帕金森氏病的确定

摘要

本发明公开了用于精确鉴定帕金森氏病的方法和组合物。更特别地，本公开内容涉及在死前组织样品中对帕金森氏病的确定。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月9日提交的美国临时专利申请系列号62/716,504的权益，该美国临时专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本公开内容涉及用于准确鉴定帕金森氏病的方法和组合物。更特别地，本公开内容涉及在死前组织样品中对帕金森氏病的确定。

背景技术

目前，帕金森氏病(PD)是通过对受试者的症状进行临床检查以及脑中多巴胺转运蛋白功能的成像(DaTscan)进行评估的。由于缺乏准确鉴定出受试者患有PD的诊断测试，阻碍了帕金森氏病治疗剂的开发。PD的明确诊断是神经元中存在聚集的α-突触核蛋白(aSyn)以及脑黑质区多巴胺能神经元的丧失，并且只能在验尸后进行。

发明内容

发明人已经发现，在本领域中需要明确地和准确地鉴定出活体受试者中的帕金森氏病。

本文提供了用于确定受试者是否患有帕金森氏病(PD)的方法，所述方法包括：(a)使来自受试者的包括至少一个神经特征的生物学样品与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触；(b)检测能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗是否位于生物学样品的神经特征内；以及(c)当能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗位于所述神经特征内时，确定受试者患有PD。

在方法的一些中，样品包含组织样品。在方法的一些中，神经特征包括神经细胞。在方法的一些中，神经特征包括前驱神经细胞。在方法的一些中，神经特征与神经细胞相邻。

在方法的一些中，样品在与所述能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触之前，与至少一种蛋白酶接触。在一些实施例中，该方法进一步包括使样品与至少一种磷酸酶接触。

在方法的一些中，该方法进一步包括使来自受试者的生物学样品与能够结合神经特征的一抗接触。在一些实施例中，能够结合神经特征的一抗选自能够结合选自由以下各项组成的组的蛋白的抗体：泛素C末端水解酶L1(PGP9.5、UCHL1、NDGOA；PARK5；PGP95；SPG79；Uch-L1；HEL-117；PGP 9.5；HEL-S-53)、RNA结合的fox-1同源物3(RBFOX3、FOX3、NEUN、FOX-3、HRNBP3)、微管相关蛋白2(MAP2、MAP2A、MAP2B、MAP2C)、160kDa神经丝中链(NEFM、NFM、NEF3、NF-M)、200kDa神经丝重链(NEFH、NFH、CMT2CC)、突触素(SYP、MRX96、MRXSYP)和Discs large MAGUK支架蛋白4(DLG4、DLGH4、PSD-95、PSD95、SAP-90、SAP90、SAP90A)。

在方法的一些中，检测包括组织化学分析。在方法的一些中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗检测在残基S129处磷酸化的α-突触核蛋白。

在方法的一些中，样品是固定的。在一些实施例中，样品是福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)样品。在方法的一些中，样品是冷冻样品。在方法的一些中，样品包括神经特征的切片。在方法的一些中，样品选自由以下各项组成的组：皮肤组织、结肠组织和颌下腺。

在方法的一些中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗和能够结合神经特征的一抗来自同一宿主物种，其中宿主物种为小鼠或兔。

在方法的一些中，步骤(a)进一步包括使样品与第一二抗接触，第一二抗具有与其缀合的第一标记，其中第一二抗与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗具有免疫反应性。在一些实施例中，该方法包括使样品与一组与第一二抗的第一标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与磷酸化的α-突触核蛋白接近的第一可检测信号。

在方法的一些中，在使样品与能够结合神经特征的一抗接触之前，该方法包括通过在100℃孵育样品至少15分钟来使样品中的免疫复合物变性。在一些实施例中，该方法进一步包括使样品与第二二抗接触，第二二抗具有与其缀合的第二标记，其中第二二抗与能够结合神经特征的一抗具有免疫反应性。在一些实施例中，该方法包括使样品与一组与第二二抗的第二标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与神经特征接近的第二可检测信号。在一些实施例中，第一可检测信号和第二可检测信号是不同的。在一些实施例中，第一可检测信号为银染并且第二可检测信号为QM-Dabsyl或固红。

在方法的一些中，受试者疑似患有PD。

本文还提供了试剂盒，其包含：(a)能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗；和(b)能够结合神经特征的一抗。在一些实施例中，试剂盒进一步包含：(c)第一二抗，该第一二抗具有与其缀合的第一标记，其中第一二抗与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗具有免疫反应性；(d)一组试剂，当其与第一二抗的第一标记反应时生成第一可检测信号；(e)第二二抗，该第二二抗具有与其缀合的第二标记，其中第二二抗与能够结合神经特征的一抗具有免疫反应性；和(f)一组试剂，当其与第二二抗的第二标记反应时生成第二可检测信号；其中第一可检测信号和第二可检测信号是不同的。在一些实施例中，第一可检测信号为银染并且第二可检测信号为QM-Dabsyl或固红。

在试剂盒的一些中，能够结合神经特征的一抗选自能够结合选自由以下各项组成的组的蛋白的抗体：泛素C末端水解酶L1(PGP9.5、UCHL1、NDGOA；PARK5；PGP95；SPG79；Uch-L1；HEL-117；PGP 9.5；HEL-S-53)、RNA结合的fox-1同源物3(RBFOX3、FOX3、NEUN、FOX-3、HRNBP3)、微管相关蛋白2(MAP2、MAP2A、MAP2B、MAP2C)、160kDa神经丝中链(NEFM、NFM、NEF3、NF-M)、200kDa神经丝重链(NEFH、NFH、CMT2CC)、突触素(SYP、MRX96、MRXSYP)和Discs largeMAGUK支架蛋白4(DLG4、DLGH4、PSD-95、PSD95、SAP-90、SAP90、SAP90A)。

本文还提供了用于确定受试者是否患有帕金森氏病(PD)的方法，该方法包括：(a)从疑似患有PD的受试者制备生物学样品的固定或冷冻切片；(b)检测磷酸化的α-突触核蛋白是否位于切片的神经特征内；以及(c)当磷酸化的α-突触核蛋白位于神经特征内时，诊断受试者患有PD。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括：(d)使切片与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗和能够结合神经特征的一抗接触。

在方法的一些中，能够结合神经特征的一抗选自能够结合选自由以下各项组成的组的蛋白的抗体：泛素C末端水解酶L1(PGP9.5、UCHL1、NDGOA；PARK5；PGP95；SPG79；Uch-L1；HEL-117；PGP 9.5；HEL-S-53)、RNA结合的fox-1同源物3(RBFOX3、FOX3、NEUN、FOX-3、HRNBP3)、微管相关蛋白2(MAP2、MAP2A、MAP2B、MAP2C)、160kDa神经丝中链(NEFM、NFM、NEF3、NF-M)、200kDa神经丝重链(NEFH、NFH、CMT2CC)、突触素(SYP、MRX96、MRXSYP)和Discs largeMAGUK支架蛋白4(DLG4、DLGH4、PSD-95、PSD95、SAP-90、SAP90、SAP90A)。

在方法的一些中，该方法进一步包括：使切片与第一二抗接触，第一二抗具有与其缀合的第一标记，其中第一二抗与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗具有免疫反应性，以及使切片与第二二抗接触，第二二抗具有与其缀合的第二标记，其中第二二抗与能够结合神经特征的一抗具有免疫反应性。在一些实施例中，该方法进一步包括：使切片与一组与第一二抗的第一标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与磷酸化的α-突触核蛋白接近的第一可检测信号；以及使切片与一组与第二二抗的第二标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与神经特征接近的第二可检测信号。在一些实施例中，该方法进一步包括在使切片与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触之后以及在使切片与能够结合神经特征的一抗接触之前，使样品中的免疫复合物变性。

在方法的一些中，切片在与一抗接触之前，与至少一种蛋白酶接触。在一些实施例中，该方法进一步包括使切片与至少一种磷酸酶接触。

在方法的一些中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗和能够结合神经特征的一抗来自同一宿主物种。

在方法的一些中，第一可检测信号和第二可检测信号是不同的。在一些实施例中，第一可检测信号为银染并且第二可检测信号为QM-Dabsyl或固红。

本文还提供了诊断受试者的PD的方法，所述方法包括：(a)从疑似患有PD的受试者获得包含至少一种神经特征的生物学样品；(b)通过使样品与抗PGP.5抗体接触并确定磷酸化的α-突触核蛋白与PGP9.5之间的共定位来检测磷酸化的α-突触核蛋白是否位于样品的神经特征内；以及(c)当肯定地确定在神经特征中存在磷酸化的α-突触核蛋白与PGP9.5之间的共定位时，诊断受试者患有PD。

本文还提供了诊断和治疗受试者的PD的方法，所述方法包括：(a)从疑似患有PD的受试者获得包含至少一种神经特征的生物学样品；(b)通过使样品与抗PGP.5抗体接触并确定磷酸化的α-突触核蛋白与PGP9.5之间的共定位来检测磷酸化的α-突触核蛋白是否位于样品的神经特征内；(c)当肯定地确定在神经特征中存在磷酸化的α-突触核蛋白与PGP9.5之间的共定位时，诊断受试者患有PD；以及(d)施用疗法以治疗诊断为患有PD的受试者的PD。

本文还提供了治疗诊断出患有PD的受试者的方法，其包括向受试者施用有效方案的α-突触核蛋白抗体，其中能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的抗体和能够结合神经特征的抗体已经显示出共定位在来自受试者的皮肤样品中的神经特征中。

本文还提供了治疗经确定患有PD的受试者的方法，其包括向受试者施用有效方案的α-突触核蛋白抗体，其中通过本文公开的方法中的任一项确定受试者患有PD。

在一些此类方法中，有效方案的α-突触核蛋白抗体包括选自由以下各项组成的组的α-突触核蛋白抗体：结合在α-突触核蛋白的残基1-20、α-突触核蛋白的残基1-10、α-突触核蛋白的残基4-15、α-突触核蛋白的残基91-99、α-突触核蛋白的残基117-123、α-突触核蛋白的残基118-126内的单克隆抗体，普拉辛珠单抗(PRX002)，具有抗体克隆1H7(ATCC登录号PTA-8220)的CDR的人源化抗体，具有抗体克隆9E4(ATCC登录号PTA-8221)的CDR、抗体克隆NI-202.21D11的CDR和抗体克隆NI-202.12F4的CDR的人源化抗体，例如，在美国专利号8,092,801、8,609,820、8,790,644、8,940,276、9,580,493中公开的α-突触核蛋白抗体，其全文以引用方式并入本文。一些此类抗体包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO:49的残基31-35，VHCDR2，其包含SEQ ID NO:49的残基50-68，VH CDR3，其包含SEQ ID NO:49的残基101-102，VLCDR1，其包含SEQ ID NO:50的残基23-33，VL CDR2，其包含SEQ ID NO:50的残基49-55，以及VL CDR3，其包含SEQ ID NO:50的残基88-98。一些此类抗体包含VH CDR1，其包含SEQ IDNO:51，VH CDR2，其包含SEQ ID NO:52，VH CDR3，其包含SEQ ID NO:53，VL CDR1，其包含SEQID NO:54，VL CDR2，其包含SEQ ID NO:55，以及VL CDR3，其包含SEQ ID NO:56。一些此类抗体包含重链，其包含SEQ ID NO:57，和轻链，其包含SEQ ID NO:58。

在一些此类方法中，抗体是普拉辛珠单抗(PRX002)。在一些此类方法中，抗体包含三个轻CDR，其分别命名为SEQ ID NO:18-20，和三个重链CDR，其分别命名为SEQ ID NO:22-24。在一些此类方法中，抗体包含一个轻链，其命名为SEQ ID NO:17，和一个重链，其命名为SEQ ID NO:21

在一些此类方法中，抗体为9E4，如在美国专利第8,609,820号中公开的，其全文以引用方式并入本文。在一些此类方法中，抗体包含三个轻CDR，其分别命名为SEQ ID NO:26-28，和三个重链CDR，其分别命名为SEQ ID NO:30-32。在一些此类方法中，抗体包含一个轻链，其命名为SEQ ID NO:25，和一个重链，其命名为SEQ ID NO:29。

在一些此类方法中，抗体为NI-202.21D11。在一些此类方法中，抗体包含三个轻CDR，其分别命名为SEQ ID NO:34-36，和三个重链CDR，其分别命名为SEQ ID NO:38-40。在一些此类方法中，抗体包含轻链可变区，其命名为SEQ ID NO:33，和重链可变区，其命名为SEQ ID NO:37。

在一些此类方法中，抗体为NI-202.12F4。在一些此类方法中，抗体包含轻重CDR，其分别命名为SEQ ID NO:42-44，和三个重链CDR，其分别命名为SEQ ID NO:46-48。在一些此类方法中，抗体包含轻链可变区，其命名为SEQ ID NO:41，和重链可变区，其命名为SEQID NO:45。

本文还提供了用于检测磷酸化的α-突触核蛋白的方法，该方法包括：使生物学样品与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触；以及检测能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗。在方法的一些中，样品在与所述能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触之前，与至少一种蛋白酶接触。在一些方法中，该方法进一步包括使样品与至少一种磷酸酶接触。在一些方法中，检测包括组织化学分析。在一些方法中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗检测在残基S129处磷酸化的α-突触核蛋白。在某些方法中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗为7E2抗体克隆或3G2抗体克隆。在一些方法中，样品是固定的。在某些方法中，样品是福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)样品。在一些方法中，样品是冷冻样品

在一些方法中，该方法进一步包括使样品与第一二抗接触，第一二抗具有与其缀合的第一标记，其中第一二抗与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗具有免疫反应性。在一些方法中，该方法包括使样品与一组与第一二抗的第一标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与磷酸化的α-突触核蛋白接近的第一可检测信号。

附图说明

专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有一幅或多幅彩图的本专利或专利申请公布的拷贝。

图1A示出了使用抗α-突触核蛋白抗体和所示的浓度(MJF-R13(8-8)上图；P-syn/81A中图；5H5下图)在来自患有PD的受试者的脑组织中的在S129处磷酸化的α-突触核蛋白的示例性染色。

图1B示出了使用抗磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体和所示的浓度(2G11上图；7E2中图；3G2下图)在来自患有PD的受试者的脑组织中的示例性染色。

图1C示出了使用抗磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体和所示的浓度(11A5上图；pSyn#64(WAKO)下图)在来自患有PD的受试者的脑组织中的示例性染色。

