一种基于在线电容值监测的葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法

摘要

本发明公开了一种基于在线电容值监测的葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法，所述方法包括：种子培养的步骤；发酵培养生产乙醇的步骤；在所述发酵培养生产乙醇的步骤中，在线监测发酵液电容值，当所述发酵液电容值呈下降趋势时，开始进行葡萄糖补料，继续发酵。本发明的方法中，将活细胞传感仪引入到乙醇发酵过程中，通过建立电容值与活细胞之间的数学模型，证明了活细胞传感仪在发酵过程中能够实现关键指标参数生物量的在线监测，进而在线指导乙醇发酵过程中的分阶段添加葡萄糖，缓解发酵过程中对细胞生长和乙醇合成的抑制作用，从而有效提高乙醇生产效率及糖醇转化率。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种基于在线电容值监测的葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法。

背景技术

随着化石燃料的消耗以及使用化石燃料造成的环境污染和全球变暖等问题的不断升级，生物燃料被认为是最有潜力的可再生生物质能源，以期应对全球气候变化和能源安全等带来的风险。通过生物燃料乙醇替代化石燃料可以减少汽车90％二氧化碳排放，从而表现出更好的环境友好性，但是在经济性上仍存在一定劣势。因此，开发高效的燃料乙醇发酵技术是实现低成本生产的关键。

过程检测对于发酵过程特性的认识和调控具有重要的作用，特别是关键参数的实时获取更是能够为在线动态调控提供基础。虽然对于酿酒酵母发酵生产乙醇的研究已经有较多报道，并且开发了多种过程调控策略来实现高效发酵，包括高浓度底物与产物抑制缓解、高性能菌种改造、最优环境控制等。但是目前工业乙醇发酵过程控制仍以人工经验为主，其过程在线检测参数仅局限于温度、pH等，因此无法实现关键指标参数的在线监测，尤其是生物量的在线监测。生物量是微生物生长、代谢、生产过程中的一个重要指标，是发酵过程中极为重要的控制因素，有许多常见的离线检测方法，诸如平板计数法、细胞干重法、分光光度法、离心体积法等。但是这些方法存在离线、耗时耗力，无法区分活死细胞等缺点，因此，难以准确实时反映发酵过程中真实的活细胞状态。

因此，亟需提供一种葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法，通过发酵液电容值的在线监测，进而实现活细胞数量这一关键指标参数的在线监测，以指导乙醇发酵过程中底物的调控，提高乙醇产量和效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于在线电容值监测的葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法，将活细胞传感仪引入到乙醇发酵过程中，通过电容值的在线监测，进而指导乙醇发酵过程中葡萄糖的分阶段添加，能够有效缓解高浓度底物抑制作用，有效提高乙醇生产效率及糖醇转化率。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。

本发明提供了一种基于在线电容值监测的葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法，所述方法包括：种子培养的步骤；发酵培养生产乙醇的步骤；

在所述发酵培养生产乙醇的步骤中，在线监测发酵液电容值，当发酵液电容值呈下降趋势时，开始进行葡萄糖补料，使得补入葡萄糖后的发酵液中的葡萄糖浓度为90～110g/L，继续发酵；

其中，所述发酵培养生产乙醇的步骤中，初始葡萄糖浓度为90～110g/L。

进一步，补入葡萄糖后使得发酵液中的葡萄糖浓度恢复为初始葡萄糖浓度。

进一步，所述初始葡萄糖浓度为100g/L。

进一步，采用活细胞传感仪检测所述发酵液电容值，所述发酵液电容值用以表征发酵液中活细胞的数量。所述发酵液电容值与菌落形成单位数(CFU) 之间为线性关系，相关系数R

进一步，采用活细胞传感仪在线监测所述发酵液电容值，监测间隔时间为20～40min。

进一步，所述在线监测发酵液电容值的步骤为：将活细胞传感仪直接连入到所述发酵液中，以交变频率为频道，于Yeasts/Fungi fermentation模式进行采集，在线检测出发酵罐中发酵液的电容值，采样间隔为20～40min。

进一步，所述采样间隔为30min。

进一步，当所述发酵液电容值连续2～3个点下降时，开始进行葡萄糖补料。

进一步，当所述发酵液中葡萄糖的含量低至5g/L以下时，补入葡萄糖。

进一步，所述种子培养的步骤包括：挑取单菌落接入种子培养基中，在 30℃、220rpm的条件下培养，培养时间为14h。

进一步，所述发酵培养生产乙醇的步骤包括：将种子培养后得到的种子培养液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，培养温度为30℃，搅拌转速为150 rpm；其中所述种子培养液的接种量为20％。

