用于治疗神经退行性疾病的基于CAR-TREG的疗法

摘要

本发明提供了用于抑制神经退行性疾病的自身免疫组分并且由此向患有此类疾病的患者提供治疗效果的组合物和方法。组合物和方法包含免疫抑制部分，如调节性T细胞(Treg)以及由与嵌合抗原受体偶联的Treg表达的蛋白质或与一种或多种神经胶质细胞标志物特异性地结合的蛋白质。公开了用于治疗神经退行性疾病的所述化合物的治疗有效剂量，这些神经退行性疾病包含进行性核上性麻痹(PSP)、帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)和朊病毒病。

说明书

本申请要求于2018年3月27日提交的美国临时申请第62/648,684号的优先权和权益，该美国临时申请的内容以全文引用的方式并入。

技术领域

本发明提供了CAR-Treg组合物和其使用方法，该CAR-Treg组合物特异性地调节与各种神经退行性疾病，如进行性核上性麻痹和帕金森氏病(Parkinson's disease)有关的免疫应答和炎症。

背景技术

神经退行性疾病，如帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)(AD)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和进行性核上性麻痹(PSP)影响了很多人，通常导致快速的身体和/或精神衰退和死亡。尚无针对这些疾病的已知的治愈方法，并且治疗集中于管理症状和延缓衰退方面。

一种这样的疾病PSP是特发性退行性疾病，在老年人中并不罕见，该疾病模拟帕金森氏病(PD)。临床表现包含四联症——核上凝视麻痹、轴向刚度、痴呆和假性球麻痹。其与运动迟缓、严重的姿势障碍和频繁跌倒相关。病理与细胞损失和Tau神经原纤维缠结相关，主要在脑干、苍白球、丘脑下核和齿状核中。PSP的患病率为每100,000人5-6人，在美国每年产生5000-25000名患者。该病的平均发病年龄为63岁，从诊断到死亡的一般预后范围为5到10年，并且没有可用的疾病修饰性治疗。

帕金森氏病是另一种神经退行性疾病，尚无已知的治愈方法。帕金森氏病的患病率为约每1,000人1-2人。帕金森氏病以基底神经节中的细胞死亡以及星形胶质细胞死亡以及黑质中的小胶质细胞增加，导致这些区域中的多巴胺缺乏为特征。被称为路易体(Lewybodies)的内含物在细胞死亡之前在受损细胞中产生。存在关于驱使帕金森氏病中脑细胞死亡的潜在机制的猜测，但是对这些潜在机制的了解仍然较少，并且治疗目前集中于管理疾病症状方面。

发明内容

本发明的组合物和方法使用T调节性淋巴细胞(Treg)或由Treg细胞表达的免疫抑制蛋白来调节靶向中枢神经系统(CNS)中的神经胶质细胞的神经退行性免疫应答。通过将Treg或免疫抑制蛋白与特异性识别并结合神经胶质细胞标志物的嵌合抗原受体(CAR)或单链可变片段(scFv)偶联，免疫抑制Treg或蛋白质被吸入CNS的神经胶质细胞，以减轻炎症并且保护CNS免受自身免疫攻击。

本发明认识到大多数神经退行性疾病缺乏有效的治疗选项并且存在若干种此类疾病的自身免疫和/或炎症组分，并且对特异性抑制那些疾病组分的组合物进行工程化。本发明的化合物和方法允许神经胶质细胞调节受损免疫细胞，如1型辅助细胞(Th1)、T辅助17细胞(Th17)、细胞毒性T细胞(CTL)、M1巨噬细胞和多形核中性粒细胞(PMN)。

本发明将免疫抑制分子(Treg或免疫抑制蛋白)引导到少突胶质细胞(ODC)神经胶质细胞。所得化合物和其使用方法会募集人体自身的免疫系统，以抵消神经退行性疾病如帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病(AD)、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和进行性核上性麻痹(PSP)的效应。本发明解决机制(即中枢神经系统的自身免疫攻击)，若干种神经退行性疾病通过该机制破坏神经功能，但不依赖于潜在疾病的任何特定生化原因。因此，本发明的化合物和方法可以对若干种神经退行性疾病提供治疗效果。

本发明的方面包含用于治疗受试者的神经退行性疾病的方法，这些方法包含向该受试者施用治疗有效量的表达嵌合抗原受体(CAR)的调节性T细胞(Treg)的步骤，该嵌合抗原受体与神经胶质细胞标志物特异性地结合，其中该神经退行性疾病不是多发性硬化症(MS)。然后，CAR-Treg保护神经组织并且减轻神经组织中的炎症，由此治疗神经退行性疾病。在各个实施例中，该受试者可以是人。

该神经胶质细胞标志物可以是少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。在一些实施例中，该神经胶质细胞标志物是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。

该经治疗的神经退行性疾病可以是进行性核上性麻痹(PSP)、阿尔茨海默氏病(AD)、亨廷顿氏病、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)或朊病毒病。在一些实施例中，该神经退行性疾病是进行性核上性麻痹(PSP)。在其它实施例中，该神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病(AD)。在仍其它实施例中，该神经退行性疾病是帕金森氏病(PD)。

在某些方面，本发明提供了一种组合物，其包括治疗有效量的用于治疗神经退行性疾病的工程化调节性T细胞(Treg)，该神经退行性疾病不是多发性硬化症，该工程化Treg表达与神经胶质细胞标志物特异性地结合的嵌合抗原受体(CAR)。该组合物中的该神经胶质细胞标志物可以是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。

该组合物可以治疗上有效地治疗进行性核上性麻痹(PSP)、帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)或朊病毒病。

本发明的各个方面包含一种工程化蛋白，其包括与由调节性T细胞(Treg)表达的分子偶联的神经胶质细胞特异性结合蛋白。由该Treg表达的该分子可以是细胞外免疫抑制酶。在某些实施例中，由Treg表达的分子可以是CD73、CD39、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)或谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)。该神经胶质细胞特异性结合蛋白可以是抗体分子的四聚体单链可变片段(scFv)。