图2A示出了在非PD受试者的脑组织中没有抗原修复的3G2和7E2磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体未观察到染色(7E2中图(0.08μg/mL)；3G2下图(0.08μg/mL))。上图显示了通过抗体5C12(0.5μg/ml)染色的总α-突触核蛋白。没有蛋白酶或磷酸酶处理。以10x放大率拍摄图像。将抗体在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释。

图2B示出了在非PD受试者的脑组织中没有抗原修复的3G2和7E2磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体未观察到染色(7E2中图(0.08μg/mL)；3G2下图(0.08μg/mL))。上图显示了通过抗体5C12(0.5μg/ml)染色的总α-突触核蛋白。没有蛋白酶或磷酸酶处理。以10x放大率拍摄图像。将抗体在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释。

图3A示出了在磷酸酶处理后不存在抗原修复(细胞调节)后(下图)，在具有抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体的非PD脑组织中非常微弱的胞质染色(上图)。碱性磷酸酶处理为50μg/mL 2小时。

图3B示出了在磷酸酶处理后不存在抗原修复(细胞调节)后(下图)，在具有抗磷酸化的S129α-突触核蛋白3G2抗体的非PD脑组织中非常微弱的胞质染色(上图)。碱性磷酸酶处理为50μg/mL 2小时。

图4A示出了通过碱性磷酸酶处理(下图；50μg/mL，2小时)重度降低了来自患有PD的受试者的皮质脑组织中的MJF-R13(8-8)抗体对路易体的染色。以10x放大率拍摄图像。将MJF-R13(8-8)抗体(0.4μg/mL)在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释。

图4B示出了通过碱性磷酸酶处理(下图；50μg/mL，2小时)重度降低了来自患有PD的受试者的皮质脑组织中的81A抗体对路易体的染色。以10x放大率拍摄图像。将81A抗体(2.0μg/mL)在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释。

图4C示出了通过碱性磷酸酶处理(下图；50μg/mL，2小时)中度降低了来自患有PD的受试者的皮质脑组织中的11A5抗体对路易体的染色。以10x放大率拍摄图像。将11A5抗体(0.4μg/mL)在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释。

图4D示出了通过碱性磷酸酶处理(下图；50μg/mL，2小时)中度降低了来自患有PD的受试者的皮质脑组织中的7E2抗体对路易体的染色。以10x放大率拍摄图像。将7E2抗体(0.08μg/mL)在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释。

图4E示出了通过碱性磷酸酶处理(下图；50μg/mL，2小时)中度降低了来自患有PD的受试者的皮质脑组织中的3G2抗体对路易体的染色。以10x放大率拍摄图像。将3G2抗体(0.08μg/mL)在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释。

图5A示出了蛋白酶处理(

图5B示出了蛋白酶处理(

图5C示出了蛋白酶处理(

图6示出了，在不存在蛋白酶处理的情况下，磷酸化特异性α-突触核蛋白抗体7E2(中图)和3G2(下图)在来自患有PD的受试者的脑组织中产生的染色样式与蛋白酶处理后的总α-突触核蛋白抗体5C12(上图)相同。以10x放大率拍摄图像。所有抗体均在DISCOVERYGoat Ig Block中稀释(5C12抗体以0.5μg/mL；7E2抗体以0.08μg/mL以及3G2抗体以0.08μg/mL)。

图7A示出了在不存在基于蛋白酶的抗原修复的情况下，抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体(下图)在来自患有PD的受试者中的皮肤切片中检测到聚集的α-突触核蛋白，类似于使用抗总α-突触核蛋白5C12抗体(上图)与

图7B示出了在不存在基于蛋白酶的抗原修复的情况下，抗磷酸化的S129α-突触核蛋白11A5抗体(上图)和3G2抗体在来自患有PD的受试者中的皮肤切片中检测到聚集的α-突触核蛋白，类似于使用抗总α-突触核蛋白5C12抗体(图7A上图)与

图7C示出了在不存在基于蛋白酶的抗原修复的情况下，抗磷酸化S129α-突触核蛋白MJF-R13抗体(上图)和P-Syn/81A抗体在来自患有PD的受试者中的皮肤切片中检测到聚集的α-突触核蛋白，类似于使用抗总α-突触核蛋白5C12抗体(图7A上图)与

图8A示出了DISCOVERY Goat Ig Block产生最小的背景，同时保留了PD样品中抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体(1.0μg/mL)的染色强度。在上图中以10x放大率并且在下图中以40x放大率拍摄图像。上图和下图中的图像来自同一组织切片的不同视野。

图8B示出了90103稀释剂产生最小的背景，同时保留了PD样品中抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体(1.0μg/mL)的染色强度。在上图中以10x放大率并且在下图中以40x放大率拍摄图像。上图和下图中的图像来自同一组织切片的不同视野。

图9示出了测试抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体在标示浓度1.0μg/mL之上和之下的结果(保护带实验)，其中以每张载玻片染色的神经特征百分比的形式执行定量测量。对于该实验，在抗体应用和生色团检测之前，未用蛋白酶或磷酸酶处理组织切片。用以0.5μg/mL、0.75μg/mL、1.0μg/mL、1.25μg/mL和1.5μg/mL在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释的抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体对来自患有PD的受试者的皮肤组织进行染色，表示抗体浓度在1.0μg/mL标示值附近+/-50％变化的情况下染色牢固。

图10A示出了抗PGP9.5抗体EPR4118(0.2μg/mL)染色来自正常受试者(非PD受试者)的皮肤样品中的神经特征。

图10B示出了抗PGP9.5抗体13C4/I3C4(0.2μg/mL)染色来自正常受试者(非PD受试者)的皮肤样品中的神经特征。

图10C示出了通过Cell Marque的多克隆抗PGP9.5抗体(1.0μg/mL；

图11A示出了来自非PD受试者的新鲜切割的组织载玻片中的胶原纤维的强烈背景染色(约24-48小时)。使用0.1μg/mL的抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体和VENTANAOptiView DAB IHC检测试剂盒执行染色。组织切片未进行CC1抗原修复处理。当未应用抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体和OptiView HQ接头时，可获得类似的结果(数据未显示)，证明通过OptiView多聚体产生了胶原背景染色。

图11B示出了切割载玻片后约5个月染色的来自非PD受试者的组织载玻片中胶原纤维的最小背景染色。

图12A示出了可以在来自非PD受试者的组织载玻片中用蛋白酶通过抗原修复加剧组织载玻片中胶原纤维的背景染色。将组织用在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释的抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体(0.1μg/mL)测试。

图12B示出了可以在来自非PD受试者的组织载玻片中通过CC1抗原修复减少组织载玻片中胶原纤维的背景染色。将组织与在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释的抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体(1.0μg/mL)在VENTANA BenchMark ULTRA自动染色仪上一起孵育，而无需事先用CC1进行抗原修复(上图)或无需在使用CC1在100℃进行抗原修复48分钟后(下图)。

图13示出了在PD皮肤(上图)和对照皮肤(下图)样品中，与OptiView DAB IHC检测试剂盒(左图)相比，ultraView Universal DAB检测试剂盒(右图)导致PGP9.5的染色强度较低。OptiView检测：HQ接头+HRP多聚体。ultraView检测：抗Rb/Ms HRP多聚体。将组织样品在100℃用CC1预处理32分钟，并将PGP9.5 EPR4118抗体(0.5μg/mL)在DISCOVERY Goat IgBlock中稀释。以40x放大率拍摄图像。

图14示出了用ultraView Universal DAB检测试剂盒进行的扩增过程导致PD皮肤(上图)和对照皮肤(下图)样品中非特异性背景染色的增加。扩增：Ms抗Rb，随后是Rb抗MsIgG。ultraView检测：抗Rb/Ms HRP多聚体。将抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体(1.0μg/mL)在DISCOVERY Goat Ig Block中稀释。未用CC1或蛋白酶进行预处理。以40x放大率拍摄图像。

图15示出了ultraView SISH DNP检测试剂盒(上图)和DISCOVERY Purple试剂盒(中图和下图)都可以检测到来自患有PD的受试者的皮肤样品中聚集的抗磷酸化的S129α-突触核蛋白，其中当与山羊抗兔HRP缀合物染色沉积一起使用时几乎没有背景。磷酸化的S129α-突触核蛋白被染成黑色(银染)或紫色(TAMRA)。抗磷酸化的S129α-突触核蛋白7E2抗体以1.0μg/mL在DISCOVERY Goat Ig Block中。检测：具有银(上图)或TAMRA(中图)的山羊抗兔HRP，或具有TAMRA的OptiView(HQ缀合的山羊抗兔抗体/抗HQ-HRP，下图)。在DISCOVERYGoat Ig Block中0.5μg/mL的PGP9.5抗体EPR4118染成黄色。检测：具有Dabsyl的山羊抗兔-AP(黄色)。未用CC1或蛋白酶进行预处理。

图16示出了通过抗磷酸化的α-突触核蛋白7E2抗体和ultraView SISH DNP检测试剂盒在皮肤神经特征中沉积的黑色银染提供了使用EPR4118抗体和

图17A示出了来自患有PD的受试者的皮肤样品中大血管的神经特征中的磷酸化的S129α-突触核蛋白(黑色/银染)和PGP9.5(黄色)的免疫组织化学检测。

图17B示出了来自患有PD的受试者的皮肤样品中小神经束的神经特征中的磷酸化的S129α-突触核蛋白(黑色/银染)和PGP9.5(黄色)的免疫组织化学检测。

图17C示出了来自患有PD的受试者的皮肤样品中外泌汗腺的神经特征中的磷酸化的S129α-突触核蛋白(黑色/银染)和PGP9.5(黄色)的免疫组织化学检测。

图17D示出了来自患有PD的受试者的皮肤样品中大神经束的神经特征中的磷酸化的S129α-突触核蛋白(黑色/银染)和PGP9.5(黄色)的免疫组织化学检测。

图17E示出了来自患有PD的受试者的皮肤样品中竖毛肌的神经特征中的磷酸化的S129α-突触核蛋白(黑色/银染)和PGP9.5(黄色)的免疫组织化学检测。

图18示出了可以在来自非PD对照受试者(上图)和PD受试者(下图)的皮肤神经束中观察到的弥散性粒状和离散类型的银磷酸化的S129α-突触核蛋白染色的实例。将头皮活检的切片使用磷酸化的S129α-突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定进行染色，无需蛋白酶或磷酸酶处理(方案1)。染成黄色的结构是表达PGP9.5的神经。

图19示出了粒状型磷酸化的S129α-突触核蛋白(上图)和髓鞘碱性蛋白(下图)之间的类似的周围神经元染色样式，这表明Schwann细胞中弥散性pS129α-突触核蛋白的潜在定位。

图20A示出了在未经CC1处理的情况下通过11A5抗体(0.4μg/mL)对磷酸化的S129α-突触核蛋白的染色(上图)，在100℃用ULTRA CC1处理32分钟(下图)后减少。

图20B示出了在未经CC1处理的情况下通过7E2抗体(0.08μg/mL)对磷酸化的S129α-突触核蛋白的染色(上图)，在100℃用ULTRA CC1处理32分钟(下图)后减少。

图20C示出了在未经CC1处理的情况下通过3G2抗体(0.08μg/mL)对磷酸化的S129α-突触核蛋白的染色(上图)，在100℃用ULTRA CC1处理32分钟(下图)后减少。

图20D示出了在未经CC1处理的情况下通过MJF-R13抗体(0.4μg/mL)对磷酸化的S129α-突触核蛋白的染色(上图)，在100℃用ULTRA CC1处理32分钟(下图)后减少。

图20E示出了在未经CC1处理的情况下通过P-Syn/81A抗体(2.0μg/mL)对磷酸化的S129α-突触核蛋白的染色(上图)，在100℃用ULTRA CC1处理32分钟后减少(下图)。

图21A示出了用

图21B示出了用

图22示出了与不进行蛋白酶处理(上图)相比，蛋白酶3处理4分钟(中图)或12分钟(下图)对使用来自患有PD的受试者的皮肤中磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体的染色的作用。磷酸化的S129α-突触核蛋白染成黑色。7E2抗体克隆以1.0μg/mL在DISCOVERY Goat IgBlock中(检测：具有银的山羊抗兔HRP)。PGP9.5抗体EPR4118以0.5μg/mL在DISCOVERY GoatIg Block中染成黄色(检测：具有Dabsyl的山羊抗兔AP)。未用CC1或蛋白酶进行预处理。

图23A示出了在pH9下碱性磷酸酶(来自NEB的纯化的小牛肠碱性磷酸酶)预处理8分钟(下图)去除了弥散性粒状磷酸化的α-突触核蛋白染色，而不会影响通常在未经碱性磷酸酶处理的组织中观察到的致密离散型染色(上图)。

图23B示出了在pH9下碱性磷酸酶(来自NEB的纯化的小牛肠碱性磷酸酶)预处理24分钟(上图)或40分钟(下图)去除了弥散性粒状磷酸化的α-突触核蛋白染色，而不会影响通常在未经碱性磷酸酶处理的组织中观察到的致密离散型染色。

图24示出了与未进行AP处理(上图)或在pH10下进行AP处理(中图)相比，碱性磷酸酶(来自Roche的重组碱性磷酸酶；30μg/mL)在pH8下处理8分钟导致离散磷酸化的S129α-突触核蛋白的染色减少(下图)。

图25示出了用碱性磷酸酶预处理，随后蛋白酶3消除了弥散性粒状磷酸化的α-突触核蛋白染色，而没有显著的致密离散染色损失。

图26示出了随着使用ULTRA CC1本体溶液的抗原修复时间的延长(0分钟–上图；16分钟–中图；或64分钟–下图)，使用EPR4118抗体(1.0μg/mL)进行的PGP9.5检测得以增强。

图27示出了在100℃用ULTRA CC2进行抗原修复16分钟产生了使用EPR4118抗体的PGP9.5染色的增强。

图28示出了用于同时检测皮肤样品中帕金森氏病表征的α-突触核蛋白(aSyn)和PGP9.5的两种方案的概述。

图29示出了个体值图，其示出了来自患有PD的受试者和正常的非PD受试者的头皮活检的4μm切片中含有磷酸化的S129α-突触核蛋白染色的神经特征的百分比。用两种不同的磷酸化的S129α-突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定方案对15个PD和9个非PD对照头皮皮肤样品同期群进行染色：没有Ree(方案1)和具有(方案2)蛋白酶/磷酸酶。

