一种含有新型PHA嵌合酶的重组菌及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种含有新型PHA嵌合酶的重组菌及其制备方法和应用。以富氧产碱菌PHA合酶基因phaCRe和嗜水气单胞菌WQ PHA合酶基因phaCAh为亲本，利用数据库对PhaCRe和PhaCAh的二级结构进行预测，找到两个酶的合适的结合位点，通过SOE PCR构建嵌合酶PhaCAhRe。通过本发明的方法，构建的嵌合酶PhaCAhRe能利用合适碳源产生新型PHA，提高了PHA产量，并解决了PHA单体组成单一的问题。这对今后利用基因工程技术构建产新型PHA的嵌合酶提供了理论基础，对改变PHA的单体组成提供了方法，在促进PHA更广泛的应用方面有一定价值。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种通过SOE-PCR构建新型PHA嵌合酶及含有新型PHA嵌合酶的重组菌的方法。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate，PHA)是很多微生物在碳源充足，氮源缺乏状态下产生的一类颗粒状可作为生物体内碳源和能量储备物的高分子生物聚酯。结构的多样性使得PHA拥有热塑性、生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性、抗潮性、低透气性、力学性能等许多优秀性能。由于PHA有众多的性质，因此在各个领域具有广泛的应用，如可降解包装材料、医药行业和组织工程等。

目前PHA生产存在着生产成本高、产量低、成分单一的问题。PHA合酶是PHA合成过程中的关键酶，它的活性和底物特异性决定着PHA的含量和组成。构建嵌合酶是创造新酶、改变PHA单体组成的一种方式。嵌合酶由于融合了两个或者更多的酶，因而能表现出亲本酶的特性。应用嵌合PHA合酶可以改变其底物的广泛性，有效提高PHA产量，从而从根本上降低生产成本，并产生新类型的PHA，以使它的物理化学性质更加接近化学合成的塑料以适应对不同性能PHA的不同的需求，开发PHA的新的用途。

富氧产碱菌(R.eutropha)PHA合酶(PhaC

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种解决PHA单体组成单一的构建新型PHA嵌合酶的方法。

本发明的目的之二是提供制备含有新型PHA嵌合酶的重组菌的方法。

本发明的目的之三是提供含有新型PHA嵌合酶的重组菌在生产PHA中的应用。

本发明采用的技术方案是：一种含有新型PHA嵌合酶的重组菌，包括如下步骤：

1)以pBBR1MCS2-phaC

AH1序列为：GCT

AH3序列为：GCAAGGAAGTTGGTGGCCAGGAAGT

2)以pBBR1MCS2-phaC

RH2序列为：TAC

RH3序列为：AACTTCCTTGCCACCAATCCC

3)以回收的ΔphaC

4)将扩增得到的PHA嵌合酶基因phaC

5)将重组质粒pBBR1MCS2-phaC

进一步的，上述的一种含有新型PHA嵌合酶的重组菌，步骤1)中，PCR扩增条件为：

PCR扩增体系：ddH

PCR反应条件：98℃预变性2min；95℃变性45s，56℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

进一步的，上述的一种含有新型PHA嵌合酶的重组菌，步骤2)中，PCR扩增条件为：

PCR扩增体系：ddH

PCR反应条件：98℃预变性2min；95℃变性45s，56℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

进一步的，上述的一种含有新型PHA嵌合酶的重组菌，步骤3)中，PCR扩增条件为：

PCR扩增体系：ddH

PCR反应条件：98℃预变性2min；95℃变性45s，56℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

本发明提供的一种含有新型PHA嵌合酶的重组菌在生产PHA中的应用。

进一步的，方法如下：挑取含有新型PHA嵌合酶的重组菌单菌落于LB培养基中过夜培养后，转接入加了碳源和抗生素的矿物盐培养基中，在30℃条件下，200rpm培养72h；培养后8000rpm离心10min收集菌体，水洗，醇洗，冷冻干燥。