在某些实施例中，Treg表达的分子结合的神经胶质细胞特异性结合蛋白可以结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。

在一些方面，本发明提供一种工程化蛋白，其包括与模拟由调节性T细胞(Treg)表达的分子的活性的分子偶联的神经胶质细胞特异性结合蛋白。由Treg表达的模拟分子可以是细胞外免疫抑制酶，如CD73、CD39、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)或谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)。模拟分子结合的神经胶质细胞特异性结合蛋白可以结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。

附图说明

图1展示了神经胶质细胞特异性CAR-Treg和其免疫抑制功能。

图2展示了神经胶质细胞靶向免疫抑制蛋白和其免疫抑制功能。

图3展示了pMHC-四聚体与细胞毒性T细胞的结合以及本发明的GITP与靶MOG蛋白的结合。

图4展示了与CTL和pMHC相比，用标记的GITP蛋白对MOG靶细胞的最大染色。

图5展示了与CTL和pMHC相比，用标记的GITP蛋白对MOG靶细胞的染色的半衰期。

图6展示了与阴性和阳性对照相比，结合GTIP的MOG靶细胞抑制T效应细胞增殖的比较。

图7展示了与表达对MOG靶细胞的MOG具有特异性的scFv的CAR分子的相对亲和力相比，针对对应的细胞毒性T细胞克隆的pMHC的相对亲和力。

图8展示了针对人MOG-1的七种不同scFv蛋白的相对免疫反应性。

具体实施方式

本发明涉及用于调节各种神经退行性疾病的自身免疫组分的组合物。本文所提供的组合物和方法靶向神经胶质细胞特异性标志物以将免疫抑制分子(例如，Treg或由Treg表达的免疫抑制蛋白)吸引到CNS并破坏自身免疫攻击，该自身免疫攻击有助于疾病如进行性核上性麻痹(PSP)、阿尔茨海默氏病(AD)、亨廷顿氏病、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)或朊病毒病的神经退行性效果。

血脑屏障可以用作治疗脑或CNS的病症的障碍，因为该屏障可以阻挡治疗化合物进入受影响的细胞。重要地，Treg能够跨过血脑屏障并且可以通过Treg结合的神经胶质细胞定位到CNS的神经元，由此使本发明的化合物有效治疗CNS的神经退行性病症。

本发明的化合物和方法不依赖于任何疾病特异性生化机制，而是使免疫应答短路，许多神经退行性疾病通过该免疫应答影响精神和身体衰退。因此，相同的化合物和方法可以为许多神经退行性疾病提供治疗效果。

例如，PSP涉及tau蛋白堆积和神经原纤维缠结，并且导致神经元和神经胶质细胞损伤和损失、相关的身体和精神衰退以及最终死亡。帕金森氏病涉及基底神经节中的神经元损失以及星形胶质细胞死亡以及黑质中的小胶质细胞增加。被称为路易体的内含物在细胞死亡之前在受损细胞中产生。ALS的特征是在其细胞体和轴突中产生富含蛋白质的内含物后，运动皮质中的运动神经元死亡。

本发明认识到，尽管潜在原因和疾病机制不同，但是PSP、帕金森氏病和ALS以及神经退行性疾病(包含阿尔茨海默氏病(AD)、亨廷顿氏病、慢性创伤性脑病(CTE)和朊病毒病)可能包含促进炎症和CNS退化的免疫组分。参见Malaspina等人,2015,“肌萎缩性侧索硬化症的疾病起源和进展：免疫学角度(Disease origin and progression in amyotrophiclateral sclerosis:an immunology perspective)”,《国际免疫学(InternationalImmunology)》,27(3):117-129；Mosley R、Gendelman H,2017,“T细胞和帕金森氏病(Tcells and Parkinson’s disease)”,《柳叶刀神经病学(Lancet Neurology)》,16(10):769-71；这些文献中的每一个文献的内容通过引用并入本文中。因此，本发明的集中于抑制CNS中的免疫应答并且解决驱使许多神经退行性疾病的慢性炎症的化合物和方法在治疗许多那些疾病中可能是治疗上有效的。

本发明的化合物和方法使用特异性地结合神经胶质细胞标志物的嵌合抗原受体(CAR)、抗体或单链可变片段(scFv)。神经胶质细胞结合分子与Treg、由Treg表达的免疫抑制蛋白或配置成模拟由Treg表达的免疫抑制蛋白的分子偶联。神经胶质细胞是非神经元细胞，该非神经元细胞在支持包含人的各种动物的中枢神经系统和外周神经系统中的神经元方面执行许多功能。神经胶质细胞包含少突胶质细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞和小胶质细胞。由于神经胶质细胞维持CNS的神经元的功能，因此神经胶质细胞迁移到CNS的神经元并且因此可以用于在其中定位治疗化合物。例如，少突胶质细胞(ODC)神经胶质细胞通过产生髓鞘而流通到CNS，以维持轴突绝缘。本发明的化合物和方法包含将免疫抑制分子与神经胶质细胞如ODC偶联，使得当神经胶质细胞执行其功能时，免疫抑制分子紧靠如图1和2所示的CNS的神经元。免疫抑制分子的存在调节CNS中可能存在的任何正在进行的免疫应答和慢性炎症，并且促进PD、PSP等中的神经退行性疾病症状。

神经胶质细胞特异性靶包含由各种神经胶质细胞表达的蛋白质和其它标志物，如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。