图30A示出了个体值图，其示出了来自患有PD的受试者和正常的非PD受试者的头皮活检的4μm切片中具有离散型磷酸化的S129α-突触核蛋白染色的神经特征的百分比。用磷酸化的S129α-突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定方案(没有蛋白酶/磷酸酶(方案1)和具有蛋白酶/磷酸酶(方案2))以及还有使用由pRED/Prothena开发的蛋白酶抗性α-突触核蛋白DAB IHC测定对15个PD和7个非PD对照头皮样品同期群进行染色。

图30B示出了个体值图，其示出了来自患有PD的受试者和正常的非PD受试者的头皮活检的4μm切片中具有弥散性粒状磷酸化的S129α-突触核蛋白染色的神经特征的百分比。用磷酸化的S129α-突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定方案(没有蛋白酶/磷酸酶(方案1)和具有蛋白酶/磷酸酶(方案2))以及还有使用由pRED/Prothena开发的蛋白酶抗性α-突触核蛋白DAB IHC测定对15个PD和7个非PD对照头皮样品同期群进行染色。

图31示出了个体值图，其示出了来自患有PD的受试者和正常的非PD受试者的腹部皮肤活检的4μm切片中含有磷酸化的S129α-突触核蛋白染色的神经特征的百分比。用两种不同的磷酸化的S129α-突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定方案对20个PD和20个非PD对照腹部皮肤活检样品同期群进行染色：没有(方案1)和具有(方案2)蛋白酶/磷酸酶。

图32A示出了与方案2(下图)相比，通过方案1(上图)对正常结肠组织染色的差异。比例尺为50μm。

图32B示出了与方案2(下图)相比，通过方案1(上图)对正常结肠组织染色的差异。比例尺为50μm。

图33A示出了使用方案2来自患有PD的受试者的颌下腺组织的示例性染色。以10x放大率拍摄图像。

图33B示出了使用方案2来自患有PD的受试者的乙状结肠组织的示例性染色。以20x放大率拍摄图像。

图33C示出了使用方案2来自患有PD的受试者的头皮组织的示例性染色。以20x放大率拍摄图像。

图34示出了在儿童皮肤组织中，方案1(P1；上图)生成了具有离散形态的重磷酸化的α-突触核蛋白银染色，所述离散形态在方案2的情况下不存在(P2；下图)。

具体实施方式

本公开内容涉及在原本无法诊断患有PD的受试者，以及处于患有帕金森氏病风险的或疑似患有帕金森氏病的受试者中，用于准确地和明确地确定患有帕金森氏病(PD)的方法和组合物。该方法和组合物还可用于排除患有运动障碍(有时与帕金森氏病样症状相关)的患者的帕金森氏病，帕金森氏病样症状包括但不限于：进行性核上性麻痹、多系统萎缩、病毒性帕金森病、原发性震颤、药物或毒素诱发的帕金森病、创伤后帕金森病、动脉硬化性帕金森病、关岛的帕金森-痴呆综合症、皮质基底神经节变性或正常压力脑积水。所公开的方法包括使来自受试者的包括至少一个神经特征的生物学样品与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触。通过检测能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗是否位于样品的神经特征内，可以确定活体受试者是否患有PD。受试者可以包括PD的症状发作前患者和当前无法常规准确诊断PD的处于疾病早期的患者。此外，验尸后分析可以用死后收集的生物学样品进行。

如本文所用，术语“生物学样品”包括可以通过本公开的方法和试剂盒测试的样品，并且包括人和动物体(固定的或冷冻的)、组织标本和固定细胞标本。术语“组织”是指在生物体内执行相似功能的相互连接的细胞的集合。生物学样品可以包括来自健康或表面健康的人受试者的样品，或来自受待诊断或治疗的病症或疾病(诸如，帕金森氏病)影响或疑似受其影响的人受试者的样品。生物学样品可以是从任何器官或组织(包括活检，例如肿瘤活检)获得的样品。同样，样品可以来自已故患者，诸如在尸检期间采集的样品。生物学样品也可以包括细胞学样品(在一些实例中，细胞学样品可以源自组织，诸如来自皮肤组织、结肠组织、颌下腺组织或脑的组织切片)。在其他实例中，样品可以是由从受试者获得的生物学样品制备的细胞或细胞沉淀。

在一些实例中，生物学样品可以包括正常或癌变组织，例如，皮肤组织(来自，例如，受试者的头皮、腹部或躯干)、结肠组织、颌下腺组织，脑组织、嗅球、肺组织、卵巢组织、胰腺组织、间皮组织、胃肠组织、头颈组织、乳腺组织、肝组织、肾脏组织、前列腺组织、子宫组织、脑脊液(或从脑脊液中分离的细胞和/或神经特征)、骨、肺细胞、卵巢细胞、胰腺细胞或间皮细胞、结肠细胞、头颈细胞、乳腺细胞、肝细胞、肾细胞、皮肤细胞、前列腺细胞、子宫细胞、骨细胞、脑细胞和肺细胞。例如，来自皮肤、结肠、颌下腺、嗅球、肺、卵巢、肝、或胰腺或其他含有细胞材料的肿瘤的样品可以通过手术切除全部或部分肿瘤，通过收集细的针状脑活检、来自肿瘤的细针抽吸物或穿刺活检，以及本领域中已知的其他方法来获得。

如本文所用，术语“神经特征”是指已知被神经支配的神经细胞和组织结构。例如，神经特征可以是神经细胞的一部分、神经细胞、前驱神经细胞的一部分、前驱神经细胞或神经细胞和前驱神经细胞两者和/或其部分。在方法的一些中，神经特征与神经细胞相邻，例如前驱神经细胞与健康神经细胞相邻。其他类型的神经特征包括已知被神经支配的组织结构，包括但不限于：广泛分布在真皮中的无髓或薄髓表皮内神经纤维；使自主结构受神经支配的肾上腺素能、去甲肾上腺素能、胆碱能交感纤维或血管扩张性肽能纤维，包括但不限于汗腺、毛囊、竖毛肌和血管。在一些方法中，神经特征可包含前驱神经细胞或坏死或凋亡的神经细胞的组分。

在本公开的上下文中，术语“一抗”是指抗体结合剂，例如，完整的抗体分子，所述分子的片段或衍生物(例如，包含抗体或聚合抗体的缀合物)，其与“靶标”(例如，磷酸化的α-突触核蛋白或神经特征的组分)特异性结合，更具体地与样品的靶标的单个单元(例如，靶分子的表位)特异性结合。在本文公开方法的一些中，一抗可以是能够结合在残基S129处磷酸化的α-突触核蛋白(pS129 aSyn)的抗体。在本文公开方法的一些中，一抗可以是能够结合神经特征组分的抗体。在以下公开中，一抗在“抗体”标题下有更详细的描述

为了检测一抗是否位于神经特征内，将样品与抗体接触，并检查样品中抗体的存在。例如，当将一抗用可检测标记物标记时，可以完成一抗定位的确定。样品中标记物检测对应于神经特征内抗体定位。

本文公开的方法中的一些进一步包括使来自受试者的生物学样品与能够结合神经特征内除磷酸化的α-突触核蛋白以外的蛋白的第二一抗接触。第二一抗的使用允许确定第一一抗和第二一抗在神经特征内的定位。根据检测神经特征内两种抗体的共定位，可以准确和明确地确定PD的确定。

第二一抗可以，例如，选自能够结合作为神经特征组成的蛋白的抗体，并且例如可以选自以下项之一：泛素C末端水解酶L1(PGP9.5、UCHL1、NDGOA；PARK5；PGP95；SPG79；Uch-L1；HEL-117；PGP9.5；HEL-S-53)、RNA结合的fox-1同源物3(RBFOX3、FOX3、NEUN、FOX-3、HRNBP3)、微管相关蛋白2(MAP2、MAP2A、MAP2B、MAP2C)、160kDa神经丝中链(NEFM、NFM、NEF3、NF-M)、200kDa神经丝重链(NEFH、NFH、CMT2CC)、突触素(SYP、MRX96、MRXSYP)和discs largeMAGUK支架蛋白4(DLG4、DLGH4、PSD-95、PSD95、SAP-90、SAP90、SAP90A)。

在本文公开方法的一些中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗和能够结合神经特征的一抗来自同一宿主物种，并且宿主物种可以为小鼠或兔。在一些方法中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗和能够结合神经特征的一抗来自不同宿主物种，诸如小鼠或兔。

术语“定位”和“共定位”是指一个或多个靶蛋白在同一神经特征内的位置。在一些方法中，当在神经特征中鉴定出独立指示蛋白的信号时，当与信号各自的背景进行比较时，确定神经特征内蛋白的共定位。指示位于神经特征之外的肽的信号并不指示定位于神经特征内的蛋白。作为一个实例，指示定位于神经特征中的磷酸化的α-突触核蛋白的信号是比背景信号高一个、两个、三个或四个标准差，或者比背景信号高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的信号。

用于确定抗体的定位和共定位的方法包括，例如，组织化学分析。如本文所用，术语“免疫组织化学”或“IHC”是指通过检测在样品内抗原与特定结合剂，诸如抗体的相互作用来确定抗原在固定或冷冻样品中的存在或分布的方法。因此，本公开提供了用于通过使用来自疑似患有PD的受试者的生物学样品的固定或冷冻切片来确定受试者是否患有帕金森氏病(PD)的方法。当磷酸化的α-突触核蛋白定位于神经特征内时，可以检测到定位于切片中的神经特征内的磷酸化的α-突触核蛋白，并且可以诊断该受试者患有PD。本公开的方法包括使切片与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的第一一抗接触。该方法还可以包括使切片与能够结合神经特征的第二一抗接触。

本文公开的方法中的一些还可以包括自动组织化学染色平台，诸如自动IHC/ISH载玻片染色器。自动IHC/ISH载玻片染色器通常至少包括：染色方案中使用的各种试剂的储液器、与储液器流体连通的用于将试剂分配到载玻片上的试剂分配单元、用于从载玻片上去除使用的试剂或其他废物的废物清除系统，以及用于协调试剂分配单元和废物清除系统的动作的控制系统。除了执行染色步骤外，许多自动载玻片染色器还可以执行染色辅助步骤(或与执行此类辅助步骤的单独系统兼容)，包括：载玻片烘烤(用于将样品粘附到载玻片上)、脱蜡(也称为脱石蜡)、抗原修复、复染、脱水和清除以及盖玻。Prichard,Overview ofAutomated Immunohistochemistry,Arch Pathol Lab Med.，第138卷，第1578–1582页(2014)(其全文以引用方式并入本文)描述了自动IHC/ISH载玻片染色器的几个特定实例及其各种特征，包括intelliPATH

抗体结合的检测

在本文公开方法的一些中，步骤(a)进一步包括使样品与第一二抗接触，第一二抗具有与其缀合的第一标记，其中第一二抗与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗具有免疫反应性。在本文公开方法的一些中，该方法包括使样品与一组与第一二抗的第一标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与磷酸化的α-突触核蛋白接近的第一可检测信号。

在本文公开方法的一些中，该方法进一步包括使样品与第二二抗接触，第二二抗具有与其缀合的可检测第二标记，其中第二二抗与能够结合神经特征的一抗具有免疫反应性。在本文公开方法的一些中，该方法包括使样品与一组与第二二抗的第二标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与神经特征接近的第二可检测信号。在本文公开方法的一些中，第一可检测信号和第二可检测信号是不同的。在本文公开的某些方法中，第一可检测信号为银染并且第二可检测信号为QM-Dabsyl或固红。

在本公开的上下文中，术语“二抗”是指抗体结合剂，例如，完整的抗体分子，所述分子的片段或衍生物(例如，包含抗体或聚合抗体的缀合物)，其具有与靶抗原结合的一抗特异性结合的抗原结合结构域。由于多个二抗与一抗结合，二抗可以帮助提高灵敏度和信号扩增。在一些实施例中，二抗可以与酶，诸如，辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)；或荧光染料，诸如，异硫氰酸荧光素(FITC)，若丹明衍生物，Alexa Fluor染料；或用于各种应用的其他分子缀合。

在本文公开方法的一些中，样品在与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触之前，与至少一种蛋白酶接触。在本文公开的某些方法中，该方法进一步包括使样品与至少一种磷酸酶接触。在方法的一些中，样品与蛋白酶和磷酸酶接触。蛋白酶或蛋白酶和磷酸酶的使用可以根据以下方法，其中PD的确定独立使用第一一抗来完成，或者其中确定是通过使用第一一抗和第二一抗来完成的。在本文公开的方法的一些中，磷酸酶的使用通过去除在未患有帕金森氏病的受试者中常见的磷酸化的α-突触核蛋白，增强了对患有帕金森氏病的受试者独特的磷酸化的α-突触核蛋白的检测。蛋白酶的使用通过改善磷酸化的α-突触核蛋白对一抗的可及性而增强了磷酸化的α-突触核蛋白的检测。

在本文公开方法的一些中，在使样品与能够结合神经特征的一抗接触之前，该方法包括例如通过在100℃孵育样品至少15分钟来使样品中的免疫复合物变性。在某些方法中，变性可在约80℃至至少约110℃进行约5分钟至至少约60分钟。例如，变性可在约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、约105℃或约110℃进行至少约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、或约48分钟、或约50分钟、或约55分钟或至少约60分钟。

如本文所用，术语“蛋白酶”或“肽酶”或“蛋白水解酶”是指通过肽键的水解进行蛋白水解或蛋白分解代谢的酶。蛋白酶可根据催化残基分为七个大类。例如，丝氨酸蛋白酶(使用丝氨酸醇)、半胱氨酸蛋白酶(使用半胱氨酸硫醇)、苏氨酸蛋白酶(使用苏氨酸仲醇)、天冬氨酸蛋白酶(使用天冬氨酸羧酸)、谷氨酸蛋白酶(使用谷氨酸羧酸)、金属蛋白酶(使用金属，通常是锌)和天冬酰胺肽裂解酶(使用天冬酰胺以执行消除反应)。蛋白酶的实例包括但不限于：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、肠激酶、胞内蛋白酶GluC、蛋白水解酶K、凝血酶、Xa因子、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶(例如，碱性VIII蛋白酶)、木瓜蛋白酶、胶原酶、分散酶、胃蛋白酶、组织蛋白酶D和羧肽酶A。可商购的蛋白酶的实例包括但不限于：