进一步的，所述矿物盐培养基由组分I、组分II、组分III和组分IV按体积比5:93.5:1:0.1制成；

所述组分I：磷酸氢二钾30g/L，十二水磷酸氢二钠180g/L，水余量；

所述组分II：硫酸铵1g/L，硫酸镁0.41g/L，水余量；

所述组分III：氯化钙2g/L，柠檬酸铁铵(17％)5g/L，水余量；

所述组分IV：硫酸铜10mg/L，氯化镍20mg/L，氯化锰30mg/L，钼酸钠30mg/L，

硫酸锌100mg/L，氯化钴200mg/L，硼酸300mg/L，水余量。

进一步的，所述碳源添加量为，添加碳源至含量为3-20g/L；所述抗生素添加量为，添加抗生素至含量为50mg/L。

进一步的，所述碳源为果糖、葡萄糖酸钠、辛酸钠、月桂酸和油酸的一种或二种以上的混合。

进一步的，所述抗生素为卡那霉素。

本发明的有益效果是：通过本发明的方法，成功构建新型PHA嵌合酶和含有新型PHA嵌合酶的重组菌，提高了PHA产量，解决了PHA单体组成单一的问题。这对今后利用基因工程技术构建新型PHA嵌合酶提供了理论基础，对改变PHA的单体组成提供了方法，在促进PHA更广泛的应用方面有一定价值。

附图说明

图1是PCR扩增PhaC

图2是PCR扩增PhaC

图3是质粒pBBR1MCS2-PhaC

图4是质粒pBBR1MCS2-phaC

图5是PCR扩增ΔPhaC

图6是PCR扩增ΔPhaC

图7是PCR扩增PhaC

图8是pBBR1MCS2-PhaC

具体实施方式

实施例1含有phaC

本实施例，亲本采用嗜水气单胞菌WQ(A.hydrophila WQ)PHA合酶(PhaC

1、PHA合酶基因克隆：

从NCBI中获得嗜水气单胞菌WQ(A.hydrophila WQ)的序列，并以此序列设计引物AH1和AH2。

以本实验室保存的质粒pUC19-PhaPCJ为模板，以AH1为上游引物和AH2为下游引物，PCR扩增获得PhaC

AH1序列为：GCT

AH2序列为：TTT

PCR扩增体系是：ddH2O 32.5μl，5×Prime STARESDNA Polymerase buffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，模板DNA 1μl，上游引物AH1(10μM)1μl，下游引物AH2(10μM)1μl，PrimeSTARESDNA Polymerase 0.5μl。

PCR扩增条件是：98℃预变性2min；95℃变性45s，56℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

将PCR扩增获得的PhaC

2、构建质粒：

PCR扩增获得的phaC

3、制备重组菌AH

将连接反应液经化学方法转化大肠杆菌S17-1感受态细胞中，将菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板上，37℃培养过夜后挑取阳性克隆，培养后提取质粒经HindIII和EcoRI双酶切，筛选阳性转化子。再将得到的阳性转化子与PHA合酶缺失突变株PHB

提取质粒酶切验证。验证如图3所示，同时测序结果表明，表达载体pBBR1MCS2-phaC

4、重组菌AH产PHA

4.1)矿物盐培养基的制备

矿物盐培养基由组分I、组分II、组分III和组分IV按体积比5:93.5:1:0.1混合制成。

所述组分I(20×)：磷酸氢二钾30g/L，十二水磷酸氢二钠180g/L，水余量。

所述组分II(1×，现用现配)：硫酸铵1g/L，硫酸镁0.41g/L，水余量。

所述组分III(100×)：氯化钙2g/L，柠檬酸铁铵(17％)5g/L，水余量。

所述组分IV(1000×)：硫酸铜10mg/L，氯化镍20mg/L，氯化锰30mg/L，钼酸钠30mg/L，硫酸锌100mg/L，氯化钴200mg/L，硼酸300mg/L，水余量。

每100ml矿物盐培养基中，分别加入果糖2.0g(2％)、葡萄糖酸钠2.0g(2％)、辛酸钠0.5g(0.5％)、月桂酸0.3g(0.3％)、或油酸0.5g(0.5％)。

每100ml矿物盐培养基中加入卡那霉素5mg。

4.2)将含有质粒pBBR1MCS2-phaC

先用牙签挑取重组菌AH单菌落于10ml LB培养基中过夜培养，待种子液长好，再转接入100ml如表1加入了不同碳源和抗生素卡那霉素的矿物盐培养基中，分别在30℃条件下，200rpm培养72h，8000rpm离心10min收集菌体，水洗一次，醇洗一次，冷冻干燥至恒重。