进一步，在所述发酵培养生产乙醇的步骤过程中，采用电子嗅在线检测乙醇含量。采用电子嗅检测所述乙醇浓度响应值来表征发酵液中乙醇浓度，以监控发酵液中产物的形成。所述发酵液在线乙醇浓度响应值经标准曲线计算后，所得乙醇浓度与离线液相色谱所测乙醇浓度之间具有良好的相关性，相关系数达到0.999。电子嗅在线监测发酵液中乙醇浓度能够及时反馈发酵过程中产物生成情况。

进一步，所述发酵培养基包括葡萄糖溶液、KH

进一步，所述种子培养基包括：葡萄糖溶液、KH

进一步，所述发酵培养基包括：100g/L葡萄糖溶液、10g/L的KH

进一步，所述种子培养基包括：40g/L葡萄糖溶液、10g/L的KH

本发明中发酵生产乙醇采用的菌株为酿酒酵母。

本发明中，所采用的材料或原料除另有规定外，均为市售产品。

本发明实施例中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae B1)来自国家生化工程技术研究中心(上海)保藏菌株；一水合葡萄糖来自上海泰坦科技股份有限公司；KH

本发明中，所采用的仪器除另有规定外，均为市售产品。

本发明实施例中，5L搅拌式生物反应器：上海国强生化工程装备有限公司；InPro325X(i)pH Electrodes：美国梅特勒-托利多公司；活细胞传感仪 (Biomass monitor220)：英国Aber公司；分光光度仪：上海菁华科技仪器有限公司；离心机：上海安亭科学仪器厂；pH计：梅特勒-托利多；SBA-40D生化分析仪：山东省科学院；高效液相色谱柱(MetacarbH柱)、高效液相色谱仪(HPLC，Agilent 1100)：美国安捷伦公司。

本发明中，采用的电子嗅对乙醇的响应及拟合度较好，有较高的相关性且响应值范围也较大，能够实时在线准确检测乙醇浓度。

本发明实施例中，光密度(OD)测定：每隔2h从发酵液中收集1mL样品，稀释一定倍数后，用分光光度计在波长600nm条件下进行检测。OD

本发明实施例中，细胞干重(DCW)测定：每隔2h从发酵液中收集8mL 样品加入空管，在4℃，4000rpm下离心5min，弃去上清液，然后使用8mL 去离子水重悬菌体，再次离心弃去上清液后，放置在烘箱中烘干至恒重。

本发明实施例中，菌落形成单位数(CFU)测定：每隔2h从发酵液中收集1mL样品，使用无菌水将混匀的发酵液稀释至适当的倍数，取40μL涂布于平板上，在30℃的培养箱中培养48h后，取出并计数。

本发明实施例中，HPLC方法测定乙醇和甘油含量：每隔2h从发酵液中收集20mL样品，在4000rpm下离心5min，取上清液稀释一定倍数后，用 HPLC和RI检测器在50℃柱温下进行乙醇和甘油测定，流动相为10mmol/L H

本发明实施例中，电子嗅实时在线监测乙醇含量装置及原理，请参考图1：

如图1所示，通过蠕动泵从发酵罐中引出发酵液到250mL的外置瓶中，然后通过另一台蠕动泵将外置瓶中发酵液泵回到发酵罐中，使得外置瓶中发酵液体积控制在100mL。向外置瓶发酵液中通入1～4L/min无菌空气，并从瓶口处引一路气体进入电子鼻进行实时在线检测。由亨利定律可知，当气相压力不大时，溶质的蒸汽压与溶质浓度成正比。电子嗅检测乙醇的基本原理是将乙醇从发酵液中蒸发后由电子嗅进行上方蒸汽中乙醇分压的检测。电子嗅测定数据时间间隔设定为10min。

电子嗅检测乙醇浓度的检出限：采用不含乙醇的去离子水测定电子嗅基线的波动范围，将测得的标准误差作为噪声，检出限为基线平均值加3倍噪声所对应的样品浓度。

电子嗅检测乙醇浓度的响应值范围：响应值的下限为检出限，响应值上限为电子嗅通道在设定乙醇范围内所能达到的最高响应值。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法，将活细胞传感仪和电子嗅引入到乙醇发酵过程中，通过电容值的在线监测，进而指导乙醇发酵过程中葡萄糖的分阶段添加；通过本申请的补料发酵方法，可以降低初始葡萄糖浓度，能够有效缓解高底物浓度抑制作用，进而有效提高乙醇生产效率及糖醇转化率。本发明中通过实时在线检测发酵液中电容值能够快速、高效地反映过程中活细胞数量的变化和产物乙醇生成情况，当所述发酵液电容值呈下降趋势时，能够准确指导葡萄糖补料，提高乙醇发酵的发酵效率。