在各个实施例中，CAR、scFv或抗体可以与免疫抑制分子结合并且用于靶向神经胶质细胞。CAR是可以对免疫效应细胞(T细胞)提供特异性的工程化受体。CAR已被用于赋予肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞的特异性，以用于癌症免疫疗法。参见Couzin-Frankel,2013,“癌症免疫疗法(Cancer immunotherapy)”,《科学(Science)》,342(6165):1432-33；Smith等人,2016,“针对恶性肿瘤的嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法：综述和角度(Chimericantigen receptor(CAR)T cell therapy for malignant cancers:Summary andperspective)”,《细胞免疫疗法杂志(Journal of Cellular Immunotherapy)》,2(2):59-68；这些文献中的每一个文献的内容通过引用并入本文中。使用类似的原理，本发明的化合物和方法包含对CAR(其对在神经胶质细胞如ODC上发现的标志物具有特异性)进行工程化，但不是将神经胶质细胞特异性CAR移植到细胞毒性T细胞，而是该神经胶质细胞特异性CAR被移植到工程化免疫抑制Treg上。

本发明的CAR-Treg可以表达靶向相同或两种或更多种不同神经胶质细胞标志物的多个嵌合抗原受体。

ScFv是融合蛋白，这些融合蛋白包含免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区。可以通过克隆用期望的靶分子(例如，MOG)免疫的小鼠或其它动物的VH和VL基因来产生ScFv。VH和VL基因然后可以以多种朝向并与各种连接子一起表达以形成各种scFv，然后可以对这些scFv进行实验验证以提供期望的稳定性、表达水平和对神经胶质细胞或其特异性标志物的结合亲和力。可以将上文所讨论的对神经胶质细胞标志物具有特异性的ScFv或抗体与下文所讨论的免疫抑制蛋白接合，以形成能够提供如图2所示的和下文所讨论的CNS定位的免疫抑制疗法的融合蛋白。

可以通过本领域已知的方法来产生靶向神经胶质细胞标志物的抗体，这些方法包含用于产生来自例如太平洋免疫学公司(Pacific Immunology)(加利福尼亚州圣地亚哥)或ABclonal(马萨诸塞州沃本)的定制抗体的商购可获得的服务。

可以通过用于制备CAR-T细胞的已知方法来工程化CAR-Treg。可以从受试者分离Treg细胞，优选地从待治疗的患者分离自体Treg细胞。然后可以通过已知技术，如电穿孔、病毒载体或用对所选择的工程化嵌合抗原受体进行编码的核酸进行的转染的其它形式来修饰Treg细胞的基因。然后，在引入到患者系统中以进行治疗之前，可以对CAR-Treg细胞进行实验验证。

调节性T细胞或Treg调节免疫系统并且通常下调效应T细胞的诱导和增殖。Treg防止自身免疫应答并且有助于免疫系统区分自身和非自身。调节性T细胞产生抑制性细胞因子(包含转化生长因子β、白细胞介素35和白细胞介素10)并且可以诱导其它细胞类型以表达白细胞介素10。Treg还可以产生颗粒酶B，该颗粒酶B进而可以诱导效应细胞凋亡。Treg还通过与树突状细胞的直接相互作用和诱导免疫抑制吲哚胺2,3-双加氧酶通过反向信号传导发挥功能。Treg还可以通过胞外酶CD39和CD73下调免疫应答，其中产生免疫抑制腺苷。Treg还可以通过LAG3和TIGIT与树突状细胞直接相互作用来抑制免疫应答。另一种控制机制是通过IL-2反馈环路。通过Treg免疫抑制的另一种机制是通过分子CTLA-4的作用通过效应T细胞上的CD28防止共刺激。

图1展示了靶向神经胶质细胞的CAR-Treg和其治疗机制。CAR-Treg细胞表达与神经胶质细胞上的标志物特异性地结合的CAR。由此，CAR-Treg细胞与神经胶质细胞结合并且跨血脑屏障携带，并且通过神经胶质细胞的自然功能定位到CNS的神经元。然后，结合的Treg细胞通过抑制局部神经元的免疫攻击来执行其自然调节功能。

图2示出了本发明的抑制神经元的免疫攻击的神经胶质细胞靶向的免疫抑制蛋白(GTIP)。GTIP可以包括存在于Treg细胞中的免疫抑制蛋白或酶，如清除免疫活化代谢物(例如，ATP、AMP、色氨酸和谷氨酸)的细胞外酶。此类细胞外酶可以包含CD73、CD39、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)。在图2中，表达MOG的神经胶质细胞由GTIP结合，该GTIP由与免疫抑制酶(IE)连接的抗MOG scFV组成。神经胶质细胞在执行其与神经元有关的功能时，将结合的IE定位于经受通过各种免疫细胞(Th17细胞、Th1细胞、CTL细胞、M1细胞和PMN细胞)进行的免疫攻击的神经元并且调节或关闭免疫应答，由此保留神经元并减轻潜在的神经退行性疾病的症状。GTIP可以用于治疗神经退行性疾病，如进行性核上性麻痹(PSP)、阿尔茨海默氏病(AD)、亨廷顿氏病、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)、多发性硬化症(MS)和朊病毒病。

本发明的GTIP可以包含与靶向相同或两种或更多种不同的神经胶质细胞标志物的一种或多种scFV或抗体连接的一种或多种免疫抑制蛋白(包含两种或更多种不同的蛋白质)。蛋白质可以通过任何已知的方式接合以形成本发明的GTIP，其包含例如融合蛋白或生物素-链霉亲和素连接。

如用于癌症免疫疗法技术中的过继性细胞转移技术(包含涉及细胞毒性T淋巴细胞的那些技术)可以用于制备用于本发明的化合物和方法中的自体CAR-Treg。参见Rosenberg等人,2008,“过继性细胞转移：有效癌症免疫疗法的临床途径(Adoptive celltransfer:a clinical path to effective cancer immunotherapy)”,《癌症自然评论(Nat Rev Cancer)》,8(4):299-308，这些文献的内容通过引用并入本文中。