如本文所用，术语“磷酸酶”是指使用水将磷酸单酯裂解成磷酸根离子和醇的酶(磷酸酶将磷酸基团从分子中去除)。磷酸酶的实例可以包括但不限于：碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、磷蛋白磷酸酶1(PP1)、磷蛋白磷酸酶2A(PP2A)、磷蛋白磷酸酶2B(PP2B)、磷蛋白磷酸酶2C(PP2C)和λ蛋白磷酸酶。可商购的磷酸酶的实例包括但不限于：来自毕赤酵母(Pichiapastoris)的牛碱性磷酸酶(Roche P/N 3359123001)。磷酸酶的孵育时间可以由本领域技术人员确定，但是孵育时间可以在从约5分钟到至少约12小时的范围内，并且温度可以在从约20℃到至少约50℃的范围内。例如，约8分钟、约9分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、或至少约12小时，在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约30℃、在约36℃、在约37℃、在约38℃、在约39℃或至少约40℃。在某些实例中，孵育可以在约36℃持续约2小时，或在约37℃持续约10分钟，或在约37℃持续约60分钟，或在约37℃持续约45分钟，或在约37℃持续约60分钟。

在本文公开方法的一些中，孵育时间会有所不同，并且取决于孵育温度。用于基本上完整的抗体结合、显色和该方法的其他步骤的孵育期是众所周知的。许多步骤，例如，抗原暴露、抗体结合和显色在至少约35℃，优选地约40℃至约45℃或高达100℃的高温进行，持续约4分钟至约90分钟的时间。例如，在某些方法中，可以将一抗与样品在36℃孵育32分钟，或者它们也可以在约22℃孵育20分钟。在另一个实例中，可以将蛋白酶与样品在36℃孵育12分钟，或者可以将蛋白酶与样品在36℃孵育4分钟。在又另一个实例中，抗原暴露可以在至少在约100℃执行约30-90分钟。然而，如果适当延长孵育时间，则除了取决于酶活性的步骤(抗原暴露和显色)外，大多数步骤都可以在低至4℃的温度下执行。

当抗体染色试剂对需要暴露的抗原具有特异性时，可以在添加一抗之前用蛋白水解酶或蛋白酶处理组织切片。可以将蛋白水解酶或蛋白酶加入覆盖组织切片的蒸发抑制剂液体中，并通过蒸发抑制剂液体下沉到下面的组织切片中。经过足够长的孵育时间来进行抗原暴露，例如约4分钟至约30分钟，可以洗涤载玻片，并可以重新施加蒸发抑制剂液体。

在方法的一些中，在抗体应用之前，可以将足以覆盖组织切片的足够量的蛋白酶溶液(通常约100-200μL)应用于石蜡包埋、福尔马林固定的组织。用蛋白酶的处理可以帮助将抗原暴露于标记试剂，从而获得更准确的结果。在方法的一些中，孵育期足以破坏交联，但不至于那么长而破坏抗原。时间段取决于温度、酶浓度、组织厚度、组织类型和在福尔马林中时间的长短。本领域技术人员可以容易地确定适当的时间。例如，约在36℃持续约4分钟，或在约40℃持续约4分钟，或在约40℃持续约4分钟30秒，或在约40℃持续约5分钟，或在约36℃持续约12分钟可以是有效的。在孵育后，可以将蛋白酶溶液洗掉，并且在染色/标记过程中使用下一种试剂。当未观察到这些范围时，很可能会发生蛋白酶对组织的过度和/或不足消化，这可能分别导致破坏的抗原/被掩盖的抗原。在孵育后，可以冲洗载玻片。

抗体

如本文所用，术语“抗体”是指至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其特异性识别并结合抗原的表位。抗体至少包括轻链或重链免疫球蛋白可变区或免疫球蛋白样分子(举例而言包括但不限于，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们的组合以及在任何脊椎动物，例如，哺乳动物诸如人、山羊、兔和小鼠的免疫应答期间产生的类似分子)以及非哺乳动物物种，诸如鲨鱼免疫球蛋白。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或抗体的片段以及本领域中已知的其他抗体。在一些实例中，将抗体用可检测标记物(诸如酶或荧光团)标记。抗体还包括与目标分子(或一组高度相似的目标分子)特异性结合从而基本上排除了与其他分子的结合的抗体片段。

术语“抗体”还包括天然存在抗体或重组抗体的抗原结合片段。术语抗体内涵盖的结合片段的非限制性实例包括Fab、(Fab')

抗体和抗体结合片段对目标分子(即，磷酸化的α-突触核蛋白和神经特征内源性蛋白)具有比生物学样品中其他分子的结合常数大至少10

抗体由重链和轻链组成，重链和轻链各自均具有可变区，称为可变重链(V

CDR主要负责与抗原表位的结合。每个链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次编号，并且通常也通过特定CDR所位于的链来鉴定。因此，V

已知几种针对α-突触核蛋白(也称为SNCA、PD1、NACP、PARK1、PARK4、aSyn)和磷酸化的α-突触核蛋白的抗体。α-突触核蛋白是突触核蛋白家族的成员，其也包括β-和γ-突触核蛋白。突触核蛋白在脑中表达，并且α-和β-突触核蛋白选择性地抑制磷脂酶D2。α-突触核蛋白可用于整合突触前信号传导和膜运输。α-突触核蛋白的突变与帕金森病的发病机理有关。α-突触核蛋白肽是患有阿尔茨海默氏病的患者脑中淀粉样斑块的主要组分。在某些方法中，可以检测磷酸化的α-突触核蛋白。α-突触核蛋白序列是可公开获得的，例如，可从GenBank

抗磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体的实例是兔单克隆抗体克隆7E2，其是通过Roche Diagnostics GmbH CPS R&D Early Development&Reagent Design(DXREAA)用与人的α-突触核蛋白残基122-135相对应的磷酸肽作为免疫原生成。7E2抗体或其抗原结合片段包含轻链(LC)可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列。7E2抗体或其抗原结合片段包含重链(HC)可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:05的氨基酸序列。

SEQ ID NO:01(7E2轻链)：

AQVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVYNNNNLVWYQQKPGQPPKQVIYKASKVASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGGYSGDIYTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC

SEQ ID NO:02 7E2 LC CDR1:QSVYNNNN

SEQ ID NO:03 7E2 LC CDR2:KASKVAS

SEQ ID NO:04 7E2 LC CDR3:LGGYSGDIYT

SEQ ID NO:05(7E2重链)：

CQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFTISSYHMSWVRQAPGKGLEWIGYISTSGNIYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLRMTSLTTEDTATYFCARLGIATGYSFWGHGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK

SEQ ID NO:06 7E2 HC CDR1:GFTISSYHMS

SEQ ID NO:07 7E2 HC CDR2:ISTSGNI

SEQ ID NO:08 7E2 HC CDR3:ARLGIATGYSF

在一些实施例中，提供了具有轻链可变区的抗体，所述轻链可变区的氨基酸序列与由SEQ ID NO:01表示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在进一步实施例中，提供了具有重链可变区的抗体，所述重链可变区的氨基酸序列与由SEQ ID NO:05表示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

抗磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体的另一个实例是兔单克隆抗体克隆3G2，其是通过Roche Diagnostics GmbH CPS R&D Early Development&Reagent Design(DXREAA)用与人α-突触核蛋白残基122-135相对应的磷酸肽作为免疫原生成。3G2抗体或其抗原结合片段包含轻链(LC)可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列。3G2抗体或其抗原结合片段包含重链(HC)可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

SEQ ID NO:09(3G2轻链)：

AQVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVYNNNNLVWFQKKPGQPPKQLIYKASKVASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGGYSGDIYTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC

SEQ ID NO:10 3G2 LC CDR1:QSVYNNNN

SEQ ID NO:11 3G2 LC CDR2:KASKVAS

SEQ ID NO:12 3G2 LC CDR3:LGGYSGDIYT

SEQ ID NO:13(3G2重链)：

QEQLKESGGGLVTPGGTLTLTCTASGFTISSYHMSWVRQAPGKGLEWIGYISTSGNIYYATWAKGRFTISKTSSTTVDLRMTSLTTEDTATYFCARLGIATGYSFWGHGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK

SEQ ID NO:14 3G2 HC CDR1:GFTISSYHMS

SEQ ID NO:15 3G2 HC CDR2:ISTSGNI

SEQ ID NO:16 3G2 HC CDR3:ARLGIATGYSF

在一些实施例中，提供了具有轻链可变区的抗体，所述轻链可变区的氨基酸序列与由SEQ ID NO:09表示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在进一步实施例中，提供了具有重链可变区的抗体，所述重链可变区的氨基酸序列与由SEQ ID NO:13表示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

本公开还提供了检测一种或多种蛋白的方法，该蛋白是神经特征的一部分，如本文所定义。可以通过能够结合选自以下项的蛋白的抗体来检测此类蛋白：泛素C末端水解酶L1(PGP9.5、UCHL1、NDGOA；PARK5；PGP95；SPG79；Uch-L1；HEL-117；PGP 9.5；HEL-S-53；和登录号NM_004181.4→NP_004172.2)、RNA结合的fox-1同源物3(RBFOX3、FOX3、NEUN、FOX-3、HRNBP3；和登录号NM_001082575.2→NP_001076044.1)、微管相关蛋白2(MAP2、MAP2A、MAP2B、MAP2C；和登录号NM_001039538.1→NP_001034627.1)、160kDa神经丝中链(NEFM、NFM、NEF3、NF-M；和登录号NM_005382.2→NP_005373.2)、200kDa神经丝重链(NEFH、NFH、CMT2CC；和登录号NM_021076.3→NP_066554.2)、突触素(SYP、MRX96、MRXSYP；和登录号NM_003179.2→NP_003170.1)或discs large MAGUK支架蛋白4(DLG4、DLGH4、PSD-95、PSD95、SAP-90、SAP90、SAP90A；和登录号NM_001365.4→NP_001356.1)。本领域普通技术人员可以鉴定另外的PGP9.5、RBFOX3、MAP2、NEFM、NEFH、SYP和DLG4核酸和蛋白序列，包括变体和异构体。用于检测PGP9.5、RBFOX3、MAP2、NEFM、NEFH、SYP和DLG4的抗体是本领域中已知的。例如，能够结合PGP9.5的抗体包括但不限于：来自兔的抗人的PGP9.5单克隆抗体(克隆EPR4118，P/N ab108986)或来自小鼠的抗人的PGP9.5单克隆抗体(克隆13C/I3C4，P/N ab8189)，可以从Abcam购买。具有RTD P/N 760-4434的兔多克隆抗体可以从Cell Marque

如本文所用，术语“接触”是指允许在两个或更多个部分之间缔合，特别是直接物理缔合，例如以固体形式和/或以液体形式的放置(例如，将生物学样品，诸如，固定在载玻片上的生物学样品，与抗原释放溶液接触的放置)。

如本文所用，术语“特异性结合”是指优先与定义的靶标结合的试剂的结合(诸如特异性抗原的抗体或特异性核酸序列的核酸探针)。靶标可以是确定或可以确定其存在、位置和/或浓度的任何分子。靶分子的实例包括蛋白和核酸。通常使用特异性结合分子和可检测标记物的一种或多种缀合物检测靶分子。关于抗原，“特异性结合”是指抗体或其他配体全部或部分地与特异性多肽的优先缔合。关于核酸序列，“特异性结合”是指核酸探针全部或部分地与特异性核酸序列的优先缔合。特异性结合剂基本上仅结合定义的靶标。公认的是，分子之间可能会发生小程度的非特异性相互作用，诸如特异性结合剂、以及非靶多肽或非靶核酸序列。尽管选择性反应性抗体结合抗原，但是它可以低亲和力结合。与非靶多肽相比，抗体与抗原特异性结合通常导致与靶多肽结合的抗体或其他配体的量(每单位时间)增加大于2倍，诸如大于5倍、10倍或大于100倍。多种免疫测定形式适合于选择与特定蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白发生特异性免疫反应的单克隆抗体。

在允许抗体-抗原结合的条件下，将包括抗原(诸如，靶抗原)的样品与抗体一起孵育。可以借助于与抗体缀合的可检测标记物(直接检测)或与针对一抗产生的二抗缀合的可检测标记物(例如，间接检测)来检测抗体-抗原结合。可检测标记物可以包括但不限于放射性同位素、荧光染料(诸如荧光素、异硫氰酸荧光素和若丹明)和显色分子。

如本文所用，术语“检测”是指确定试剂(诸如信号或特定抗原或蛋白)是否存在于或不存在于样品中。在一些实例中，这可以进一步包括量化。如本文所用，术语“检测”是指确定某种物质是否存在、或是否不存在，诸如确定靶分子是否存在于生物学样品中的任何方法。例如，检测可以包括使用视觉或机械装置来确定样品是否显示特定特性。在某些实例中，检测是指经视觉观察到探针与靶标结合，或观察到探针未与靶标结合。例如，对于在此所述的方法，光学显微镜和其他显微镜手段通常用于检测显色沉淀物。

标记物

如本文所用，“可检测标记物”是指可以产生指示样品中靶标的存在和/或浓度的可检测信号(诸如经视觉、经电子或其他方式)的分子或材料。当与特异性结合分子缀合时，可检测标记物可用于定位和/或定量特异性结合分子所针对的靶标。因此，可以通过检测由可检测标记物产生的信号来检测样品中靶标的存在和/或浓度。可以直接或间接地检测可检测标记物，并且可以组合使用与不同特异性结合分子缀合的几种不同的可检测标记物来检测一个或多个靶标。可以将可以分别检测的多个可检测标记物与特异性结合不同靶标的不同特异性结合分子缀合，以提供可以提供对样品中多个靶标的检测的多重测定。可检测信号可以通过任何已知或尚未发现的机制生成，包括光子(包括无线电频率、微波频率、红外频率、可见光频率和紫外线频率光子)的吸收、发射和/或散射。

可检测标记物可以包括有色的、荧光的、磷光的和发光的分子和材料，将一种物质转换为另一种物质以提供可检测差异的催化剂(诸如酶)(诸如通过将无色物质转换为有色物质，反之亦然，或通过产生沉淀或增加样品浊度)。可检测标记物的具体实例包括：酶，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶或β-葡萄糖醛酸苷酶；荧光团，诸如荧光素、发光团、香豆素、BODIPY染料、试卤灵和若丹明(荧光分子的许多其他实例可以在The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologie,Molecular Probes,Eugene,OR中找到)；纳米粒子，诸如量子点；金属螯合物，诸如放射性或顺磁性金属离子(如Gd