称取50mg样品酯化后进行气相色谱分析，同时设定对照组，每个样三个平行。重组菌AH所产PHA的分子组成如表1。

表1

*NG：Not Grown；ND：Detected

由表1可见，重组菌株AH在八种不同碳源中生长能力不同，所产生的PHA的含量和单体组成也不同。当以乳糖和葡萄糖为单一碳源时，重组菌不生长，以其他为碳源时均能生长。当以葡萄糖酸钠和果糖为单一碳源时，细胞干重很大，最高达8.525g/L，但是只产生了3HB一种单体。而在其他碳源中发酵时均产生3HB和3HHx两种单体。其中，以辛酸钠和葡萄糖酸钠混合碳源发酵时菌体生长最好，达4.68g/L，PHA也产量最高，占细胞干重的79.68％。辛酸钠为单一碳源时细胞干重最少，相对应的PHA含量也最少，其余介于二者之间。辛酸钠为唯一碳源时两种单体组中HHx含量为4种碳源之中最多的。细胞干重和PHA含量呈现正比例关系。

实施例2含有phaC

本实施例，亲本采用富氧产碱菌(R.eutropha)PHA合酶(PhaC

1、PHA合酶基因克隆：

从NCBI中获得富氧产碱菌H16(R.eutropha H16)的序列，并以此序列设计带有HindIII和EcoRI酶切位点的引物RH1和RH2。

以R.eutropha基因组为模板，以RH1为上游引物和RH2为下游引物，PCR扩增获得phaC

RH1序列为：GAT

RH2序列为：TAC

PCR扩增体系是：ddH2O 32.5μl，5×Prime STARESDNA Polymerase buffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，模板DNA 1μl，上游引物RH1(10μM)1μl，下游引物RH2(10μM)1μl，PrimeSTARESDNA Polymerase 0.5μl。

PCR扩增条件是：98℃预变性2min；95℃变性45s，56℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

将PCR扩增获得的phaC

2、构建质粒：

PCR扩增获得的phaC

3、制备重组菌RE

将连接反应液经化学方法转化大肠杆菌S17-1感受态细胞中，将菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板上，37℃培养过夜后挑取阳性克隆，培养后提取质粒经HindIII和EcoRI双酶切，筛选阳性转化子。再将得到的阳性转化子与PHA合酶缺失突变株PHB

提取质粒酶切验证。验证如图4所示，同时测序结果表明，表达载体pBBR1MCS2-phaC

4、重组菌RE产PHA

4.1)矿物盐培养基的制备

矿物盐培养基由组分I、组分II、组分III和组分IV按体积比5:93.5:1:0.1混合制成。

所述组分I(20×)：磷酸氢二钾30g/L，十二水磷酸氢二钠180g/L，水余量。

所述组分II(1×，现用现配)：硫酸铵1g/L，硫酸镁0.41g/L，水余量。

所述组分III(100×)：氯化钙2g/L，柠檬酸铁铵(17％)5g/L，水余量。

所述组分IV(1000×)：硫酸铜10mg/L，氯化镍20mg/L，氯化锰30mg/L，钼酸钠30mg/L，硫酸锌100mg/L，氯化钴200mg/L，硼酸300mg/L，水余量。

每100ml矿物盐培养基中，分别加入果糖2.0g(2％)、葡萄糖酸钠2.0g(2％)、辛酸钠0.5g(0.5％)、月桂酸0.3g(0.3％)、或油酸0.5g(0.5％)。

每100ml矿物盐培养基中加入卡那霉素5mg。

4.2)将含有质粒pBBR1MCS2-phaC

先用牙签挑取重组菌RE单菌落于10ml LB培养基中过夜培养，待种子液长好，再转接入100ml如表2加入了不同碳源和抗生素卡那霉素的矿物盐培养基中，分别在30℃条件下，200rpm培养72h，8000rpm离心10min收集菌体，水洗一次，醇洗一次，冷冻干燥至恒重。

称取50mg样品酯化后进行气相色谱分析，同时设定对照组，每个样三个平行。重组菌RE所产PHA的分子组成如表2。

表2

*NG：Not Grown，不生长；ND：NotDetected，未检测到。

由表2可见，重组菌RE利用不同碳源发酵产生的菌体干重不同，PHA含量也不同。以葡萄糖和乳糖为碳源时，重组菌RE不生长。以果糖为碳源时菌体生长状态最好，细胞干重达6.315g/L，PHA也产量最高，占细胞干重的89.84％；以辛酸钠为碳源时重组菌生长不好，细胞干重仅为1.230g/L，PHA含量也仅为16.66％。其他碳源介于这两者之间。且随着细胞干重的上升，PHA的含量也呈现一种上升的趋势，PHA含量和细胞干重呈正比例关系。