可以将本发明的CAR-Treg或神经胶质细胞靶向的免疫抑制蛋白并入含有本文所描述的治疗化合物中的一种或多种治疗化合物中的载剂系统中。在某些实施例中，载剂系统可以是包含二硫键交联的聚乙烯亚胺(CLPEI)和脂质的纳米颗粒。脂质可以是胆汁酸，如胆酸、脱氧胆酸和石胆酸。此类载剂系统在下文的实例中进一步描述。其它示例性载剂系统在例如Wittrup等人(《自然评论/遗传学(Nature Reviews/Genetics),16:543-552,2015》)中描述，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。

如本文所使用的短语“肠胃外施用(parenteral administration和administeredparenterally)”意指除了肠内施用和局部施用以外的通常通过注射进行的施用方式，并且包含但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内以及胸骨内注射和输注。

如本文所使用的短语“全身施用(systemic administration和administeredsystematically)”和“外周施用(peripheral administration或administeredperipherally)”意指除了直接用于中枢神经系统之外施用化合物、药物或其它材料，使得其进入患者的系统，并且因此经历代谢和其它类似过程，例如皮下施用。

当将本发明的化合物作为药物施用于人和哺乳动物时，它们可以本身或作为含有例如0.1到99.5％(更优选地0.5到90％)活性成分，即至少一种本发明的治疗化合物和/或其衍生物与药学上可接受的载剂组合的药物组合物来给予。

考虑到每个典型因素，如患者的年龄、体重、性别和临床病史，每种药剂的有效剂量可以容易地由技术人员确定。通常，本发明的化合物的适当日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。

如果需要的话，活性化合物的有效日剂量可以作为在一天中以适当的间隔单独施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用，任选地以单位剂型施用。

本发明的药物组合物包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的化合物中的一种或多种或其功能衍生物。“有效量”是如本文定义部分中所定义的量并且是指在必要的剂量和时间段下对于实现所期望的治疗结果有效的量，以，例如减少或预防与神经性和/或炎性疼痛相关的效应。本发明的化合物或其功能衍生物的治疗有效量可以根据如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重和治疗化合物在受试者中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是治疗剂的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。

“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段下对于实现所期望的预防结果有效的量。通常，因为预防剂量是在疾病之前或疾病早期用于受试者的，所以预防有效量可以小于治疗有效量。预防或治疗有效量也是化合物的有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。

可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可以施用单个大丸剂，可以随时间推移施用若干分次剂量，或者可以按治疗状况的紧急情况所指出的成比例地减少或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式调配胃肠外组合物以便于施用和剂量统一。可以改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平以获得对于特定受试者、组合物和施用模式有效实现期望治疗应答，而对患者无毒性的活性成分的量。

如本文所使用的术语“剂量单位”是指适合作为针对有待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每单位含有经计算以与所需的药物载体的联合产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)化合物的独特特性和(b)复合用于治疗个体敏感性的此类活性化合物造成的本领域固有限制。

在一些实施例中，治疗有效量可以最初在细胞培养物测定中或者在动物模型(通常是小鼠、兔、狗、或猪)中估算。动物模型还可用于实现期望的施用浓度范围和途径。然后，此类信息可以用于确定对于在其它受试者中施用有用的剂量和途径。通常，治疗有效量足以减轻或抑制受试者的神经性和/或炎性疼痛。在一些实施例中，治疗有效量足以消除受试者的神经性和/或炎性疼痛。本领域普通技术人员可以使用常规考虑因素(例如，借助适当的常规药理学方案)来确定针对特定患者的剂量。医师可以例如首先开出相对较低的剂量，随后增加剂量直到获得适当的应答。根据应用，施用于患者的剂量足以随着时间的推移在患者中产生有益的治疗应答或例如减轻症状或其它适当的活性。剂量由特定调配物的功效、本发明的化合物或其功能衍生物的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状以及待治疗的患者的体重或表面积确定。剂量的大小还由特定受试者中伴随特定载体、调配物等的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度确定。根据本领域众所周知的方法，任选地在一种或多种适当的疾病的体外和/或体内动物模型(如神经性和/或炎性疼痛的模型)中测试包括一种或多种本发明的化合物或其功能衍生物的治疗组合物，以确认功效、组织代谢并估计剂量。具体地，可以在相关测定中通过活性、稳定性或治疗相对于非治疗(例如，经处理相对于未经处理的细胞或动物模型的比较)的其它合适的量度来初始确定剂量。以由相关调配物的LD50和/或观察本发明的化合物或其功能衍生物在各种浓度下的任何副作用(例如，应用于患者的质量和总体健康)确定的速率来施用调配物。施用可以经由单次或多次剂量实现。

施用通常涉及施用药学上可接受的剂型，这意指本文所描述的化合物的剂型，并且包含例如片剂、糖衣丸、粉末、酏剂、糖浆剂、液体调配物，包含悬浮液、喷雾剂、吸入剂、片剂、糖锭、乳剂、溶液、颗粒剂、胶囊和栓剂以及用于注射的液体调配物(包含脂质体制剂)。技术和调配物通常发现于《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿马克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.),最新版本，该文献以全文引用的方式并入。可以口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内进行施用。化合物可以单独施用或与合适的药物载剂一起施用，并且可以呈固体或液体形式，如片剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液或乳剂。

含有活性成分的药物组合物可以呈适合于口服使用的形式，例如作为片剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆或酏剂。旨在用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备，并且此类组合物可以含有选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的一种或多种药剂，以提供药学上雅致且可口的制剂。片剂含有与适用于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。例如，这些赋形剂可以是惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者其可以通过已知技术来包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并且由此在较长时间段内提供持久的作用。例如，可以采用如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等时延材料。它们还可以通过美国专利4,256,108、美国专利4,166,452和美国专利4,265,874(这些美国专利中的每一个的内容以全文引用的方式并入本文)中描述的技术进行涂覆，以形成用于控制释放的渗透性治疗片剂。