如本文所用，术语“生色团”是指能够转化为有色产物的物质，诸如色素或染料。某些生色团是电子供体，当被氧化时，会变成有色产物。有色产物的产生，或在化学转化时(诸如通过氧化)变得不溶的性质，使生色团可用于IHC。显色化合物的非限制性实例包括二氨基联苯胺(DAB)、4-氯-2-甲基-重氮苯正离子(固红)、硝基蓝四唑鎓(NBT)、AP橙色、四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-联氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、新品红、碘硝基四唑鎓(INT)、四唑蓝和四唑紫。更多生色团是本领域技术人员已知的，例如，4-硝基苯基磷酸酯(pNPP)、溴氯吲哚磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑鎓(NBT)、AP蓝、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸苷(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、品红、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝和四唑紫。DAB是一种生色团，其产生棕色终产物，该终产物高度不溶于乙醇和其他有机溶剂。DAB的氧化导致聚合，从而导致与四氧化锇反应的能力，因此增加了其染色强度和电子密度。

替代地，可以将酶在金相检测方案中使用。金相检测方法包括使用氧化还原酶(诸如辣根过氧化物酶)以及水溶性金属离子(例如，银或金)，氧化剂和还原剂，再次形成可检测沉淀物。在适当的条件下(即，添加标记酶)会将可溶性金属离子，诸如银(+1)或金(+3)还原为银或金原子，使得在明视野光学显微镜下，它可以作为对眼睛可见的特定点。

试剂盒

本公开还提供了试剂盒，其包含：能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗；和能够结合神经特征的一抗。在本文公开试剂盒的一些中，试剂盒进一步包含：(a)第一二抗，第一二抗具有与其缀合的第一标记，其中第一二抗与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗具有免疫反应性；(b)一组试剂，当其与第一二抗的第一标记反应时生成第一可检测信号；(c)第二二抗，第二二抗具有与其缀合的第二标记，其中第二二抗与能够结合神经特征的一抗具有免疫反应性；和(d)一组试剂，当其与第二二抗的第二标记反应时生成第二可检测信号；其中第一可检测信号和第二可检测信号是不同的。在试剂盒的一些中，第一可检测信号为银染并且第二可检测信号为QM-Dabsyl或固红。

如本文所用，术语“试剂盒”是指装有用于检测目标分析物的必要试剂的一个或多个器皿、容器、装置等的包装组合。试剂盒随附执行该方法的书面或计算机说明。试剂盒可以含有标记的抗体、核酸、配体等。用于检测生物学样品中目标分析物的试剂盒可以包含一个或多个容器，容器各自适于容纳目标分析物的特异性结合成员，氧化还原非活性还原物种，用于使所述还原物种具有活性的酶标记物，金属离子和金属增强试剂。在一些实施例中，所述特异性结合成员被固定在固体支持物上。

在本文公开方法的一些中，能够与α-突触核蛋白结合的一抗可以是表10中公开的抗体中的一者。例如，用于检测α-突触核蛋白的抗体可以包括但不限于：针对抗磷酸化的S129α-突触核蛋白的兔单克隆抗体克隆7E2和3G2。针对磷酸化的S129α-突触核蛋白的另外的单克隆抗体可以包括，例如，Abcam克隆MJF-R13(8-8)，P/N ab168381和P-syn/81A，P/Nab184674或WAKO克隆pSyn#64，P/N 015-25191。不论S129磷酸化状态如何，均可使用针对α-突触核蛋白的小鼠单克隆抗体克隆LB509(例如，Abcam(P/N ab27766))。还可以使用来自Prothena Corporation的抗α-突触核蛋白小鼠单克隆抗体克隆5C12(独立的S129磷酸化；

在本文公开方法的一些中，能够结合神经特征的一抗选自能够结合选自由以下各项组成的组的蛋白的抗体：泛素C末端水解酶L1(PGP9.5、UCHL1、NDGOA；PARK5；PGP95；SPG79；Uch-L1；HEL-117；PGP 9.5；HEL-S-53)、RNA结合的fox-1同源物3(RBFOX3、FOX3、NEUN、FOX-3、HRNBP3)、微管相关蛋白2(MAP2、MAP2A、MAP2B、MAP2C)、160kDa神经丝中链(NEFM、NFM、NEF3、NF-M)、200kDa神经丝重链(NEFH、NFH、CMT2CC)、突触素(SYP、MRX96、MRXSYP)和discs large MAGUK支架蛋白4(DLG4、DLGH4、PSD-95、PSD95、SAP-90、SAP90、SAP90A)。

在本文公开方法的一些中，该方法进一步包括：使切片与第一二抗接触，第一二抗具有与其缀合的第一标记，其中第一二抗与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗具有免疫反应性，以及使切片与第二二抗接触，第二二抗具有与其缀合的第二标记，其中第二二抗与能够结合神经特征的一抗具有免疫反应性。

在本文公开方法的一些中，该方法进一步包括：使切片与一组与第一二抗的第一标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与磷酸化的α-突触核蛋白接近的第一可检测信号；以及使切片与一组与第二二抗的第二标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与神经特征接近的第二可检测信号。

在本文公开方法的一些中，该方法进一步包括在使切片与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触之后以及在使切片与能够结合神经特征的一抗接触之前，使样品中的免疫复合物变性。

在本文公开方法的一些中，切片在与一抗接触之前，与至少一种蛋白酶接触。在某些方法中，该方法进一步包括使切片与至少一种磷酸酶接触。

在本文公开方法的一些中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗和能够结合神经特征的一抗来自同一宿主物种。

在本文公开方法的一些中，第一可检测信号和第二可检测信号是不同的。在本文公开方法的一些中，第一可检测信号为银染并且第二可检测信号为QM-Dabsyl或固红。

本文还提供了用于诊断受试者的PD的方法，方法包括：(a)从疑似患有PD的受试者获得包含至少一种神经特征的生物学样品；(b)通过使样品与抗PGP.5抗体接触并确定磷酸化的α-突触核蛋白与PGP9.5之间的共定位来检测磷酸化的α-突触核蛋白是否位于样品的神经特征内；以及(c)当肯定地确定在神经特征中存在磷酸化的α-突触核蛋白与PGP9.5之间的共定位时，诊断受试者患有PD。在一些情况下，当可以在没有与抗PGP9.5抗体相关的信号的情况下鉴定出神经特征时，可以在不使用抗PGP9.5抗体的情况下完成该方法。例如，有经验的病理学家可能能够在没有这种信号的情况下识别组织样品中的神经特征。病理学家可以通过存在与神经特征内定位的磷酸化的α-突触核蛋白相关的信号来诊断患有PD的受试者。

一些方法可以包括，例如，对样品中检测到的磷酸化的α-突触核蛋白和神经特征进行评分。在一些方法中，计数整个载玻片中神经特征的数量，并表示为含有磷酸化的α-突触核蛋白的神经特征的百分比。在某些方法中，其中通过目标神经特征蛋白的存在来鉴定神经特征，磷酸化的α-突触核蛋白和靶神经特征蛋白的存在可以包括使用面积为0.25平方毫米的5x5目镜栅格确定样品中用磷酸化的α-突触核蛋白抗体的神经特征染色的绝对数量，使用面积为0.25平方毫米的5x5目镜栅格确定样品中用靶神经特征抗体的神经特征染色的绝对数量，将用磷酸化的α-突触核蛋白抗体的细胞染色的绝对数量推算至1平方毫米区域中的神经特征的数量，并且将用靶神经特征抗体的神经特征染色的绝对数量推算至1平方毫米区域中的神经特征的数量，从而生成磷酸化的α-突触核蛋白和靶神经特征蛋白的评分。因此，该方法可以包括对磷酸化的α-突触核蛋白呈阳性的神经特征染色的数量和对栅格中的靶神经特征蛋白呈阳性的神经特征染色的数量进行计数(诸如，磷酸化α-突触核蛋白和/或靶神经特征阳性的神经特征)。在一个特定的实例中，将这些值插入以下公式中：细胞计数/(0.0156x栅格的#)。该公式取决于物镜的直径，即使在相等的放大倍率下，物镜的直径在模型之间是可变的。如果使用不同的放大倍率或不同的物镜，则可以使用其他公式。在一些实例中，选择样品的随机选择区域以进行评分。因此，如图32所示，图像中每个共定位的黑点和黄点代表用磷酸化的α-突触核蛋白和靶神经特征蛋白的神经特征染色。

本文提供了用于确定受试者是否患有帕金森氏病(PD)的方法，用于诊断受试者的PD的方法，以及当肯定地确定在来自受试者的生物学样品中磷酸化的α-突触核蛋白和神经特征之间存在共定位时，通过部分诊断患有PD的受试者来诊断和治疗受试者中的PD的方法。例如，如果使用本文提供的方法对从受试者获得的样品进行分析或评分，因为相对于与正常样品(例如，相同组织类型的非PD样品)，具有增加的神经特征内的磷酸化的α-突触核蛋白的共定位，则受试者可以被确定为或被诊断为患有帕金森氏病的受试者。例如，与正常样品中神经特征内的磷酸化的α-突触核蛋白(诸如此类样品的参考值或值的范围)相比，组织样品中的神经特征内磷酸化的α-突触核蛋白增加至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％或至少500％(诸如增加至少2倍、至少5倍、或至少10倍)。相反，如果使用本文提供的方法对从受试者获得的生物学样品进行分析或评分，因为相对于与正常样品(例如，非PD样品)，具有类似或减少的神经特征内的磷酸化的α-突触核蛋白，则受试者可以被确定为或被诊断为不可能患有帕金森氏病的受试者。在一些实例中，所公开的方法可以进一步包括如果受试者被确定为或被诊断为患有帕金森氏病的受试者，则对该受试者施用一种或多种疗法或治疗。

本文还提供了治疗诊断出患有PD的受试者的方法，其包括向受试者施用有效方案的α-突触核蛋白抗体，其中能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的抗体和能够结合神经特征的抗体已经显示出共定位在来自受试者的皮肤样品中的神经特征中。在某些方法中，通过向受试者施用有效方案的α-突触核蛋白抗体治疗被确定为患有PD的受试者，其中通过本文公开中的任意方法确定受试者患有PD。

如本文所用，术语“治疗”、“处理”和“进行处理”是指减轻帕金森氏病和相关运动障碍的一种或多种主要或次要症状。帕金森氏病的主要症状包括但不限于四肢静止时的四肢震颤、全身运动缓慢(运动迟缓)、肌肉强直或僵硬增加、步态或平衡问题(姿势异常)。帕金森氏病的次要症状包括但不限于：难以发起或恢复运动、丧失小肌肉运动技能、行走时身体患侧缺乏手臂摆动、在身体患侧脚拖动、面部表情减少、声音和/或语言变化、认知障碍、睡眠障碍、肠胃功能障碍以及沮丧或焦虑感。

也可以通过本公开的方法治疗的相关运动障碍包括但不限于：静坐不能、运动不能(缺乏运动)、手足徐动症(扭曲的扭力或扭转)、共济失调、投掷症(暴力非自愿的快速和不规则运动)、脑瘫、舞蹈病(例如，西登哈姆氏舞蹈病、风湿性舞蹈病、亨廷顿氏舞蹈病)、肌张力障碍(例如，肌肉紧张不足、睑痉挛、书写痉挛、痉挛性斜颈)、颏尖痉挛(下巴和下唇的间歇性不自主向上和向下运动)、肌阵挛、不宁腿综合征(RLS)、痉挛、刻板运动障碍、刻板症、迟发性运动障碍、抽动障碍(图雷特综合征、姿势性震颤、动作性震颤、特发性震颤、小脑性震颤、生理性震颤)和威尔逊氏病。

在开始治疗和/或疗法之前，应通过在神经退行性障碍和帕金森氏病方面具有专业知识和经验的多学科团队对所有受试者进行评估和管理。患有PD的受试者通常拥有一支医学专业和多学科的卫生保健团队，其由来自不同专业的医生组成，包括但不限于：神经学家、职业治疗师、物理治疗师、顾问、社会工作者、注册营养师和语言治疗师。在受试者中诊断出PD后，医学专家或医学专家团队通常会建议一种或几种治疗选择，包括一种或多种处方药(例如，甲磺酸苯扎托品(Cogentin)、恩他卡朋(Comtan)、多巴、拉罗多巴、左旋多巴和卡比多巴(Sinemet)、普拉克索(Mirapex)、雷沙吉兰(Azilect)、盐酸罗匹尼罗(Requip)、罗替戈汀(Neupro)、沙芬酰胺(Xadago)、答是美或三己基苯基(Artane))、手术(例如，深部脑刺激、苍白球切开术、丘脑切开术或γ刀)、替代疗法(辅酶Q10、按摩、针灸、太极、瑜伽、亚历山大技法或冥想)和/或健康饮食及运动。治疗方案由医学专家或医学专家团队确定，并且可以针对每个受试者。本领域技术人员熟悉PD的各种其他治疗。

在一些此类方法中，有效方案的α-突触核蛋白抗体包括选自由以下各项组成的组的α-突触核蛋白抗体：结合在α-突触核蛋白的残基1-20、α-突触核蛋白的残基1-10、α-突触核蛋白的残基4-15、α-突触核蛋白的残基91-99、α-突触核蛋白的残基117-123、α-突触核蛋白的残基118-126内的单克隆抗体，普拉辛珠单抗(PRX002)，具有抗体克隆1H7(ATCC登录号PTA-8220)的CDR的人源化抗体，具有抗体克隆9E4(ATCC登录号PTA-8221)的CDR、抗体克隆NI-202.21D11的CDR和抗体克隆NI-202.12F4的CDR的人源化抗体，例如，在美国专利号8,092,801、8,609,820、8,790,644、8,940,276、9,580,493中公开的α-突触核蛋白抗体，其全文以引用方式并入本文。

一些此类抗体包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO:49的残基31-35，VH CDR2，其包含SEQ ID NO:49的残基50-68，VH CDR3，其包含SEQ ID NO:49的残基101-102，VL CDR1，其包含SEQ ID NO:50的残基23-33，VL CDR2，其包含SEQ ID NO:50的残基49-55，以及VL CDR3，其包含SEQ ID NO:50的残基88-98。一些此类抗体包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO:51，VHCDR2，其包含SEQ ID NO:52，VH CDR3，其包含SEQ ID NO:53，VL CDR1，其包含SEQ ID NO:54，VL CDR2，其包含SEQ ID NO:55，以及VL CDR3，其包含SEQ ID NO:56。一些此类抗体包含重链，其包含SEQ ID NO:57，和轻链，其包含SEQ ID NO:58。

SEQ ID NO:49(US 8,940,276的SEQ ID NO:9)