实施例3含有新型PHA嵌合酶的重组菌及其应用

1)二级结构预测寻找嵌合酶结合位点

采用Predator、GOR4、SOPMA三种方法对A.hydrophila WQ PhaC

2)采用生物分析软件Vector NTI 6.0对两个酶进行序列比对

结果：通过序列比对和二级结构预测，寻找到红色所表示的氨基酸，即R.eutropha第159位氨基酸和A.hydrophila第154位氨基酸适合作为结合位点。

3)构建新型PHA嵌合酶

3.1)以pBBR1MCS2-phaC

AH1序列为：GCT

AH3序列为：GCAAGGAAGTTGGTGGCCAGGAAGT

PCR扩增体系是：ddH

PCR扩增条件是：98℃预变性2min；95℃变性45s，56℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

将PCR扩增获得的ΔPhaC

3.2)以pBBR1MCS2-phaC

RH2序列为：TAC

RH3序列为：AACTTCCTTGCCACCAATCCC

PCR扩增体系是。ddH

PCR扩增条件是：98℃预变性2min；95℃变性45s，56℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

将PCR扩增获得的ΔPhaC

3.3)以回收的ΔphaC

AH1序列为：GCT

RH2序列为：TAC

PCR扩增体系是：ddH

PCR扩增条件是：98℃预变性2min；95℃变性45s，56℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

经重叠延伸剪接技术(SOE-PCR)扩增得到嵌合基因phaC

4、构建重组质粒：

PCR扩增获得的嵌合基因phaC

5、制备重组菌AHRE

将连接反应液经化学方法转化大肠杆菌S17-1感受态细胞中，将菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板上，37℃培养过夜后挑取阳性克隆，培养后提取质粒经HindIII和EcoRI双酶切，筛选阳性转化子。再将得到的阳性转化子与PHA合酶缺失突变株PHB

提取质粒酶切验证。验证如图8所示，同时测序结果表明，表达载体pBBR1MCS2-phaC

6、重组菌AHRE产PHA

4.1)矿物盐培养基的制备

矿物盐培养基由组分I、组分II、组分III和组分IV按体积比5:93.5:1:0.1混合制成。

所述组分I(20×)：磷酸氢二钾30g/L，十二水磷酸氢二钠180g/L，水余量。

所述组分II(1×，现用现配)：硫酸铵1g/L，硫酸镁0.41g/L，水余量。

所述组分III(100×)：氯化钙2g/L，柠檬酸铁铵(17％)5g/L，水余量。

所述组分IV(1000×)：硫酸铜10mg/L，氯化镍20mg/L，氯化锰30mg/L，钼酸钠30mg/L，硫酸锌100mg/L，氯化钴200mg/L，硼酸300mg/L，水余量。

每100ml矿物盐培养基中，分别加入果糖2.0g(2％)，葡萄糖酸钠2.0g(2％)，辛酸钠0.5g(0.5％)，月桂酸0.3g(0.3％)，油酸0.5g(0.5％)。

每100ml矿物盐培养基中加入卡那霉素5mg。

4.2)将含有重组质粒pBBR1MCS2-phaC

先用牙签挑取重组菌AHRE单菌落于10ml LB培养基中过夜培养，待种子液长好，再转接入100ml如表3加入了不同碳源和抗生素卡那霉素的矿物盐培养基中，分别在30℃条件下，200rpm培养72h，8000rpm离心10min收集菌体，水洗一次，醇洗一次，冷冻干燥至恒重。

称取50mg样品酯化后进行气相色谱分析，同时设定对照组，每个样三个平行。重组菌AHRE所产PHA的分子组成如表3。

表3

*NG：NotGrown，不生长；ND：NotDetected，未检测到。

由表3可见，重组菌AHRE在不同碳源中菌体生长状态不同，产生的PHA含量和单体组成也不同。当以乳糖和葡萄糖为碳源时，重组菌AHRE不生长，而其他碳源均能生长。且当以葡萄糖酸钠和果糖为碳源时，细胞干重很大，最高达8.020g/L，PHA含量也最高，最高占细胞干重的91.72％，但是只产生PHB。而其他碳源均产生HB/HHx/HO。其中，以月桂酸为碳源发酵时菌体生长最好，细胞干重为5.595g/L。以葡萄糖酸钠和辛酸钠混合碳源发酵时，PHA产量最高，占细胞干重的57.54％。以辛酸钠为单一碳源细胞干重最少，产生的PHA含量也最少，其余介于二者之间。辛酸钠为唯一碳源时新的单体组成3HO含量最高，占PHA总量的1.932％。