口服使用的调配物还可以呈现为硬质明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者呈现为软质明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。

调配物还可以包含母体(未电离的)化合物与P-环糊精，特别是羟丙基-β-环糊精的衍生物的复合物。

替代性口服调配物可以使用控释调配物来实现，其中化合物被包封在肠溶衣中。

水性悬浮液含有与适合于制备水性混悬液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七亚乙基氧基鲸蜡醇)、或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯(如具有源自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏脂的聚氧乙烯)的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂(如蔗糖或糖精)。

油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如，液体石蜡)中来调配。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂(如上文阐述的那些)和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂(如抗坏血酸)来保存。

通过添加水，适合于制备水性悬浮液的可分散粉以及颗粒提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。例证了适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂，还可能存在例如甜味剂、调味剂和着色剂。

本发明的这些药物组合物也可以呈水包油型乳剂的形式。油相可以是植物油(例如，橄榄油或花生油)或矿物油(例如，液体石蜡)或这些油的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的树胶(例如，阿拉伯树胶或黄蓍胶)、天然存在的磷脂(例如，大豆、卵磷脂)以及源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如，单油酸山梨聚糖)和该偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如，聚氧乙烯单油酸山梨聚糖)。乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。

糖浆和酏剂可以用甜味剂(例如，甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖)来调配。此类调配物还可以含有缓和剂、防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以呈无菌可注射水性或油性悬浮液的形式。这种悬浮液可以根据本领域已知的使用上面已经提及的那些适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂来调配。无菌可注射制剂还可以是非毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒剂和溶剂有水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用包括合成的甘油单酯或甘油二酯在内的任何无刺激性的不挥发性油。另外，在制备注射剂中可使用脂肪酸，如油酸。

每种活性剂还可以以栓剂的形式施用，以用于直肠施用药物。可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，该非刺激性赋形剂在常温下呈固体但在直肠温度下呈液体并且因此将在直肠中融化以释放药物。此类材料是可可脂和聚乙二醇。

对于局部使用，乳膏、软膏剂、凝胶剂、溶液或悬浮液是合适的。局部应用包含漱口水和含漱剂的使用。

术语“药物组合物”意指包括如本文所描述的化合物和至少一种组分的组合物，该至少一种组分包括药学上可接受的载剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂，如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂，这取决于施用方式和剂型的性质。术语“药学上可接受的载剂”用于意指如本文所描述的任何载剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。悬浮剂的实例包含乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶或这些物质的混合物。可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可以令人希望的是包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝(aluminum monosterate)和明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。合适的载剂、稀释剂、溶剂或媒剂的实例包含水、乙醇、多元醇、其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯，如油酸乙酯。赋形剂的实例包含乳糖(lactose)、乳糖(milk sugar)、柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸二钙。崩解剂的实例包含淀粉、藻酸和某些复杂的硅酸盐。润滑剂的实例包含硬脂酸镁、月桂烷基硫酸钠、滑石粉以及高分子量聚乙二醇。

术语“药学上可接受的盐”意指在合理的医学判断范围内适合于与人和低等动物的细胞接触而不会产生过度毒性、刺激、过敏反应等并与合理的利益/风险比相称的那些盐。

贯穿本公开已经参考和引用了其它文献，如专利、专利申请、专利出版物、杂志、书籍、论文、网页内容。出于所有目的将所有这些文献以其全文引用的方式并入本文中。

根据本文档的全部内容，包含对本文所引用的科学和专利文献的参考，除了那些在本文中示出并且描述的内容之外，本发明的各种修改及其许多另外实施例对于本领域技术人员将变得显而易见。本文的主题包含重要信息、例证以及指导，它们可以适合于在本发明的不同的实施例及其等效物中实践本发明。

实例1

研究设计

患有进行性核上性麻痹(PSP)的参与者将接受单次输注离体扩展的自体CD4+CD1271o/-CD25+CAR-T调节性细胞(Treg)。CAR-Treg将被设计成特异性地识别髓鞘少突胶质细胞蛋白(MOG)，即在中枢神经系统(CNS)中特异性地表达的糖蛋白，并且在脑中诱导免疫耐受和抗炎效果。

主要目的将是评估患有PSP的至少5位患者中离体选择的、扩展和转导的自体CNS特异性CAR-Treg的静脉输注的安全性和可行性。

主要结果量度将是：

1.不良事件

2.实验室异常

3.输注反应

4.与感染有关的并发症

5.对PSP过程的潜在负面影响

次要目的将是评估CNS特异性CAR-Treg对PSP的作用并且获得在其它神经退行性疾病中潜在应用的迹象。

终点将是：

1.评估CNS特异性CAR-Treg对PSP患者的临床、神经心理学、放射学和生物力学参数的作用。

2.获得关于CNS特异性CAR-Treg在其它神经退行性疾病(包含阿尔茨海默氏病(AD))中的潜在治疗用途的迹象。

3.获得关于可能为CAR-Treg对神经退行性病症的潜在功效提供有价值的见解的潜在II期随机、双盲、安慰剂对照试验的迹象。

患者评估

临床和神经心理学评估：如先前所报告的，将对纳入和排除标准以及临床(运动和神经心理学)和神经影像学评估进行详细描述(Giordano,《转化医学杂志(J.Transl.Med.)》2014；Canesi等人,《转化医学杂志》2016，这些文献通过引用并入本文中)。患者将使用以下量表经受神经系统检查以评估运动功能：统一帕金森氏病评定量表(UPDRS部分-III，运动评分)、Hoehn和Yahr分期(H&Y)、PSP评定量表(PSP-RS)(Goetz等人,《运动障碍(Mov.Disord.)》2004；Golbe等人,《脑(Brain)》2007；这些文献中的每一个文献的内容通过引用并入本文中)。如先前所描述的，还将进行简易精神状态评价(MMSE)(Folstein等人,《精神病学研究杂志(J.Psychiatr.Res.)》1975，该文献通过引用并入本文中)。所有这些测试将在基线和每个随访点(细胞施用后1、3、6和12个月)进行评估。如果UPDRS和PSP-RS评分与基线相比降低未超过30％，并且H&Y分期在限定时间点未发生变化，则临床病状将被分类为“稳定”(Canesi等人,《转化医学杂志》2016，这些文献通过引用并入本文中)。