EVQLVQSGGGLVEPGGSLRLSCAVSGFDFEKAWMSWVRQAPGQGLQWVARIKSTADGGTTSYAAPVEGRFIISRDDSRNMLYLQMNSLKTED

TAVYYCTSAHWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:50(US 8,940,276的SEQ ID NO:12)

QSVLTQPPSVSVSPGQTARITCSGEALPMQFAHWYQQRPGKAPVIVVYKDSERPSGVPERFSGSSSGTTATLTITGVQAEDEADYYCQSPDSTNTYEVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:51(US 9,580,493的SEQ ID NO:16；NI-202.21D11-VHCDR1)

NYAMH

SEQ ID NO:52(US 9,580,493的SEQ ID NO:17；NI-202.21D11-VHCDR2)

WINAGNGKRKYSQKFQD

SEQ ID NO:53(US 9,580,493的SEQ ID NO:18；NI-202.21D11-VHCDR3)

EEDHAGSGSYLSMDV

SEQ ID NO:54(US 9,580,493的SEQ ID NO:23；NI-202.21D11-VKCDR1)

KSSQNVLYSSNNKNYLA

SEQ ID NO:55(US 9,580,493的SEQ ID NO:24；NI-202.21D11-VKCDR2)

WASTRES

SEQ ID NO:56(US 9,580,493的SEQ ID NO:25；NI-202.21D11-VKCDR3)

QQYYSSPLT

SEQ ID NO:57(US 8,609,820的SEQ ID NO:10)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASISSGGGSTYYPDNVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGAGIDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:58(US 8,609,820的SEQ ID NO:5)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSIQTLLYSSNQKNYLAWFQQKPGKAPKLLIYWASIRKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQYYSYPLTFGGGTKLEIK

在一些此类方法中，抗体是普拉辛珠单抗(PRX002)。在一些此类方法中，抗体包含三个轻CDR，其分别命名为SEQ ID NO:18-20，和三个重链CDR，其分别命名为SEQ ID NO:22-24。在一些此类方法中，抗体包含一个轻链，其命名为SEQ ID NO:17，和一个重链，其命名为SEQ ID NO:21。

SEQ ID NO:17>10680L|普拉辛珠单抗|人源化|LC|

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSIQTLLYSSNQKNYLAWFQQKPGKAPKLLIYWASIRKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQYYSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:18普拉辛珠单抗LC CDR1 KSIQTLLYSSNQKNYLA

SEQ ID NO:19普拉辛珠单抗LC CDR2 WASIRKS

SEQ ID NO:20普拉辛珠单抗LC CDR3 QQYYSYPLT

SEQ ID NO:21>10680H|普拉辛珠单抗|人源化|HC|

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASISSGGGSTYYPDNVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGAGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:22普拉辛珠单抗HC CDR1 NYGMS

SEQ ID NO:23普拉辛珠单抗HC CDR1 SISSGGGSTYYPDNVKG

SEQ ID NO:24普拉辛珠单抗HC CDR1 GGAGIDY

在一些此类方法中，抗体为9E4，如在美国专利第8,609,820号中公开的，其全文以引用方式并入本文。该方法提供了一种抗体，其包含含有SEQ ID NO:29的三个Kabat CDR的人源化重链和含有SEQ ID NO:25的三个CDR的人源化轻链，条件是位置L36(Kabat编号)被F或Y占据和/或位置L83(Kabat编号)被L或F占据和/或位置H73(Kabat编号)被D或N占据，和/或位置H93(Kabat编号)被S或A占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据，并且位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L36被F占据。在一些此类抗体中，位置L83被L占据。在一些此类抗体中，位置H73被D占据。在一些此类抗体中，位置H93被A占据。在一些此类抗体中，位置L36被F占据，并且位置L83被L占据。在一些此类抗体中，位置L36被F占据，并且位置H73被D占据。在一些此类抗体中，位置L36被F占据，并且位置H93被A占据。在一些此类抗体中，位置L36被F占据，位置L83被L占据，并且位置H73被D占据。在一些此类抗体中，位置L36被F占据，位置L83被L占据，并且位置H93被A占据。在一些此类抗体中，位置L 36被F占据，位置L83被L占据，位置1173被D占据，并且位置H93被A占据。在一些此类抗体中，在位置L36、L83、H73和H93(Kabat编号)处的残基被F占据，并且位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编码)被F占据，并且位置H93(Kabat编码)被S占据。在一些此类抗体中，位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置1173(Kabat编码)被D占据，并且位置1193(Kabat编码)被A占据。在一些此类抗体中，位置H93(Kabat编码)被S占据。在一些此类抗体中，位置1173(Kabat编码)被N占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据，位置L83(Kabat编号)被L占据，并且位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据，位置L83(Kabat编号)被L占据，并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类方法中，抗体包含三个轻CDR，其分别命名为SEQ ID NO:26-28，和三个重链CDR，其分别命名为SEQ ID NO:30-32。在一些此类方法中，抗体包含轻链可变区，其命名为SEQ IDNO:25，和重链可变区，其命名为SEQ ID NO:29。

SEQ ID NO:25 9E4 LC可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSIQTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASIRKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPLTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO:26 9E4 LC CDR1 KSIQTLLYSSNQKNYLA

SEQ ID NO:27 9E4 LC CDR2 WASIRKS

SEQ ID NO:28 9E4 LC CDR3 QQYYSYPLT

SEQ ID NO:29 9E4 HC可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASISSGGGSTYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGAGIDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:30 9E4 HC CDR1 NYGMS

SEQ ID NO:31 9E4 HC CDR2 SISSGGGSTYYPDNVKG

SEQ ID NO:32 9E4 HC CDR3 GGAGIDY

在一些此类方法中，抗体为NI-202.21D11。在一些此类方法中，抗体包含三个轻CDR，其分别命名为SEQ ID NO:34-36，和三个重链CDR，其分别命名为SEQ ID NO:38-40。在一些此类方法中，抗体包含轻链可变区，其命名为SEQ ID NO:33，和重链可变区，其命名为SEQ ID NO:37。

SEQ ID NO:33NI-202.21D11 LC可变区

DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGHPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTITSLQTEDVAVYYCQQYYSSPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:34NI-202.21D11 LC CDR1 KSSQNVLYSSNNKNYLA

SEQ ID NO:35NI-202.21D11 LC CDR2WASTRES

SEQ ID NO:36NI-202.21D11 LC CDR3 QQYYSSPLT

SEQ ID NO:37NI-202.21D11 HC可变区

EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGKRKYSQKFQDRVTINRDTSASTIYMELSSLGSEDTAVYYCAREEDHAGSGSYLSMDVWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:38NI-202.21D11 HC CDR1 NYAMH

SEQ ID NO:39NI-202.21D11 HC CDR2 WINAGNGKRKYSQKFQD

SEQ ID NO:40NI-202.21D11 HC CDR3 EEDHAGSGSYLSMDV

在一些此类方法中，抗体为NI-202.12F4。在一些此类方法中，抗体包含轻重CDR，其分别命名为SEQ ID NO:42-44，和三个重链CDR，其分别命名为SEQ ID NO:46-48。在一些此类方法中，抗体包含轻链可变区，其命名为SEQ ID NO:41，和重链可变区，其命名为SEQID NO:45。

SEQ ID NO:41NI-202.12F4 LC可变区

QSVLTQPPSVSVSPGQTARITCSGEALPMQFAHWYQQRPGKAPVIVVYKDSERPSGVPERFSGSSSGTTATLTITGVQAEDEADYYCQSPDSTNTYEVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:42NI-202.12F4LC CDR1 SGEALPMQFAH

SEQ ID NO:43NI-202.12F4LC CDR2 KDSERPS

SEQ ID NO:44NI-202.12F4LC CDR3 QSPDSTNTYEV

SEQ ID NO:45NI-202.12F4 HC可变区

EVQLVQSGGGLVEPGGSLRLSCAVSGFDFEKAWMSWVRQAPGQGLQWVARIKSTADGGTTSYAAPVEGRFIISRDDSRNMLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSAHWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:46NI-202.12F4HC CDR1 KAWMS

SEQ ID NO:47NI-202.12F4HC CDR2 RIKSTADGGTTSYAAPVEG

SEQ ID NO:48NI-202.12F4HC CDR3 TSAH

本文还提供了用于检测磷酸化的α-突触核蛋白的方法，该方法包括：使生物学样品与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触；以及检测能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗。在方法的一些中，样品在与所述能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗接触之前，与至少一种蛋白酶接触。在一些方法中，该方法进一步包括使样品与至少一种磷酸酶接触。在一些方法中，检测包括组织化学分析。在一些方法中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗检测在残基S129处磷酸化的α-突触核蛋白。在某些方法中，能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗为7E2抗体克隆或3G2抗体克隆。在一些方法中，样品是固定的。在某些方法中，样品是福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)样品。在一些方法中，样品是冷冻样品

在一些方法中，该方法进一步包括使样品与第一二抗接触，第一二抗具有与其缀合的第一标记，其中第一二抗与能够结合磷酸化的α-突触核蛋白的一抗具有免疫反应性。在一些方法中，该方法包括使样品与一组与第一二抗的第一标记具有反应性的试剂接触，以在样品中生成与磷酸化的α-突触核蛋白接近的第一可检测信号。

实例

帕金森氏病是一种进行性神经退行性疾病，其特征在于患有该疾病的受试者的脑中存在路易体和路易神经突。路易体富含聚集形式的α-突触核蛋白(aSyn)，一种较差特性功能的蛋白。患有帕金森氏病的受试者的周围神经中也发现了aSyn的聚集。可以将聚集的aSyn使用免疫组织化学(IHC)进行检测，并且由于其对蛋白酶处理的抗性，可以与未聚集的aSyn区别开。然而，延长的蛋白酶处理可能会降低IHC测定中的组织形态，导致需要一种将聚集的aSyn与未聚集的aSyn区分的替代方法。与未聚集的aSyn相比，发现异常高比例的聚集的aSyn在Ser129残基(pS129)处被磷酸化。如本文所示，开发了使用pS129-aSyn作为aSyn聚集的替代标记物的聚集的aSyn的高灵敏度和特异性测定。

材料

组织来源。头皮、腹部区域皮肤、结肠和颌下腺样品是从脑部和身体捐赠计划主任Thomas G.Beach博士的帮助下从Banner Sun健康研究所(BSHRI)获得的。除了标准化的临床评估，帕金森氏病的诊断是在组织捐赠者中通过路易体的存在证实。同样，正常的非PD对照受试者的状态通过缺乏路易体来确定。样品(16例男性，8例女性；年龄65-95；15例PD，9例非PD)在验尸后获得，并用福尔马林固定。来自正常个体和患有PD的受试者的福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)皮质脑块分别从Roche Tissue Diagnostics(RTD)内部组织库和Folio Biosciences获得。通过Folio Biosciences从1至16岁的8个个体(3例男性，5例女性)中获得了FFPE皮肤活检块的小同期群，以评估与聚集的aSyn不同的pS129-aSyn染色程度。来自36例受试者的72FFPE皮肤活检块的更大同期群从蒙特利尔总医院神经内科的RonPostuma博士获得。基于对受试者所表现症状的临床检查，在36例受试者中，有15例被诊断为患有PD，另外5例被诊断为患有非典型帕金森病。其余(16例受试者)为未患有PD的对照受试者。在临床就诊期间对受试者进行了两次穿刺皮肤活检，并将FFPE块通过Prothena转移至Ventana医疗系统。所有其他组织标本均从RTD内部组织库获得。除非另有说明，否则所有FFPE组织切片的厚度均为4μm。

针对α-突触核蛋白(aSyn)和PGP9.5的抗体。针对磷酸-S129 aSyn的兔单克隆抗体克隆7E2和3G2是由Roche Diagnostics GmbH CPS R&D Early Development&ReagentDesign(DXREAA)生成，具有对应于人的aSyn残基122-135的磷酸肽作为免疫原。针对磷酸-S129 aSyn的另外的单克隆抗体从Abcam(克隆MJF-R13(8-8)，P/N ab168381和P-syn/81A，P/N ab184674)或WAKO(克隆pSyn#64，P/N 015-25191)购买。不论S129磷酸化状态如何，针对aSyn的小鼠单克隆抗体克隆LB509均从Abcam(P/N ab27766)购买。抗aSyn小鼠单克隆抗体克隆5C12(独立的S129磷酸化)和抗磷酸化的S129α-突触核蛋白小鼠单克隆抗体克隆11A5是来自Prothena Corp的礼物。另参见表10。

在本研究中使用了三种抗人的PGP9.5抗体。两种单克隆抗体，一种兔(克隆EPR4118，P/N ab108986)和另一种小鼠(克隆13C/I3C4，P/N ab8189)都从Abcam购买。具有RTD P/N 760-4434的兔多克隆抗体从Cell Marque

酶。在由pRED/Prothena开发的自动的蛋白酶抗性α-突触核蛋白DAB IHC测定中，使用

用于自动的磷酸-S129-aSyn和PGP9.5银/黄双重IHC测定和蛋白酶抗性α-突触核蛋白DAB IHC测定的可商购和用户提供的试剂。下表1含有试剂列表，所述试剂在大黄蜂测定方案1和2以及基于DAB的pRED/Prothena测定方案中使用并用于检测蛋白酶抗性aSyn，其包括本体溶液、酶、抗体、检测试剂盒和辅助试剂(参见以下方法)。

表1

使用的潜在试剂的列表

设备。使用具有以下序列号的BenchMark ULTRA仪器：310520、310841、310934、310940、311000、311112、311276、311279和311311。

方法

使用针对aSyn或PGP9.5的抗体对患有或未患有帕金森氏病的供体的FFPE脑和皮肤切片进行DAB染色

将FFPE脑切片使用

自动的磷酸-S129-α-突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定(大黄蜂测定方案)。将FFPE皮肤切片放入具有标准补充本体溶液的

表2

方案1的总结

表3

方案2的总结

自动的蛋白酶抗性α-突触核蛋白DAB IHC测定(pRED/Prothena测定方案)。由于已知聚集的α-突触核蛋白是蛋白酶的不佳底物，因此可以采用通过蛋白酶去除未聚集的α-突触核蛋白后对聚集的aSyn的组织化学染色来检测路易体。由Roche pRED与ProthenaBiosciences合作开发了基于此原理的测定，以检测皮肤活检中聚集的α-突触核蛋白(pRED/Prothena测定方案)。该测定依赖于5C12抗体，其表位已定位到α-突触核蛋白残基109至120(Ser129磷酸化位点以外的区域)。pRED/Prothena方案显示在表4中，并且本研究中采用的方案显示在表5中。对于pRED/Prothena测定方案，使用