本发明将活细胞传感仪引入到乙醇发酵过程中，通过建立电容值与活细胞之间的数学模型，同时实现多个关键指标参数的在线监测，在此基础上，以过程中活细胞量变化为指导，建立底物葡萄糖在线控制补料策略，从而有效提高乙醇的发酵效率。

本申请将活细胞传感仪和电子嗅引入到乙醇发酵过程中，能够有效实现过程中活细胞量和乙醇含量的实时在线检测，并用于发酵过程葡萄糖动态补料的指导，使得乙醇产量相较于批次发酵提高了15.4％，乙醇产率从3.19g/L/h提高到3.69g/L/h，而且糖醇转化率也提高了9.04％。本发明将为工业规模乙醇发酵过程关键参数指标的在线监测提供重要的理论和技术支撑。

本发明，电子嗅中特异敏感通道响应值与乙醇浓度之间也可建立数学模型，能够实现乙醇浓度的在线监测，发酵过程中也可在乙醇浓度变化为指导，建立底物葡萄糖在线控制补料策略，从而有效提高乙醇的发酵效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中的电子嗅实时在线监测发酵过程中乙醇含量装置示意图。

图2为对比例1中的发酵过程中发酵液电容值与OD

图3为对比例1中的发酵过程中发酵液电容值与OD

图4为对比例1中的发酵过程中发酵液电容值与DCW的对应关系图。

图5为对比例1中的发酵过程中发酵液电容值与CFU的对应关系图。

图6为试验例1中电子嗅和HPLC检测乙醇标准溶液曲线图。

图7为试验例1中电子嗅和HPLC检测对5L发酵罐的发酵液进行乙醇浓度的对比图。

图8为不同初始葡萄糖浓度对菌体生长影响的数据图。

图9为不同初始葡萄糖浓度对乙醇生产影响的数据图。

图10为试验例3中的发酵过程中发酵液电容值的变化曲线图。

图11为试验例3中的发酵过程中乙醇生产的变化曲线图。

图12为试验例3中的发酵过程中葡萄糖消耗的变化曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在本文中术语“包括”是指“包括但不限于”。本申请的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及 6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。本文中所揭露的大小和数值不应意图被理解为严格限于所述精确数值。相反的，除非另外指明，各种大小旨在表示所引用的数值以及功能上与所述数值相同的范围。例如所揭露的大小为「100g/L」是指「约100g/L」。

本发明实施例提供一种基于在线电容值监测的葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法，所述方法包括：种子培养的步骤；发酵培养生产乙醇的步骤。

在所述发酵培养生产乙醇的步骤中，在线监测发酵液电容值，当所述发酵液电容值呈下降趋势时，开始进行葡萄糖补料，使得补入葡萄糖后的发酵液中的葡萄糖浓度为90～110g/L，继续发酵。其中所述发酵培养生产乙醇的步骤中，初始葡萄糖浓度为90～110g/L；例如，所述初始葡萄糖浓度可以为90g/L、100 g/L或110g/L。

本实施例中，采用活细胞传感仪检测所述发酵液电容值，所述发酵液电容值用以表征发酵液中活细胞的数量。所述发酵液电容值与菌落形成单位数 (CFU)之间为线性关系，相关系数R

本实施例中，采用活细胞传感仪在线监测所述发酵液电容值，监测间隔时间为20～40min。具体地，所述在线监测发酵液电容值的步骤为：将活细胞传感仪Biomass Monitor220直接连入到所述发酵液中，以交变频率为频道，于 Yeasts/Fungi fermentation模式进行采集，在线检测出发酵罐中发酵液的电容值，采样间隔为20～40min。例如，监测间隔时间可以为20min、30min或40min。

在一些实施例中，当所述发酵液电容值连续2～3个点下降时，开始进行葡萄糖补料。

在一些实施例中，在所述发酵培养生产乙醇的步骤过程中，采用电子嗅在线检测乙醇含量。采用电子嗅检测乙醇浓度响应值来表征发酵液中乙醇浓度，以监控发酵液中产物的形成。所述发酵液在线乙醇浓度响应值经标准曲线计算后，所得乙醇浓度与离线液相色谱所测乙醇浓度之间具有良好的相关性，相关系数达到0.999。在线电子嗅响应值能够反映发酵过程中产物生成情况。