神经影像：所有患者将使用脑磁共振成像(MRI)(基线，细胞施用后24小时和1年后)、纹状体多巴胺转运体单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)(两者均在基线处并且在12个月后)经受纵向神经影像评估。标记有碘-123(FP-CIT)和18F-氟-2-脱氧葡萄糖(β-CIT)的Tropanic示踪剂将分别用于SPECT成像和PET/TC成像。

对于SPECT，在所有患者中，将在甲状腺阻断(10-15mg口服Lugol溶液)后30-40分钟进行静脉内施用110-140MBq[123I]FP-CIT(Datscan，英国安玛西亚通用电气医疗集团(GE-Health,Amersham,UK))。该分析将如先前所描述的进行(Isaias等人,《神经报告(NeuroReport)》2007，该文献通过引用并入本文中)。灰质解剖分布的体积模板将通过应用宏观解剖方法(自动解剖标记)从蒙特利尔神经病学研究所(Montreal NeurologicalInstitute)MRI单个参与者脑图谱生成，并且将被重新定向和重新格式化以获得2.64cm厚的参考部分。将在此部分上手动绘制八个不规则所关注区域(ROI)的模板，以评估分别具有[123I]FP-CIT特异性和非特异性摄取的纹状体和枕骨结构的解剖程度。ROI模板还将位于参考SPECT部分上并且在纹状体皮质和枕骨皮质两者上进行调整。纹状体ROI还将被分为其前(尾状核)部分和后(壳核)部分。

将使用下式计算[123I]FP-CIT在整个纹状体、壳核和尾状核中的特定纹状体多巴胺摄取转运体(DAT)结合：[(特定ROI中的平均计数)-(枕骨ROI中的平均计数)]/(枕骨ROI中的平均计数)。还将计算每个受试者的壳核/尾状核比率。

静脉内注射170MBq后，所有患者在休息时还将经受F-氟-2-脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(FDGPET)。每次采集将包含头部的计算机断层扫描(CT)透射扫描(50mA，持续16秒)，然后使用Biograph Truepoint 64PET/CT扫描仪(西门子(Siemens))进行15分钟的三维(3D)静态发射。将使用迭代算法(OS-EM)重建PET部分，使用从用同一扫描仪获得的头部低剂量CT扫描得出的密度系数针对散射和衰减进行校正。使用迭代算法、有序子集期望最大化(OSEM)，将以2mm的

生物力学评价：将在基线以及CAR-Treg细胞施用后六个月和12个月评估生物力学评价。将借助于ad hoc算法(Carpinella等人,《IEEE跨神经系统修复工程(IEEE TransNeural Syst Rehabil Eng.)》2007,该文献通过引用并入本文中)自动提取两组特定的参数，一组用于站立并且一组用于步态起始。对于站立，将测量压力中心(CoP)平均速度和空间位移(Canesi等人,《转化医学杂志》2016，这些文献通过引用并入本文中)。为了检查步态起始，将分析预期的姿势调整(Canesi等人,《转化医学杂志》2016，该文献通过引用并入本文中)(即，不平衡和卸载阶段)并且测量以下参数：(1)两个阶段的持续时间，(2)CoP的前后(AP)和中间外侧(ML)移位和速度，(3)CoP平均长度和速度。还将测量第一步的(4)长度和(5)速度。将基于身高(BH％)归一化空间参数。

CAR-Treg细胞的制备和施用

Treg分离和扩展：将基于三种细胞表面标志物—CD4、CD25和CD127从五名患有PSP的个体中选择PolyTreg并进行扩展，以纯化如先前所描述的外周血中存在的FOXP3+ Treg(Putnam等人,《糖尿病(Diabetes)》2009；Bluestone等人,《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》,2015，这些文献通过引用并入本文中)。

将400ml新鲜的外周血收集到含有柠檬酸磷酸右旋糖的血液包装单元中并且在24小时内进行处理，以通过Ficoll密度梯度分离PBMC。Treg将在高速细胞分选仪上与以下GMP级冻干抗体分离：CD4-PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白)(L200克隆)、CD127-PE(藻红蛋白)(40131克隆)和CD25-APC(别藻蓝蛋白)(2A3克隆)。分选出的CD4+CD1271o/-CD25+细胞将被收集到3ml X-VIVO 15培养基(龙沙集团(Lonza)，目录号04-418Q)中，该培养基含有10％人热灭活的合并AB血清(Valley生物医学公司)。分选后，将分析Treg的纯度。CD4+CD1271o/-CD25+细胞的预期纯度大于96％(Bluestone等人,《科学转化医学》,2015，该文献通过引用并入本文中)。

如先前所描述的，经过纯化的Treg将与涂覆有抗CD3和抗CD28以及重组IL-2的临床级Dynabead一起培养(Bluestone等人,《科学转化医学》,2015，该文献通过引用并入本文中)。单位血液期望产生介于4.2×106与11.8×106之间的经过纯化的CD4+CD1271o/-CD25+Treg(Bluestone等人,《科学转化医学》,2015，该文献通过引用并入本文中)。经过扩展的Treg制剂期望达到约90％FOXP3+。将检查Treg制剂的活力、CD4+百分比和CD8+细胞污染(Bluestone等人,《科学转化医学》,2015，该文献通过引用并入本文中)。