表4

用于蛋白酶抗性α-突触核蛋白的方案的总结

表5

用于蛋白酶抗性α-突触核蛋白的方案的总结

载玻片评估和aSyn信号评分。由通过职业验证的病理学家或测定开发的科学家对载玻片进行评分，这些科学家具有评估皮肤中aSyn染色样式的丰富经验。对于pS129-aSyn和PGP9.5银/黄双重IHC测定，记录带有黄色PGP9.5染色的总神经特征的数量，以及表现出离散和/或弥散性粒状银pS129-aSyn染色的神经特征的数量。在典型的皮肤切片中，在神经束和竖毛肌以及还有周围的分泌腺/皮脂腺和血管中观察到黄色PGP9.5染色。每个载玻片至少计数25个神经特征，但通常计数更多，以确保测定灵敏度不会因评估的神经特征数量少而受到不利影响。在皮肤面积有限且可供评估的神经特征总数少于25的载玻片中，扫描整个皮肤区域并计神经特征总数。结果以具有特定类型的pS129-aSyn染色的神经特征的百分比表示。使用蛋白酶抗性aSyn DAB IHC测定染色的载玻片评分相似，不同之处在于神经特征通过形态学识别。在组织形态受到用蛋白酶1处理的显著影响的情况下，总神经特征的数量来自使用pS129-aSyn和PGP9.5银/黄双重IHC测定染色的相邻载玻片。

统计分析。使用Minitab 17统计软件通过卡方检验评估磷酸化的α-突触核蛋白信号的存在与受试者的临床状况之间的关联。

实例1.针对pS129-aSyn的7E2兔单克隆抗体的表征

抗磷酸化的S129α-突触核蛋白兔单克隆抗体7E2由Roche Diagnostics GmbH CPSR&D Early Development&Reagent Design生成。用于生成7E2的免疫原是经由N末端Cys残基与KLH缀合的肽。该肽的序列NEAYEMPpSEEGYQD(SEQ ID NO:59)对应于人的α-突触核蛋白的残基122-135。表面等离振子共振(Biacore)实验表明与未在Ser129处磷酸化相同肽相比，7E2抗体对在Ser129处磷酸化的α-突触核蛋白(122-135,pS129)免疫原肽具有高特异性。7E2抗体对α-突触核蛋白(122-135,pS129)肽显示出快速的缔合速率和缓慢的线性解离速率。

使用人体组织微阵列检查了7E2抗磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体在免疫组织化学背景下的特异性，该人体组织微阵列含有来自各个解剖部位的30个正常组织的核心和29个癌组织的核心(SuperBioChips Laboratories,Seoul,Korea,P/N BC8)。身体之旅/肿瘤之旅(ToB/ToT)分析表明，用7E2抗体观察到的唯一非神经元染色是巨噬细胞(先前已报道α-突触核蛋白在巨噬细胞中表达)。有关ToB/ToT分析的总结，参见表6-9。ToB/ToT结果证明，方案是既准确又特定的。

表6

方案1的身体分析之旅的总结

表7

方案2的身体分析之旅的总结

表8

方案1的肿瘤分析之旅的总结

表9

方案2的肿瘤分析之旅的总结

实例2.7E2与其他pS129-aSyn抗体相比对FFPE组织的免疫组织化学染色性能。

基于聚集的和未聚集的α-突触核蛋白对蛋白水解降解的不同灵敏度检测聚集的α-突触核蛋白，为鉴定脑中路易体和明确诊断帕金森氏病提供了基础。为了评估针对磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体(包括7E2)检测路易体的能力，使用

表10

非限制性、示例性的α-突触核蛋白抗体的列表

在来自非PD个体的脑切片中，在没有抗原修复的情况下，用3G2和7E2抗体未观察到染色(参见图2A和2B)。在ULTRA CC1抗原修复的情况下，3G2和7E2抗体产生了微弱的细胞质染色，而当样品用磷酸酶处理时则不存在(参见图3A和3B)。通过延长的磷酸酶或中度蛋白酶处理来测试81A、7E2、3G2、11A5和MJF-R13(8-8)对路易氏体中聚集的pS129-aSyn的特异性。在36℃在8.8μg/mL高活性重组碱性磷酸酶中2小时后，来自PD供体的皮质脑切片中的路易体染色程度为重度(用MJF-R13(8-8)和81A)或中度(用11A5、7E2和3G2)降低(参见图4A–图4E)。因此，磷酸酶处理似乎减少了非路易氏体染色，而没有显著影响路易氏体染色。相反，在36℃用VENTANA

总体而言，在不存在蛋白酶处理的情况下，磷酸化特异性的α-突触核蛋白抗体7E2和3G2在来自患有PD的受试者的脑切片中产生的染色样式与蛋白酶处理后的总α-突触核蛋白抗体5C12相同(参见图6)。然而，3G2通常显示出比7E2更高的背景(数据未显示)。除了较差的染色性能外，与其他抗磷酸化的S129α-突触核蛋白抗体相比，Abcam的81A和WAKO的#64还表现出较低的特异性。不同于3G2和7E2，81A导致来自非PD个体的脑切片中的神经突染色(数据未显示)。这可能反映了所报道的81A对在Ser473处磷酸化的神经丝轻链(NFL)的交叉反应性。在低滴度(1:1000)下，在磷酸酶处理后，来自WAKO的#64抗体克隆导致在来自PD和非PD受试者的脑切片中的非特异性核染色，并且在其他7种抗体克隆的情况下均未观察到(数据未显示)。

除脑外，还评估了抗pS129-aSyn抗体克隆检测来自患有PD的受试者皮肤样品中聚集的aSyn的能力。在不存在基于蛋白酶的抗原修复的情况下，所有抗pS129-aSyn抗体都能够在来自患有PD的受试者的皮肤切片中检测到聚集的aSyn，类似于使用结合了VENTANA

执行稀释和滴定实验以优化使用7E2抗体的磷酸化的S129α-突触核蛋白染色。稀释剂测试的结果表明，稀释剂90040和稀释剂90103在保持染色强度的同时具有最小的背景(参见图8A和图8B)。滴定实验表明，浓度为1μg/mL的7E2分液器具有接近最大的染色强度和最小的背景(数据未显示)。滴定实验结果通过保护带实验得到加强，在该实验中，以每张载玻片染色的神经元特征百分率的形式执行定量测量(参见图9)。使用双重银/黄和单重DAB检测方案执行的加速稳定性测试表明，7E2在4℃预计保质期为24个月(数据未显示)。

实例3.免疫组织化学染色的PGP9.5抗体的选择

蛋白基因产物9.5(PGP9.5)，更具描述性地称为泛素羧基-末端水解酶L1(UCHL1)，是一种硫酯酶，对于泛素缀合的蛋白的去泛素化和维持游离的单泛素池20-24是必不可少的。它在脑中高度表达，并据估计占总神经元蛋白的1％至5％。PGP9.5通常用作神经元和神经内分泌细胞的标记物，但是PGP9.5的表达并不仅限于这些细胞类型。评估了三种不同的针对PGP9.5的抗体用于免疫组织化学检测皮肤中的神经特征、神经元或神经内分泌细胞，一种来自Cell Marque

使用BC8人体组织微阵列评估了EPR4118抗体在磷酸-S129-α-突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定的免疫组织化学背景下的特异性，所述BC8人体组织微阵列含有来自各个解剖部位的30个正常组织核心和29个癌组织核心(SuperBioChipsLaboratories,Seoul,Korea)。ToB/ToT分析证明，来自各个组织部位的血管和腺体周围以及神经和神经节细胞中的PGP9.5染色。具有神经支配的专门结构(胰岛)也对PGP9.5染色呈阳性(参见表6-9)。在肾小管、肺中的稀有基质细胞、睾丸中的生殖细胞、胎盘中的滋养层细胞和来自各种类型癌症的肿瘤细胞中观察到PGP9.5染色。这些发现与先前报道的PGP9.5在各种类型的肿瘤和非神经元细胞类型中表达一致。

稀释剂测试、滴定、保护带和加速稳定性的结果(数据未显示)导致在DISCOVERYGoat Ig Block(VENTANA P/N 760-6008)中以0.5μg/mL的EPR4118的分液器制剂。在这种制剂中，基于加速稳定性测试，EPR4118在4℃预计保质期为24个月。批间测试的结果(数据未显示)证明EPR4118抗体的性能在通过两个不同制造商(Abcam和Spring)生成的四个不同生产批次中是一致的。

实例4.aSyn和PGP9.5测定和检测配置的选择

蛋白酶抗性是包括α-突触核蛋白在内的许多聚集蛋白的标志，并用蛋白酶处理可增强对病理形式的α-突触核蛋白的检测。Roche pRED与Prothena合作开发了一种对来自BSHRI的PD和非PD样品的同期群中的聚集的α-突触核蛋白具有高特异性的测定(随后转移至Targos)(参见表4和表5)。pRED/Prothena aSyn测定是基于5C12抗体，该抗体识别磷酸化和未磷酸化的S129-aSyn，通过

对来自BSHRI同期群的头皮样品集合的调查显示，胶原背景DAB的染色程度从轻到重不等，足以干扰来自聚集的aSyn的特定信号的解释(数据未显示)。这促使寻找一种灵敏度与OptiView DAB IHC检测试剂盒相当的替代检测方法，用于对聚集的aSyn进行染色。如图13所示，与OptiView DAB IHC检测试剂盒相比，ultraView Universal DAB检测试剂盒一致地降低了对PGP9.5的染色强度。结果，将ultraView Universal DAB检测试剂盒与使用Ms抗Rb IgG，随后使用Rb抗Ms IgG的扩增偶联(

使用7E2抗体、ultraView SISH DNP检测试剂盒(P/N 760-098)和DISCOVERY

尚未测试的一种测定配置是用蛋白酶1进行抗原修复，随后与5C12抗体一起孵育并使用ultraView SISH DNP检测试剂盒进行检测。该测定配置潜在地与使用ultraViewSISH DNP检测试剂盒检测到的7E2抗体对聚集的aSyn具有相似灵敏度。然而，它与掺入PGP9.5作为神经元标记物的双重检测不兼容，因为PGP9.5需要使用细胞调节(CC)1或2本体溶液进行抗原修复，并且蛋白酶1与CC1或CC2处理的组合会导致组织形态的大量损失(数据未显示)。

实例5.使用7E2抗体克隆的磷酸-aSyn染色和使用EPR4118抗体克隆的PGP9.5染色的抗原修复条件的优化

抗原修复程序后，许多表位的免疫组织化学检测得以增强。评估了两种不同的抗原修复处理过程对使用7E2抗体检测FFPE皮肤切片中pS129-aSyn的影响：

与大多数靶标相反，在100℃用ULTRA CC1仅处理32分钟后，pS129-aSyn的染色反常降低(参见图20A–图20E)。用五种不同的针对pS129-aSyn的抗体观察到ULTRA CC1对pS129-aSyn染色的负面影响：11A5、7E2、3G2、MJF-R13(8-8)和81A(参见图20A-图20E)表明S129残基本身的磷酸化可能已受到该处理的影响。

蛋白酶处理可以改善对聚集的aSyn的检测，但是导致这种现象的根本原因尚不清楚。这可能是由于蛋白酶消化后未聚集的aSyn的去除或抗体进入蛋白聚集体中埋藏的表位的抗体访问改善或两者组合造成的。在36℃用

可以完全消除PD和非PD样品中存在的粒状型pS129-aSyn染色，同时保留仅在PD样品中可见的离散型pS129-aSyn染色的更具特异性的检测方案的可能性导致寻找替代方法来去除粒状pS129-aSyn染色。一旦S129残基在聚集的aSyn中被磷酸化，附接的磷酸基团比可溶aSyn中的磷酸-S129对通过蛋白磷酸酶的去除更有抵抗力(Waxman&Giasson,JNeuropathol Exp Neurol 67(5):402-416(May 2008))。测试了哺乳动物碱性磷酸酶(一种具有广泛的底物特异性并显示出对丝氨酸磷酸化蛋白有活性的磷酸酶)选择性去除FFPE皮肤切片中的粒状pS129-aSyn染色的能力。在7E2抗体孵育之前，用pH值为9或更高的纯化的内源性(New England Biolabs,NEB)或重组(Roche)小牛肠碱性磷酸酶处理脱石蜡的皮肤切片，可防止出现粒状pS129-aSyn染色，而不会显著影响离散pS129-aSyn染色的水平(参见图23A和图23B)。有趣的是，pH值为8的碱性磷酸酶处理确实导致离散pS129-aSyn的染色减少(参见图24)。先用碱性磷酸酶顺序处理以去除可溶性aSyn中的S129磷酸化，然后通过蛋白酶介导的抗原修复增强，形成了替代pS129-aSyn和PGP9.5银/黄双重IHC测定方案(大黄蜂测定方案2)的基础，其对聚集的aSyn具有潜在更高的特异性(参见图25)。

不同于pS129-aSyn，使用EPR4118抗体的PGP9.5检测随着使用ULTRA CC1本体溶液的抗原修复持续时间的增加而增强(参见图26)。用ULTRA CC2进行的抗原修复在PGP9.5染色中产生了类似的增强作用(参见图27)。自动明场双重IHC测定需要顺序进行抗体孵育和生色团沉积循环，如图28所示。当在双重IHC测定方案中使用相同物种的两种一抗时，需要在100℃以ULTRA CC2孵育形式进行热失活(HD)步骤，以去除在第一循环中沉积的一抗和二抗，以防止第一循环中的一抗与第二循环中的二抗潜在的交叉反应。尽管在第一循环中沉积的生色团为银/黑色(沉积在黑色染色顶部的黄色染色保持黑色)时，不需要热失活步骤，但在100℃用CC2处理16分钟可作为使用EPR4118抗体进行PGP9.5染色的抗原修复。

实例6.重现性和准确性的分析

前面章节中描述的实验结果导致了两个优化的方案，用于自动的磷酸-S129-α-突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定(大黄蜂测定方案1和方案2)。如以上章节中详述，方案1不含有用于pS129-aSyn检测的抗原修复步骤。方案2在所有方面均与方案1相同，不同之处在于样品在脱石蜡处理后和7E2抗体孵育之前先用碱性磷酸酶处理随后用蛋白酶处理。在来自三个不同患有PD的受试者的头皮样品中评估了大黄蜂测定方案1和方案2的运行中和运行间重现性。对于运行中的重现性，如方法中所述，使用方案1或方案2对来自PD受试者各自的5个连续切片的载玻片进行染色，并由病理学家列举有或没有离散pS129-aSyn的神经特征的数量。PD受试者各自具有的离散pS129-aSyn染色的皮肤神经特征量占总神经特征的百分比从5个染色切片取平均值，并且示出于表11。

