器二表面上的带有BSA的三聚氰胺包被原竞争，通过光纤SPR传感器一产生的共振波长计算出共振波长与入射波长的偏移量Δλ

S5.取待检测样品进行前处理，制成待检测样品溶液；

S6.重复上述步骤S2-S3，将所述步骤S5中的待检测样品溶液通入样品池中进样检测，通过光纤SPR传感器一测定出的偏移量Δλ

进一步地说，在所述步骤S2中，对光纤SPR传感器的处理包括以下步骤：

S201.将体积比为的3:7H

S202.将光纤SPR传感器的金属膜浸入2.2mg/mL的巯基十一烷酸乙醇溶液12-18小时，使金属膜表面连接羧基，而后将光纤SPR传感器浸入浓度比为0.4mol/L:0.1mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺：N-羟基硫代琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液中(体积比为1:1)，浸入45分钟活化羧基，活化羧基后用超纯水清洗，并用氮气吹干光纤SPR传感器的金属膜。

进一步地说，在所述步骤S5中，对待检测样品溶液进行前处理，包括以下步骤：

S501.向牛奶中加入磷酸缓冲盐溶液稀释，再分别加入浓度为20μg/mL的三聚氰胺和BPA抗体溶液，混合得到A液；

S502.向所述步骤S501中的A液滴加冰乙酸，调节pH值为4.6，得到B液(由于牛奶中80％为酪蛋白，当pH值小于4.6时，酪蛋白发生聚集，便于离心去除)；

S503.将所述步骤S502中的B液放入离心机，离心20分钟，转速为10000r/min，得到分为三层的混合液；

S504.取所述步骤S503中混合液的中层清液放入离心管中，加入NaOH溶液调节其pH值至7.0，并将调节后的混合溶液放入离心机内离心20分钟，转速为10000r/min，得到C液；

S505.取所述步骤S504中的C液的上层清液，用0.45μm的有机膜过滤，过滤后使用分子量为3000的超滤管在10000r/min的条件下超滤15分钟，得到前处理的待检测样品溶液，并将待检测样品溶液保存在4℃的冰箱。

进一步地说，所述光纤SPR传感器的金属膜为金膜。

进一步地说，在所述步骤S3中固定BPA-BSA的方法为：将活化羧基的SPR传感器装入多通道光纤共振谱仪，通入浓度为20μg/mL的三聚氰胺抗原的PBS溶液中，利用羧基与氨基的脱水缩合反应将BPA抗原连接到光纤表面(包括终端反应式和在线传输式)，并用乙醇胺作为封闭液反应5-20分钟，封闭微反应的羧基结合位点。

进一步地说，在所述步骤S3中，利用固定在光纤SPR传感器表面的羧基化氧化石墨烯固定BPA-BSA。

在本实施例中的参数为较佳参数，其各个溶液的浓度值可以上下浮动10-15％。

本发明中，三聚氰胺和双酚A检测采用间接竞争光纤SPR方法，在两个并列的光纤传感器表面分别预包被三聚氰胺和双酚A抗原，先通过标准溶液，在同一标准溶液中的双酚A与光纤SPR传感器一的光纤表面预包被的抗原竞争抗双酚A抗体，并且同一标准溶液中的三聚氰胺与光纤SPR传感器表面预包被的抗原竞争抗三聚氰胺抗体，通过光纤SPR传感器一产生的共振波长计算出共振波长与入射波长的偏移量Δλ

本发明中采用多通道光纤共振谱仪对多样品进行多通道光纤布局，其通道之间为并行关系，不产生相互影响，且其检测步骤简单，能够一次性检测出牛奶中的三聚氰胺和双酚A的浓度。

在使用本发明对牛奶中的三聚氰胺和双酚A检测时，可将同一浓度的待检测样品放入多通道光纤共振谱仪中进行检测，求其平均值，可以更加准确的检测出牛奶中三聚氰胺或双酚A的浓度。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。