从肺部穿刺组织中制备单细胞悬液的方法

摘要

本发明公开了一种新的从肺部穿刺组织中制备单细胞悬液的方法，属于细胞分离与培养领域。本发明的方法包括如下步骤：1)将肺部穿刺组织置于冰上剪碎至颗粒状；2)加入终浓度为0.2mg/ml的IV型胶原酶，37±0.3摄氏度下消化10‑15min；3)使用孔径40μm的细胞过滤网过滤，收集滤过液；4)加入红细胞裂解液重悬细胞。本发明的方法相比传统方法，可以有效提高细胞得率，提高细胞活性。

说明书

技术领域

本发明属于细胞分离与培养领域。

背景技术

从实体组织中制备单细胞悬液，是建立细胞模型、研究细胞生理生化机制的一项重要基础技术。对不同组织而言，制备方法不同。

肝组织细胞松散，主要以机械研磨的方法制备单细胞悬液(韩亚萍等，肝病患者的肝组织单细胞悬液与外周血中淋巴细胞亚群的分析比较，检验医学，2005年第20卷第5期)；肌肉组织紧实，配合机械研磨并配合多种消化酶同时作用，方能实现较好的制备效果(张远圆等，机械法与机械-酶消化法制备大鼠膈肌组织单细胞悬液的比较，中国组织工程研究，2020年底24卷第8期)。

肺部穿刺组织，是用穿刺针从体外刺入肺部取出的肺部组织，具有穿刺组织数量少、纤维组织多，穿刺过程中组织容易黏附红细胞等特点，从肺部穿刺组织中制备单细胞悬液难度较大，往往无法保证较高的细胞数量和活性。

从肺部穿刺样本中制备单细胞悬液的常规包括如下步骤：(1)剪碎穿刺组织；(2)胶原酶IV酶解30min；(3)70μm过滤；(4)洗涤。常规方法从每份穿刺样品(重5-10mg)中制备得到的单细胞悬液，含单细胞的数量通常不足10000个，活性不到50％。这使得以单细胞悬液作为材料的研究工作出现材料短缺，容错率低等困境，限制了相关研究工作的展开。

当前缺少一种制备单细胞悬液的高得率、高活性的方法。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种改进的从肺部穿刺组织中制备单细胞悬液的方法，以提高单细胞悬液中细胞数量和活性。

本发明的技术方案如下：

一种从肺部穿刺组织中制备单细胞悬液的方法，包括如下步骤：

1)将肺部穿刺组织置于冰上剪碎；

2)加终浓度为0.2±0.05mg/ml的IV型胶原酶，37±0.3摄氏度下消化10-15min；

3)使用孔径40μm的细胞过滤网过滤，收集滤过液，离心富集细胞；

4)加入含BSA的PBS重悬细胞，离心富集细胞；

步骤4)中，所述含BSA的PBS，是在每100ml PBS的基础上添加4±0.05mg BSA得到。

如前述的方法，步骤3)之后，若滤过液有红细胞，则加入红细胞裂解液重悬细胞，冰上静置5±1min，离心富集细胞；若无红细胞，则直接进入步骤4)。

如前述的方法，步骤2)中IV型胶原酶的终浓度为0.2mg/ml。

如前述的方法，步骤4)中，含BSA的PBS，是在每100ml PBS的基础上添加4mg BSA得到。

如前述的方法，步骤3)和/或步骤4)中，离心条件是4摄氏度下400g离心6min。

本发明的有益效果如下：

1)制备得到的细胞悬液中细胞数量多，相比常规方法提高30倍；

2)制备得到的细胞悬液中细胞活性高，相比从常规方法的不足50％，提高到95％以上。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1：从肺部穿刺组织中制备单细胞悬液的方法

包括如下步骤：

1)将装有穿刺组织样本的收集管离心(300g，2min，4℃)，弃组织保存液(HBSS)950ul，留约100ul的HBSS，将肺部穿刺组织样品管(样品重5-10mg)放在冰上。

2)剪碎组织，加入850ul的HBSS，和50μlⅣ型胶原酶(2mg/ml)，在37℃保温袋中消化10-15min。

3)消化完成，将消化液转移到其4倍体积得HBSS到15ml离心管中，用1ml的移液枪贴壁轻微吹打5-10次，将消化物经40μm的细胞过滤网(HBSS提前润洗)过滤至50ml离心管中，3-4ml用Hank's平衡盐溶液(HBSS)冲洗过滤网，1ml HBSS冲洗收集管并收集冲洗液过滤，为了减少细胞的损失，用1ml的移液器枪头收集过滤网底部剩余还未滴落的收集液，总体积约10ml，离心(400g，4℃，6min)弃上清。

4)若是收集液有血细胞，则加入0.5-1ml的红细胞裂解液重悬细胞，冰上静置6min，离心(400g，4℃，6min)弃上清；若是没有血细胞，直接进行下一步。

5)加入1ml的0.04％BSA+PBS(配制方法：4mg BSA+100ml PBS，下同)的缓冲液重悬细胞，转移至1.5ml的低吸附EP管中，离心(400g，4℃，6min)弃上清，保留100～200μl即为所要制备的单细胞悬液。

6)留适当体积的0.04％BSA+PBS计数，5ul混合荧光染料+5ul cell suspension(luna仪器配套的细胞计数板)确定最终细胞浓度和活性。

以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。

实验例1本发明的方法和现有常规制备方法的比较

1.材料选择

肺部穿刺样本来自四川大学华西医院，一共217例。对其中126例样本使用常规制备方法制备单细胞悬液，对另外91例样本使用本发明的方法制备单细胞悬液。

2.方法

2.1常规制备方法的操作步骤

(1)将装有穿刺组织样本的收集管离心(300g，2min，4℃)，弃组织保存液(HBSS)800ul，留约200ul的HBSS，将肺部穿刺组织样品管(样品重5-10mg)放在冰上。

(2)在200ul内把组织(5-10mg)剪碎，再加入700ul HBSS，最后加入100ul的2mg/mlIV型胶原酶，置于37℃烘箱的旋转孵育器中消化30min。

(3)细胞悬液过70μm过滤网(HBSS提前润洗)并转移至50ml离心管中。再吸取1mlHBSS冲洗组织消化管，过滤网，离心(500g，5min，4℃)，弃上清。

(4)5ml 0.04％BSA+PBS重悬样本，离心(500g，5min，4℃)，弃上清。

(5)1ml 0.04％BSA+PBS重悬样本，转移至1.5ml的低吸附EP管中，细胞计数确定浓缩体积；离心(500g，5min，4℃)，弃上清，保留100～200μl即为所要制备的单细胞悬液。

(6)留适当体积的0.04％BSA+PBS计数，5ul混合荧光染料+5ul cell suspension(luna仪器配套的细胞计数板)确定最终细胞浓度和活性。

2.2本发明的方法

同实施例1。

3.结果

常规制备方法制备的悬液中细胞数量为4.14×10

综上，本发明的方法能够从肺部穿刺组织中成功制备出细胞含量高、细胞活性高的单细胞悬液。