在一些实施例中，采用电子嗅在线监测发酵液产物乙醇浓度，其具体步骤可以为：通过蠕动泵从发酵罐中引出发酵液到250mL的外置瓶中，然后通过另一台蠕动泵将瓶中发酵液泵回到发酵罐中，使得外置瓶中发酵液体积控制在 100mL。向外置瓶发酵液中通入1～4L/min无菌空气，并从瓶口处引一路气体进入电子鼻进行实时在线检测。电子嗅测定数据时间间隔设定为10min。

在一些实施例中，当所述发酵液电容值连续2～3个点下降指导葡萄糖补料时，所述电子嗅的乙醇响应值也会出现下降。

在一些实施例中，当所述发酵液电容值连续2～3个点下降指导葡萄糖补料时，所述发酵液中葡萄糖的含量一般低至5g/L以下。

在一些实施例中，所述种子培养的步骤包括：挑取单菌落接入种子培养基中，在30℃、220rpm的条件下培养，培养时间为14h。其中采用的菌种可以为酿酒酵母。

在一些实施例中，所述发酵培养生产乙醇的步骤包括：将种子培养后得到的种子培养液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，培养温度为30℃，搅拌转速为150rpm；其中所述种子培养液的接种量为20％。

在一些实施例中，所述发酵培养基包括葡萄糖溶液、KH

在一些实施例中，所述种子培养基包括：葡萄糖溶液、KH

在一些实施例中，在所述发酵培养生产乙醇的步骤过程中，采用电子嗅在线检测乙醇含量。具体地，所述电子嗅的一敏感通道在不同乙醇浓度(g/L) 下的响应曲线，如下表所示：

根据上表可知，表中的电子嗅通道对乙醇的响应及拟合度较好，不但有较高的相关性，而且其响应值范围也较大，因此本发明中采用所述通道对发酵过程中的乙醇浓度进行在线检测。

实施例1

本实施例提供一种葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法，所述方法的步骤包括：

①种子培养：从平板上挑取单菌落，装有100mL种子培养基的250mL 摇瓶中，在30℃、220rpm的摇床中培养14h，得到种子培养液；

②发酵培养生产乙醇：以20％的接种量将所述种子培养液接入到装有发酵培养基的5L密封发酵罐中(工作体积为3L)，发酵液中初始葡萄糖浓度为 100g/L，培养温度为30℃、搅拌转速为150rpm，进行发酵培养；

在所述发酵培养过程中在线监测发酵液电容值：将活细胞传感仪BiomassMonitor 220直接连入到所述发酵罐中，以交变频率为频道，于Yeasts/Fungifermentation模式进行采集，在线检测出发酵罐中发酵液电容值，采样间隔为 20～40min；

当所述发酵液电容值呈下降趋势时，开始进行葡萄糖补料，使得补入葡萄糖后的发酵液中的葡萄糖浓度为100g/L，继续发酵。

本实施例中，所述种子培养基包括：40g/L葡萄糖溶液、10g/L的KH

本实施例中，所述发酵培养基包括：100g/L葡萄糖溶液、10g/L的KH

本实施例中，所述发酵液电容值与菌落形成单位数(CFU)之间为线性关系，相关系数R

对比例1

本实施例提供一种酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，所述方法的步骤包括：

种子培养：从平板上挑取单菌落，装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，在30℃、220rpm的摇床中培养14h，得到种子培养液；

发酵培养生产乙醇：以20％的接种量将种子培养液接入到装有发酵培养基的5L密封发酵罐中(工作体积为3L)，初始葡萄糖浓度为200g/L，培养温度为30℃、搅拌转速为150rpm，进行发酵培养，直至发酵结束。

在对比例1的酿酒酵母发酵生产乙醇过程中，采用三种常规离线生物量检测值OD

从图2中可以看出，在接种后8～32h之内，4个参数都呈现显著上升，而且趋势相同。但是在32h之后，4个参数的变化趋势出现显著差异，其中电容值和CFU值开始明显下降，而OD

在本实施例发酵中，通过测定葡萄糖含量可以知道，当发酵进行到30h 时，发酵液中葡萄糖含量已经低至5g/L以下，而32h时已经耗尽。因此，菌体在此时会受到严重的底物限制，从而趋于死亡。由于OD

通过拟合电容值与OD

图2为对比例1中的发酵过程中发酵液电容值与OD

图3为对比例1中的发酵过程中发酵液电容值与OD

图4为对比例1中的发酵过程中发酵液电容值与DCW的对应关系图。

图5为对比例1中的发酵过程中发酵液电容值与CFU的对应关系图。

试验例1

本试验例中观察在线电子嗅测定乙醇浓度与离线HPLC法测定乙醇浓度关系。

首先，将不同浓度的乙醇标准溶液分别通过电子嗅和HPLC检测，并进行线性拟合；详见图6所示。同时，进一步使用电子嗅与HPLC对5L发酵罐的发酵液进行乙醇浓度的对比分析；详见图7所示。