经过扩展的polyTreg的表型和TCR分析：扩展后，将检查用于分离Treg的关键细胞表面标志物CD4和CD127。

先前的数据已示出，未经处理的CD45RA+ Treg在这些培养物中优先地扩展，并且CD45RA+RO-细胞在扩展时间段期间下调CD45RA并上调CD45RO(Bluestone等人,《科学转化医学》,2015，该文献通过引用并入本文中)。将在扩展前后对CCR7(即Treg转运受体)、CD38(即与增强的Treg功能相关的多功能外切酶)和CD45 RO进行测定。还将分析经过扩展的Treg的TCRP库并且将其与新鲜分离的群体进行比较以确定经过扩展的Treg的多克隆性。期望经过扩展的细胞展现出与扩展前培养物无法区分的多克隆性，并且扩展后Treg维持高度多样化的群体(Bluestone等人,《科学转化医学》,2015，该文献通过引用并入本文中)。

经过扩展的polyTreg的功能分析：Treg扩展后，将进行以下测定(Bluestone等人,《科学转化医学》,2015，该文献通过引用并入本文中)：

-FOXP3基因座的增强子区域的DNA甲基化状态，以评估经过扩展的Treg的总体纯度和稳定性。

-细胞因子产生(IFNγ、IL-4、IL-5和IL-17)以评估淋巴细胞表型

-体外抑制活性以确定经过扩展的细胞的功能潜力。

CAR-Treg细胞的产生和功能分析：根据所公开的方案，将针对人Treg电穿孔后Treg上的和过继性转移到PSP小鼠模型后小鼠Treg上的抗MOG CAR表达优化CAR RNA(Zhao,Y等人,2010《癌症研究(Cancer Res)》以及Beatty,GL等人,2014《癌症免疫学研究(CancerImmunol Res)》；Singh,N等人,2014《肿瘤免疫学(Oncoimmunol)》；这些文献中的每一个的内容通过引用并入本文中)。使用第二代慢病毒载体和标准方案(Levine,B.L.等人,2017《分子治疗方法与临床发展(Mol Ther Methods&Clin Dev)》，该文献通过引用并入本文中)递送抗MOG CAR也将被优化。人Treg将在GMP条件下使用RNA电穿孔(约1μg/3×10

细胞施用

将对每位患者进行MOG特异性CAR-Treg的单次施用(每位患者2.6×10

CAR-Treg细胞输注后的患者评估

将如上文所描述的评估CNS特异性CAR-Treg对PSP患者的临床、神经心理学、放射学和生物力学参数的作用。所有测试将在每个随访点处进行：细胞施用后的1个月、3个月、6个月和12个月。

实例2

将产生利用免疫抑制T调节性淋巴细胞(Treg)的组分以关闭引起疾病的受损免疫应答的多发性硬化症(MS)药物并且对这些药物进行测试。全球MS市场为约215亿美元，但是批准用于最常见MS形式的药物仅产生适度的疾病修饰并且具有显著的副作用。对于更严重形式的MS，治疗选项仅限于仅1种最近批准的药物。

存在11种FDA批准用于复发缓解性形式的MS(RRMS-所诊断MS的85％)的药物。目前有若干种口服可用和基于抗体的药物已批准用于RRMS或正针对RRMS进行临床评价。在2017年3月，FDA批准奥美珠单抗(Ocrelizumab)(抗CD20抗体，罗氏(Roche))用于原发性进行性MS(PPMS-所诊断MS的约10％)。奥美珠单抗减轻了25％的症状并且目前是美国针对PPMS唯一的免疫调节剂。继发性进行性MS(SPMS)总是在患有RRMS的患者中发展，对此的疾病修饰选项也有限。

生物产生

将通过CRO用重组人MOG使小鼠免疫来产生抗MOG杂交瘤。VH和VL基因以及抗scFv分子将被克隆。VH和VL以及连接子(scFv之间或每个scFv内部)的朝向可能会极大影响GTIP的稳定性、表达水平和结合能力。在一些情况下，这些形式中的仅一种形式将产生功能分子。因此，将小规模表达VH-VL的若干种朝向并且在大规模生产之前进行测试。将产生表达构建体，该表达构建体对具有连接连接子、中央连接子的4种抗MOG scFv进行编码，然后连接到Treg相关的酶或模拟物。

在小鼠MS模型中验证GTIP蛋白产物

将在MS的小鼠急性和慢性EAE模型中测试GTIP。将测量对髓鞘碱性蛋白(MBP)、骨髓炎性细胞(巨噬细胞和嗜中性粒细胞)和抗MBP抗体具有特异性的Th1、Th17、CTL(血液和CNS)的水平。免疫学应答将与疾病进展相关。剂量将有所变化以深入了解晚期MS中的潜在用途。将在正常小鼠中给药产物以深入了解任何潜在的脱靶效应。

临床评价

将进行临床研究以测试GTIP作为MS中疾病修饰剂的功效。这些产物将首先在对首次使用药物无应答的RRMS患者中进行测试。将使用类似于针对抗体疗法(例如，首先每2周静脉内3剂量，然后针对20周每4周给药)的给药方案测量安全性和耐受性。在2期研究中，主要量度将是疾病复发频率和脑病变降低。次级量度将是血液中的炎性细胞因子、Th1/Th17细胞和其它白细胞水平降低。副作用可能包含增加对感染的易感性。这些研究将使化合物相对于其它二次使用的药物的有效性基准化，其它二次使用的药物使复发频率降低多达49％。如果产物示出可接受的功效水平，则将进入PPMS患者的长期临床2期研究。主要量度将是运动功能延迟下降以及脑病变降低，并且次级量度将是血液中的炎性细胞因子、Th1/Th17细胞和其它白细胞水平降低。