表11

皮肤样品中方案1和方案2的重现性(运行中)

针对运行间重现性，在不连续的几天中，使用方案1或方案2在三个不同的仪器上对来自三个不同患有PD的受试者中每一者的一式三份载玻片进行染色。在运行中，来自PD受试者各自的三张载玻片是连续切开的切片；然而，在不同的运行之间，切片不是连续的。来自三次运行的每一者中具有离散pS129-aSyn染色的神经特征的平均百分比示出于表12中。

表12

皮肤样品中方案1和方案2的重现性(运行间)

在CV超过15％的情况下，最可能的变化源是连续切片的载玻片之间的神经特征数量差异。对连续切片的载玻片之间神经特征连续性的研究得出的结论是，在5个到10个4μm切片中，神经特征数量的10％到20％的差异可归因于特征分布的中载玻片之间的变化(参见表13)。用黄色DABSYL生色团染色的PGP9.5的强度在所有针对测定重现性研究染色的载玻片中为2.5。

表13

皮肤组织中神经特征的连续性

执行实验以分析pS129-aSyn和PGP9.5银/黄双重IHC测定的精度，并对切片中各自的特征染色百分比进行评分(约25个特征)。为了分析运行间精度，至少间隔两天在同一台仪器上测试三张载玻片的三次运行(方案1CV：2.77％离散度，5.13％弥散度；方案2CV：3.99％离散度，0.00％弥散度)。为了分析仪器间的精度，在新仪器上执行了三个载玻片的另外两次运行，并与第一台仪器的第一次运行进行了比较(方案1CV：3.22％离散度，11.86％弥散度；方案2CV：3.45％离散度，0.00％弥散度)。总而言之，大黄蜂测定方案1和方案2的运行间和仪器间精度的CV均低于合格转移所需的15％阈值。

实例7.测定验证–头皮样品

在优化磷酸化-α-突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定(绰号大黄蜂测定)期间，观察到光滑离散的磷酸化-α-突触核蛋白染色样式仅与用于可行性测试的PD头皮样品小同期群相关。为了确定这种趋势是否扩展到来自PD和非PD受试者的头皮样品的更大同期群，使用pS129-aSyn和PGP9.5银/黄双重IHC测定(大黄蜂测定)的方案1和方案2对来自15例PD和9例非PD受试者的头皮切片进行染色。此外，使用自动的蛋白酶抗性aSyn DAB IHC测定(pRED/Prothena测定方案)对含有10个PD和4个非PD的头皮样品的该同期群的子集的切片进行染色。如图29所示，来自PD受试者的15个样品中的13个(87％)在使用大黄蜂测定的方案1或方案2染色后表现出离散型pS129-aSyn。在9个非PD头皮样品中，有5个(56％)使用大黄蜂方案1表现出离散pS129-aSyn染色。相反，使用大黄蜂方案2以及温和的蛋白酶和磷酸酶处理，9个非PD头皮样品均未显示出离散pS129-aSyn染色。仅使用方案1观察到弥散性粒状型pS129-aSyn染色，而使用方案2观察不到。

在可获得大黄蜂测定方案1、大黄蜂测定方案2和pRED/Prothena测定方案结果的受试者子集中，分别在15个染色的14个、14个和13个PD头皮样品中观察到离散aSyn信号(参见图30A)。在使用全部三种方案染色的4个非PD头皮样品中，用大黄蜂方案2或pRED/Prothena方案未观察到离散aSyn染色(参见图30A)。使用大黄蜂方案1在PD和非PD头皮样品中均观察到弥散性粒状aSyn染色(参见图30B)。这些结果表明，组合使用高灵敏度的检测化学方法(金属银沉淀)和针对pS129-aSyn的抗体对聚集的aSyn的检测与基于针对修饰或未修饰的aSyn的抗体的方法组合蛋白酶去除未聚集的aSyn可能具有相似的灵敏度。

实例8.测定验证–腹部皮肤样品

为了进一步评估磷酸-aSyn和PGP9.5银/黄双重IHC测定的灵敏度和特异性，使用大黄蜂测定方案1和方案2对来自20例PD和20例非PD对照受试者的同期群的腹部皮肤样品进行了染色。分析的结果示出于图31中。在使用大黄蜂测定方案1和方案2染色的20个PD腹部皮肤样品中，分别在19个和17个样品中观察到了离散pS129-aSyn染色。相反，20个非PD腹部皮肤样品均未显示任何离散pS129-aSyn信号。还如图31所示，弥散性粒状pS129-aSyn染色存在于大多数使用大黄蜂测定方案1染色的PD和非PD腹部皮肤样品中，并且处于在低水平使用大黄蜂测定方案2染色的PD样品中。这些结果表明，在来自20例PD和20例非PD受试者的腹部皮肤的扩大同期群中，离散pS129-aSyn染色的存在与PD临床状态之间存在高度关联(分别对于大黄蜂测定方案1和方案2，皮尔逊卡方值＝36.2和29.6，两个方案的P值<0.0001)。

4种PD和4种非PD腹部皮肤样品的同期群以FFPE块形式提供，并且用于使用大黄蜂测定方案以及基于5C12抗体和蛋白酶1的pRED/Prothena测定方案进行测试。这种分析的结果示出于下表14中。

表14

具有离散pS129-aSyn的神经特征的百分比

与使用两种大黄蜂测定方案任一者测试的样品相比，使用pRED/Prothena方案测试的四个PD腹部皮肤样品中的三个表现出了具有离散pS129-aSyn的神经特征的百分比降低。这在使用所有三种方案染色的头皮样品中均未观察到(图30)。差异的可能解释是，与头皮样品的组织形态相比，腹部皮肤样品的组织形态更易于通过蛋白酶1处理降解。目前尚不清楚对蛋白酶1处理产生明显差异灵敏度的原因。除解剖部位外，腹部载玻片的切割比头皮载玻片的切割更靠近其染色时间。通常，观察到在染色前已在室温下切割并放置了较长时间(>30天)的载玻片对蛋白酶诱导的形态降解的灵敏度较低(数据未显示)。

实例9.测定验证–S4前的头皮、结肠和颌下腺样品

除皮肤外，结肠和颌下腺(SMG)高度受神经支配，并可以是用于检测聚集的α-突触核蛋白的活检部位。使用大黄蜂测定方案2对在尸检时采集的来自3例PD和3例非PD受试者的一式两份头皮、结肠和SMG样品进行染色。由于先前对正常结肠和SMG样品的研究表明，方案1生成了重度离散的磷酸化的α-突触核蛋白染色，可以使用方案2通过蛋白酶和磷酸酶处理将其去除(参见图32A和图32B)，因此不采用方案1。三个不同组织部位中离散的磷酸化的α-突触核蛋白染色的典型图像示出于(参见图33A–图33C)。通过三个独立的读者对染色的载玻片进行盲评(数据未显示)。即使其中一位读者使用了与其他读者不同的评分方法，但基于使用大黄蜂方案2的离散的磷酸化的α-突触核蛋白染色的存在，完全可以将PD与非PD样品完全分离。特异性和灵敏度均为100％。

实例10.测定验证–皮肤活检样品

在尸检期间获得用于测定开发和验证的BSHRI头皮和腹部皮肤样品。为了评估磷酸化的S129α突触核蛋白和PGP9.5银/黄双重IHC测定在诊断应用中的潜在用途，使用两种大黄蜂测定方案1和2对来自有和没有被诊断出PD症状的受试者进行临床就诊期间获得的皮肤穿刺活检的FFPE切片进行染色。对来自36个受试者的总共72个FFPE块的组织切片进行了染色，因为每个受试者都有双份块。通过未知受试者的临床状况的病理学家对染色的载玻片进行了审查。由于样品是皮肤的小型穿刺活检，因此每个载玻片可用的神经特征数量有限(约5个到10个)。结果，没有进行以银染神经特征的百分比形式的定量测量。如果存在明显不呈粒状且大小足以将其与背景银屑区分开的离散银染，则认为载玻片对磷酸化aSyn呈阳性。如果来自一式两份块之一的切片对磷酸化-aSyn染色呈阳性，则认为该受试者总体呈阳性。如在儿科皮肤活检样品中一样，大黄蜂方案1生成了重磷酸化-aSyn银染，其具有在方案2的情况下不存在的离散形态(参见图34)。这导致15例PD中的93％和16例对照受试者中50％(在包括5例非典型帕金森病的36例受试者中69％)出现了使用方案1的阳性离散磷酸化aSyn染色。在方案2的情况下，15例PD中的60％和16例对照受试者中的6％(所有36例受试者中的31％)表现出离散磷酸化aSyn信号(参见表15和16)。所有36例受试者的单独组织块的各自非盲结果以及相应的PD状态示出于表16中。对所有36位受试者的结果进行卡方分析证明，离散磷酸化aSyn信号的存在与基于临床症状的PD状态的指定之间存在高度显著相关性(皮尔逊卡方值＝10.506，DF＝1，P值＝0.001)。当从分析中排除5例患有非典型帕金森病的患者时，关联仍然很显著(皮尔逊卡方值＝10.236，DF＝1，P值＝0.001)。

表15

使用方案1和方案2对非PD受试者皮肤组织中的磷酸-Ser129α-突触核蛋白(pS129-aSyn)染色

表16

使用方案1和方案2对非PD受试者皮肤组织中的非盲磷酸-Ser129α-突触核蛋白(pS129-aSyn)染色

结果证明，基于皮肤活检中离散型磷酸化-aSyn染色的存在，自动的双磷酸化-aSyn和PGP9.5免疫组织化学测定具有高灵敏度和特异性，用于将患有PD的受试者与非PD的对照受试者区分开。离散磷酸化aSyn染色的形态学外观及其对蛋白酶和磷酸酶处理的抗性与聚集的aSyn一致。该测定在鉴定患有PD的受试者和/或靶向aSyn的聚集的治疗方法的候选物中可能具有潜在价值。

如本文所用，除非另有说明，否则单数形式“一个”、“一种”及“该/所述”包括复数个参考物。例如，术语“包含细胞”包括单个或多个细胞，并且被认为等同于短语“包含至少一个细胞”。除非上下文另外明确指出，否则术语“或”是指所述替代元素的单个元素或两个或更多个元素的组合。如本文所用，“包含”意指“包括”。因此“包含A或B”意指“包括A、B、或A和B”，不排除其他元素。

前述内容仅出于示例性目的而提供，并且无意于限制以上广义描述的本公开的范围。本公开中引用的所有参考文献均以引用方式并入本文。

尽管本文已经描述了本公开的各种特定实施例，但是应当理解，本公开不限于那些精确的实施例，并且在不脱离本公开的范围和精神的情况下，本领域的技术人员可以对其进行各种改变或修改。

以上给出的实例仅是说明性的，并不意味着是本公开的所有可能的实施例、应用或修改的详尽列表。因此，在不脱离本公开的范围和精神的情况下，本公开的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定实施例描述了本公开，但是应当理解，所要求保护的本公开不应不适当地限制于这样的特定实施例。实际上，对于分子生物学、免疫学、化学、生物化学或相关领域的技术人员来说显而易见的是，用于实施本公开的所述方式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。

应该理解的是，本公开不限于本文描述的特定方法、方案和试剂等，正如技术人员将认识到的这些可以变化。另外应当了解，本文使用的术语只是为了描述特定实施例的目的而使用，并且不旨在限制本公开的范围。

将本公开的实施例及其各种特征和有利细节经参考非限制性实施例进行了更全面地解释和/或在附图中示出以及在以下描述中进行了详细描述。应当注意，附图中示出的特征不必按比例绘制，并且即使没有在此明确说明，正如技术人员会认识到的也可以将一个实施例的特征与其他实施例一起采用。

本文中列举的任何数值包括从下限值到上限值的所有值，以一个单位为增量，只要在任何下限值和任何上限值之间存在至少两个单位的间隔即可。例如，如果说明组分的浓度或过程变量的值诸如，例如，大小、角度大小、压力、时间等，例如，是从1至90，具体地是从20至80，更具体地是从30至70，意图是在本说明书中明确列举了诸如15至85、22至68、43至51、30至32等值。对于小于1的值，适当地将一个单位视为0.0001、0.001、0.01或0.1。这些仅是具体意图的实例，并且在所列举的最小值和最大值之间的数值的所有可能的组合应被认为在本申请中以类似的方式明确地陈述。

描述了特定的方法、装置和材料，尽管与本文所述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实践或测试中。本文引用的所有参考文献和出版物的公开内容均以其全文明确地以引用方式并入本文，就如同它们各自以引用方式并入本文一样。

序列表

<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG

HOFFMANN LA-ROCHE, INC.

VENTANNA MEDICAL SYSTEMS, INC.

ROCHE DIAGNOSTICS OPERATIONS, INC.

PROTHENA BIOSCIENCES LIMITED

ROCHE DIAGNOSTIS GMBH

<120> 帕金森氏病的确定

<130> 17-1472-WO

<150> US 62/716,504

<151> 2018-08-09

<160> 59

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

Ala Arg Leu Gly Ile Ala Thr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 17

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 18

Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 19

Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 20

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 21

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 22

Asn Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 23

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 24

Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr

1 5

<210> 25

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 26

Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 27

Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 28

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 29

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 30

Asn Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 31

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 32

Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr

1 5

<210> 33

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 33

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 34

Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 35

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 36

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 37

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Glu Asp His Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Ser Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 38

Asn Tyr Ala Met His

1 5

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 39

Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Asp

<210> 40

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 40

Glu Glu Asp His Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Ser Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 41

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 41

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr

85 90 95

Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 42

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 42

Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala His

1 5 10

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 43

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 44

Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr Glu Val

1 5 10

<210> 45

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe Glu Lys Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Glu Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 46

Lys Ala Trp Met Ser

1 5

<210> 47

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 47

Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala Pro

1 5 10 15

Val Glu Gly

<210> 48

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 48

Thr Ser Ala His

1

<210> 49

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe Glu Lys Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Glu Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 50

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 50

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr

85 90 95

Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 51

Asn Tyr Ala Met His

1 5

<210> 52

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 52

Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Asp

<210> 53

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 53

Glu Glu Asp His Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Ser Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 54

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 54

Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 55

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 56

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 57

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 59

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于人α-突触核蛋白的残基122-135

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> 丝氨酸残基被磷酸化

<400> 59

Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp

1 5 10