图6为试验例1中电子嗅和HPLC检测乙醇标准溶液曲线图。

图7为试验例1中电子嗅和HPLC检测对5L发酵罐的发酵液进行乙醇浓度的对比图。

根据图6，可以发现电子嗅测定结果与HPLC测定结果具有非常良好的对应关系，其R

根据图7，结果表明，电子嗅检测数据与HPLC测定数据的趋势完全一致，进一步通过皮尔逊相关系数分析，可以得到5L罐发酵中数据的相关系数达到了0.999，表明两者具有非常好的相关性。

上述结果也说明，本发明使用电子嗅能够对酿酒酵母发酵过程中的乙醇浓度进行实时在线检测。

试验例2

本试验例为研究不同初始葡萄糖浓度对菌体生长和乙醇生产的影响，具体方法如下所示。

方法：分别以100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L为初始葡萄糖浓度，其他条件与对比例1中的发酵方法相同，观察菌体生长情况和乙醇生产产量。记录实验数据，详见图8和图9所示。

图8为不同初始葡萄糖浓度对菌体生长影响的数据图。

图9为不同初始葡萄糖浓度对乙醇生产影响的数据图。

根据图8和图9可知，在不同初始葡萄糖浓度条件下，菌体基本都在12h 左右进入到稳定期，但是随着初始葡萄糖浓度的升高，发酵初始阶段细胞的生长速率和乙醇合成速率都呈现下降趋势。显然，高浓度的初始葡萄糖浓度会对细胞生长和乙醇合成形成明显的抑制作用。

试验例3

本试验例对本发明实施例1的葡萄糖补料发酵生产乙醇的方法(补料批次) 和对比例1的发酵方法(对照批次)中的发酵液电容值、乙醇浓度和葡萄糖浓度进行检测。记录实验数据，详见图10、图11和图12所示。

图10为试验例3中的发酵过程中发酵液电容值的变化曲线图。

图11为试验例3中的发酵过程中乙醇生产的变化曲线图。

图12为试验例3中的发酵过程中葡萄糖消耗的变化曲线图。

从图10和图11中可以看出，通过在线应用活细胞传感仪以及电子嗅，在葡萄糖补料添加的批次中，发酵液电容值在11.5～12.5h呈下降趋势，连续两个点下降，因此在此时间点开始进行葡萄糖补料，且此时对应乙醇浓度也有略微的下降。此外，通过后续葡萄糖浓度的离线测定，表明葡萄糖在12h左右已经耗尽。

对比200g/L初始葡萄糖批次(对照批次)和葡萄糖补料策略批次(补料批次)可以发现，补料批次的细胞生长要明显快于对照批次，这也说明通过降低初始葡萄糖浓度确实能够有效缓解高底物浓度抑制作用。

如图12所示，值得注意的是，两个批次虽然都在24h左右能够将发酵液中的葡萄糖完全耗尽，但是补料批次由于补料操作，其发酵结束时的体积要明显大于对照批次，因此将两个批次的发酵体积标准化至初始体积后，如表1 所示。

表1

根据表1，可以明显看出，标准化后补料批次的乙醇浓度要显著高于对照批次，其最终乙醇浓度达到93.8g/L，较对照批次提高了15.4％，同时乙醇产率和转化率也分别提高了15.9％和9.04％。

通过实施例1与对比例1中的发酵过程进行对比可知，本发明利用在线活细胞传感仪(监测发酵液电容值)能够理性在线指导乙醇发酵过程中葡萄糖补料，从而有效提高乙醇生产效率。同时通过电子嗅在线监测发酵液中乙醇含量，可以进一步证实本发明指导乙醇发酵的有效性和准确性，有益效果显著。

目前，一般批发酵方法中采用200g/L初始葡萄糖浓度进行发酵，这通常会造成一定程度的高浓度底物抑制。然而通过本申请的补料发酵方法，可以降低初始葡萄糖浓度，进而能够有效缓解高底物浓度抑制作用。

综上所述，本发明将活细胞传感仪和电子嗅引入到乙醇发酵过程中，通过建立电容值与活细胞之间、电子嗅中敏感通道与乙醇浓度之间的数学模型，同时实现多个关键指标参数的在线监测。在此基础上，以过程中活细胞量变化为指导，建立底物葡萄糖在线控制补料策略，从而有效提高乙醇的发酵效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。