实例3

如图3所示，四聚体结合测定将用于比较与靶细胞结合的GITP的亲和力与已知的针对T细胞(Ober,B等人,2000《国际免疫学(Int Immunol)》)的四聚体的亲和力。将通过使用细胞染色和流式细胞术(FCM)确定两个参数来测量H-Y肽/MHC H-2Db(pMHC)四聚体对B6.2.16CTL上的TCR的相对亲和力。这些将是使四聚体染色(在细胞洗涤后)达到最大染色和半衰期(t

实例4

将测试与MOG靶细胞结合的GTIP抑制T效应子(T eff)细胞增殖的能力。由给定清除剂IE(参见下文表1)的四聚体构成的GTIP将与MOG靶细胞结合，洗涤，然后与(例如抗CD3/CD28和IL-2刺激后3天使用标准程序产生的)增殖性人Teff一起温育(图6的中间列)。

表1

细胞将在掺有相关促有丝分裂代谢物(M)的培养基中培养，该促有丝分裂代谢物是GTIP中的IE的底物(参见上表)。随着时间的推移，如图6所示，将测量M的浓度和Teff的数量。在固定时间后，将针对GTIP修饰的MOG靶细胞的数量相对于Teff的数量进行滴定，以给出抑制活性的指标。阴性对照实验(图6的左列)(其中仅四聚体scFv与MOG靶细胞结合)将产生更长的M半衰期、固定时间后更大量的Teff以及对Teff细胞积聚无抑制活性。作为阳性对照(图6的右列)，(例如CD3/CD28和TGF-β刺激后9天在标准条件下产生的)人Treg将与Teff细胞共培养并且与GTIP修饰的MOG靶细胞相比具有抑制活性。与人Treg细胞相比，在GTIP修饰的MOG靶细胞的细胞到细胞基础上可比较的功效将作为具有特定IE的GTIP分子的阳性验证。这些测定将鉴定出由最有效的IE分子构成的GTIP。可以通过在GTIP分子中添加多于一种类型的IE分子和/或增加IE分子的化合价来增加功效。

实例5

将使用测定来测量表达对MOG具有特异性的scFv的CAR分子将Treg细胞与MOG表达性靶细胞结合的能力，其中相对亲和力近似于具有生理意义的T细胞:靶细胞相互作用的亲和力。用于比较的生理意义的T细胞:靶细胞相互作用是CTL肽/MHC(pMHC)/靶细胞相互作用。这将使用针对细胞-细胞缀合物的基于流式细胞术(FCM)的测定完成(Opferman,JT等人,2001《国际免疫学》，该文献通过引用并入本文中)。

将确定相关CTL克隆(B6.2.16)的pMHC靶的相对亲和力(图7的左列)。靶将用活体染料PKH26(红色)标记，并且CTL用CFSE(绿色)标记，共温育4小时，然后经受标准剪切力并且通过FCM进行检查。缀合物将被检测为双重染色双峰并且将取决于H-Y肽抗原的存在。pMHC靶:B6.2.16CTL相互作用的相对亲和力将通过两个参数进行测量—缀合物形成的最大水平(占总输入细胞的约80％)和缀合物解离的半衰期。MOG靶细胞将与在标准条件下产生的CAR-抗MOG scFv表达性人T细胞一起温育(例如抗CD3/CD28 IL-2刺激的T细胞的慢病毒转导)。将通过FCM测量标记的细胞之间的缀合物的半衰期(图7的右列)。与CTL:pMHC/靶细胞相比的缀合物半衰期将指示抗MOG scFv/CAR在T细胞上对MOG阳性靶细胞的生理亲和力。

实例6

通过人噬菌体展示scFv文库的亲和力淘选产生对人MOG具有特异性的scFv抗体。在文库筛选之前进行QC SDS-PAGE以评估靶的纯度。为了减少非特异性结合剂，在靶向筛选之前，首先使用聚苯乙烯平底板和针对噬菌体文库的封闭缓冲液进行预计数器选择。

三轮生物淘选后，观察到阳性富集。从第三轮中随机挑选20个克隆，并且进行QC单克隆噬菌体ELISA。与对照相比，发现18个克隆与靶结合。对所有18个阳性克隆进行测序。

从第三轮中挑选另外20个克隆并且使其经受QC单克隆噬菌体ELISA。与对照相比，发现第二组克隆的所有20个克隆与靶结合。对它们全部进行测序。

在分析38个阳性克隆后，鉴定出7个具有唯一序列的阳性克隆(克隆1、3、6、10、13、17、21)。下文列出了7种scFv蛋白的序列和对其进行编码的DNA序列：

对七种scFv蛋白中的每一种构建表达载体。之后，将细胞裂解物涂覆用于ELISA。然后在30℃和37℃两者下使用细胞裂解物进行可溶性ELISA。与对照相比，在所有7个克隆中易于观察到差异。在7个阳性克隆中，克隆1、6和13比其它克隆强得多。

对由七个阳性克隆产生的可溶性scFv进行滴定ELISA以对其结合MOG的能力进行排名。将7个scFv亚克隆到pET-26b中以构建为scFv-myc-6×His形式。在16℃下诱导的7个scFv的纯度>85％，而在37℃下诱导的纯度更低。因此，将16℃确定为更适合的生产条件。执行QC ELISA以分析七个scFv中的每一个与靶MOG的结合能力。与对照相比，在7个阳性克隆(克隆1、3、6、10、13、17、21)中的每一个中容易发现差异。在7个阳性克隆中，三个克隆(克隆3、6和17)指示与靶的结合能力更强。

对在16℃下诱导的7个克隆中的每一个进行QC ELISA滴定。七个不同浓度的7个克隆用于ELISA滴定。结果指示，所有7个克隆可以与靶MOG特异性地结合。在7个克隆中，克隆3、6和17仍指示与靶的结合能力更强。图8中示出了结果，图8展示了克隆17的抗hMOG1 scFv展现出最强的结合，之后是克隆6的结合并且然后是克隆3的结合。剩余四个克隆展现出比克隆17、6和3显著弱的结合。